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方法論記事

官能化スピロ環複素環合成および細胞毒性アッセイ

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DOI:

10.3791/61950

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2021年2月9日

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1Department of Biology and Chemistry, Azusa Pacific University

この記事について

サマリー

ここでは、以前に合成したスピロ環式オキシムをテストするために、3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を使用するバイオアッセイについて説明します。

要約

スピロ環式複素環は、癌治療のための潜在的な薬物であることが最近文献で報告されている。これらの新しい直交環系の合成は困難である。これらの化合物を合成するための効率的な方法論が最近発表され、以前に報告された5つのステップではなく4つのステップで固相合成が説明されました。この短い合成の利点は、有毒な試薬の使用を排除することです。低負荷再生マイケル(REM)リンカーベースの樹脂は、高負荷バージョンではかさばるフェニルおよび芳香族側鎖を含む試薬の添加が妨げられるため、合成に重要であることがわかりました。比色3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを使用して、これらの新規スピロ環式分子のマイクロモル濃度の細胞毒性をin vitroで調べました。MTTは市販品として容易に入手でき、比較的高速で信頼性の高い結果を生成するため、このアッセイはこれらのスピロ環式複素環に最適です。直交環構造ならびにフルフリルアミン(類似の5員環モチーフを含む合成法の前駆体)を試験した。

概要

E3ユビキチン-リガーゼマウスダブルミニッツ2ホモログ(MDM2)とp53との相互作用の低分子阻害は、腫瘍細胞アポトーシスのp53媒介誘導を回復させることが知られている1,2,3。MDM2はp53経路の負の調節因子であり、癌細胞でしばしば過剰発現している4、5、6、7、8、9。最近の結晶学的および生化学的研究は、スピロ環状フレームワークを含む小分子がMDM2-p53相互作用を効果的に阻害できることが明らかになりました10。スピロサイクリックフレームワーク(図1、青の網掛け)は、この剛直交環系の誘導体化が新しい治療薬の発見につながったため、特権的なモチーフと考えられています。この興味深いアーキテクチャにアクセスすることは、従来の有機合成技術を使用する場合に課題をもたらします。生体系におけるスピロ環状分子の治療効果は研究されているが、これらの分子の合成は依然として煩雑なプロセスである。過酷な条件を使用した不要な副産物、および危険な遷移金属はしばしば問題になります。

医薬品開発におけるスピロサイクリックモチーフの潜在的な使用は、他の交換可能な官能基に加えてモチーフを有する分子のライブラリを生成するための固相合成を利用するプロトコルの開発につながった11,12。ステップ間の生成物と反応物の分離は、樹脂ビーズと固相フィルター容器に取り付けられたREMリンカーを利用するだけで実現できます。これにより、ステップが削減され、歩留まりが向上する可能性があります。この合成アプローチは、潜在的な薬剤候補の大規模な配列を生成する可能性があります。ただし、生物学的システムにおけるこれらの分子の有効性には、さらなる調査が必要です。

これらのスピロ環状化合物の細胞毒性を決定するために、MTTアッセイ13、14 を採用した。この方法は、細胞生存率を測定し、細胞傷害性を間接的に決定するために使用できます。異なる濃度の阻害剤を96ウェルプレートの培養細胞に添加し、紫色ホルマザン化合物に対するミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる黄色MTTの減少の程度を比色分析により生細胞の割合を測定しました(図2)。活性は、ほとんどの場合、IC50 値(未処理の対照と比較して細胞増殖が50%阻害される濃度)として報告されます。この論文では、MTTアッセイのプロトコルと、これらの新しいスピロ環式分子の予備的な結果について説明します。

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プロトコル

注:このプロトコルで使用されるいくつかの化学物質および生物学的試薬は、有毒で発がん性があります。使用する前に、関連する製品安全データシート(MSDS)を参照してください。実験を開始する前に、適切な個人用保護具(労働安全衛生局が承認した安全ゴーグル、適切な手袋、白衣、フルレングスのズボン、つま先の開いた靴)を使用してください。さらに、合成を行い、有毒な化学物質や試薬(ヒュームフード)を取り扱う際には、適切な安全対策を講じてください。

1. スピロ環式複素環6および7の固相合成

注:合成は以前に発表された研究11,12に基づいていました。更新されたプロトコルは、三環式複素環のテトラブチルアンモニウムフルオリド触媒開環が不要であり、したがってその除去が合成手順を短縮することを明らかにしている。

