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方法論記事

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

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DOI：

10.3791/61957

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2020年12月11日

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1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

この記事について

サマリー

網膜色素上皮細胞をH2O2で処理し、細胞の形態、生存率、密度、グルタチオン、UCP-2レベルを解析することにより、酸化ストレスモデルの開発と使用に関するプロトコルを提示します。これは、トランスポゾントランスフェクション細胞によって分泌されるタンパク質の抗酸化効果を調べて神経レチンの変性を治療するのに有用なモデルです。

要約

酸化ストレスは、加齢黄斑変性症(AMD)を含むいくつかの変性疾患において重要な役割を果たします。網膜色素上皮(RPE)合成神経保護因子の減少、例えば、色素上皮由来因子(PEDF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、RPE細胞の喪失、そして最終的には光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死につながる。我々は、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するトランスフェクションRPE細胞の遺伝子導入による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を緩和し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性があると仮定する。眠れる森の美しさトランスポゾンシステム(SB100X)を用いて、ヒトRPE細胞はPEDFおよびGM-CSF遺伝子にトランスフェクトされ、qPCR、ウェスタンブロット、ELISA、および免疫蛍光を用いた安定した遺伝子集積、長期遺伝子発現、タンパク質分泌を示した。トランスフェクトされたRPE細胞によって分泌されるPEDFおよびGM-CSFの機能性と効力を確認するために、培養中のRPE細胞に対するH2O2誘導酸化ストレスの低減を定量化するインビトロアッセイを開発しました。細胞保護は、細胞の形態、密度、グルタチオンの細胞内レベル、UCP2遺伝子発現、および細胞生存率を分析することによって評価した。いずれも、トランスフェクトされたRPE細胞は、非トランスフェクトされたPEDFおよびGM-CSFおよび未導入の細胞および未導入の細胞(市販または遺伝子組み換え細胞から精製された)で前処理された細胞は、非治療対照と比較して有意な抗酸化細胞保護を示した。本H2O2-modelは、AMDまたは類似の神経変性疾患を治療するのに有効であり得る因子の抗酸化効果を評価するための簡便かつ有効なアプローチである。

概要

ここで説明するモデルは、細胞内の酸化ストレスを低減するためのバイオ医薬品の効率を評価するのに有用なアプローチを提供する。