  1. REMリンカーへのフルフリルアミンのマイケル添加を実行します(持続時間:25分のセットアップ+ 24時間の反応時間)。
    1. 1 g(1当量[当量])のREM樹脂、20 mL(20当量)のジメチルホルムアミド(DMF)、および2.4 mLのフルフリルアミンを25 mLの固相反応容器に加えます。反応開始後24時間室温で反応容器を撹拌する。
      メモ: レジンが容器の底に収まらないように、十分に混合してください。
    2. 反応終了後、樹脂をDMF 1xで洗浄します。次に、ジクロロメタン(DCM)とメタノールを交互に4回洗浄します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させます。
  2. タンデムマイケル付加/1,3-双極子環化付加を実行します(持続時間:25分のセットアップ+ 48時間の反応時間)。
    1. 乾燥樹脂に、1.48 mL (5当量) のトリエチルアミン (TEA)、0.637 g (2当量) のニトロオレフィン、および 10 mL の乾燥トルエンを反応容器に加えます。
    2. 次に、1.085 mL(4当量)のトリメチルシリルクロリド(TMSCl)を、換気の良いドラフト内の反応容器に追加します。
      注意: この反応はHClガスを生成するため、ガスがヒュームフードの下で放出されるまで反応容器に蓋をしないでください。
    3. 反応容器にしっかりと蓋をし、室温で48時間撹拌する。
      注:樹脂と試薬を完全に混合してください。
    4. 5 mLのメタノールを使用して反応を停止します。
    5. 容器を排水して溶液を除去し、DCMとメタノールを交互に4回洗浄します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させます。
  3. 樹脂結合複素環の N-アルキル化を行い、第4級アミンを形成します(持続時間:10分のセットアップ+24時間の反応時間)。
    1. 反応容器内の乾燥樹脂に、DMF5mLとハロゲン化アルキル10当量を加え、室温で24時間撹拌する。
      注:試薬と樹脂を完全に混合してください。
    2. 反応終了後、樹脂をDMF 1xで洗浄します。次に、DCMとメタノールを交互に使用して4回洗浄します。洗浄後、反応容器内の樹脂を乾燥させる。
  4. ポリマー支持体からの切断のために第四級アミンのβ脱離を実行します(持続時間:15分のセットアップ+ 24時間の反応時間)。
    1. 反応容器内の乾燥樹脂に、3 mLのDCMと1.49 mL(5当量)のTEAを加えて、ポリマー支持体から複素環を切断します。
    2. 反応混合物を24時間攪拌して、樹脂と溶液を完全に混合します。DCMとメタノールを交互に4回洗浄します。すべての洗浄液から溶出物を収集し、回転蒸発によって濃縮します。
    3. メタノールで粉砕して、スピロ環状オキシムを精製します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させ、将来の実験で再利用します。

2. MTT 14を用いた細胞毒性アッセイ

  1. 希釈剤として滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、水中0.9%NaCl)を使用して、20 mLの5 mg/mL MTT溶液を調製します。ろ過し、-20°Cで保存します。 次に、ステップ2.1のMTT溶液の1:1希釈液を無血清細胞培養培地(DMEM)で調製します。
  2. ジメチルスルホキシド(DMSO)中の100 mM、10 mM、100 μM、10 μM、1 μM、1 μM、0.1 μM、および0.01 μMの試験化合物の1.5 mLマイクロ遠心チューブに各1 mLのストック溶液を調製します。-20°Cで保存してください。 1.5 mLチューブの無血清培地でストック濃度を1:1000に希釈することにより、試験化合物の作業溶液の用量あたり200 μLを調製します。
  3. 組織培養フード内で、COS-7細胞(アフリカミドリザル腎細胞、 セルコピテクス・エチオプス 腎臓)を完全培地[10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM]に播種し、マルチチャンネルピペッターを使用して、ウェルあたり4 ×10 3 細胞/200 μLの濃度で平底の組織培養処理96ウェルプレートに播種します。COS-7細胞が選ばれた理由は、(1)細胞毒性アッセイに一般的に使用される細胞であり、(2)これらはすでに施設内で利用可能であったためです。
  4. COS-7細胞を5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで24時間インキュベートします。
  5. ウェルから上清を吸引するには、真空ポンプに取り付けられたガラス製パスツールピペットを使用します。ステップ2.2で調製した作業溶液を使用して、試験化合物を3連で細胞に投与します(表1を参照)。ステップ2.4に記載されているように細胞をインキュベートします。
  6. ウェルから上清を吸引します。200 μLのMTT溶液を各ウェルに加えます。5%CO2 を含む雰囲気中で37°Cで4時間インキュベートします。
  7. 紫色のホルマザン結晶を乱すことなく、ウェルから上清を穏やかに吸引します。各ウェルに200 μLのDMSOを加えて、紫色のホルマザン結晶を溶解します。室温で15分間インキュベートします。
  8. 96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの590 nm14 または600 nmでの吸光度を測定します。細胞を含まないウェルをバックグラウンドとして使用し、吸光度値を平均します。各処理ウェルの吸光度値からバックグラウンド値の平均吸光度を差し引く。データを平均ゼロ線量値のパーセンテージとして正規化します(3つのゼロ線量値を平均します)。y軸にデータをプロットします:線形(%相対細胞生存率);X軸:ログ(濃度)。各系列を個別の曲線としてプロットします(たとえば、三重データには3つの曲線が必要です)

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結果

スピロ環式オキシム6および7は、改変されたプロトコルを用いて合成した(図1)。REMリンカー1bへのフルフリルアミンのマイケル付加により、ポリマー結合樹脂2を得た。反応の進行は、1722 cm-1でのα,β-不飽和エステルの消失を検出することにより、赤外(IR)分光法によってモニターされました(図3)。スピロ環結合樹脂4は、一過性中間体3を介して2から形成された。4のメタノール加水分解により,3-[(3E)-(2S,4R)-2-フェニル-3-ヒドロキシイミノ4-ヒドロキシメチル-ピロリジン-1-イル]-プロピオン酸メチルエステル7が生成し,アルキル化とそれに続くβ脱離により(3E)-(2S,4R)-4-ヒドロキシメチル-1-メチル-2-フェニル-3-ピロリジンオキシム6が得られた。スピロ環式オキシムの同一性は1Hおよび13C核磁気共鳴分光分析によって決定され、純度は...

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ディスカッション

スピロ環状化合物の合成は、本研究室が実施した先行研究に基づいていましたが、いくつかの変更が加えられています(図1)11,12。各反応工程の進行をIR分光法によりモニターした。REMリンカー1とフルフリルアミンのマイケル添加により、ポリマー結合2が得られました(IR 1722 cm-1→ 1731 cm-1)。前回の報告から、TMS基(IR 1214 cm-1)の検出によって確認されたように、2のISOCは三環式複素環化合物3を生成した。ISOCは生成物の必要な位置選択性および立体選択性を提供するため、これは合成の重要なステップです。TMS官能基の周波数の代わりに3500cm-1の水酸基伸長頻度が観察...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、ファカルティリサーチカウンシルからK.S.H.(アズサパシフィック大学研究助成金局-米国)への助成金によって資金提供されました。A.N.G.とJFMは、学術学部研究経験(SURE)フェローシップの受賞者です。S.K.M.とB.M.R.は、STEM研究フェローシップ助成金(米国アズサパシフィック大学科学研究センター)の受賞者です。バイオアッセイの指導をしてくれたマシュー・ベレズク博士とフィリップ・コックス博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CELLS
COS-7細胞(ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651ミドリザル腎臓細胞
CHEMICALS
1-ブロモオクタンSigma-Aldrich152951キルハライド
アリルブロミドSigma-Aldrich337528ハロゲン化アルキル
ベンジルSigma-AldrichB17905ハロゲン化アルキル-ハロゲン化
物 シスプラチンケイマン化学13119細胞毒性制御
ジクロロメタン (DCM)Sigma-Aldrich270997溶媒
ジメチルホルムアミド (DMF)Sigma-Aldrich227056溶媒
ジメチルスルホキシド (DMSO)Sigma-Aldrich276855溶媒
DMEM、高グルコース、L-グルタミン配合ジェネシー・サイエンティフィック25-500細胞培養培地
FBS(ウシ胎児血清)Sigma-AldrichF4135細胞培養培地
フルフリルアミンAcros Organics 119800050試薬 
ヨードメタンSigma-Aldrich289566ハロゲン化アルキル
メタノールSigma-Aldrich34860溶媒
MTT ((3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)EMD MilliporeCalbiochem 475989-1GM試薬
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Genesee Scientific25-507細胞培養培
地 REM 樹脂Nova Biochem8551010005ポリマー担体; 0.500 mmol/g ローディング
trans-&β;-ニトロスチレンSigma-AldrichN26806ニトロオレフィン試薬
トルエンSigma-Aldrich244511溶媒
トリエチルアミン (TEA)Sigma-AldrichT0886ベータ除去
メチルシリルクロリド (TMSCl)Sigma-Aldrich386529試薬;注意 - 揮発性が高い。HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL 固相反応容器ChemglassCG-1861-02フィルター付きガラス器具
96 ウェルプレートリーダーPromega (Turner Biosystems)9310-011
Instrument AVANCE III NMR SpectrometerBrukerN/AInstrument; 300 MHz;溶媒:CDCl3およびCD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZA機器
手首アクションシェーカーBurrell Scientific757950819機器
アフリカアルトリを作成

参考文献

  1. Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
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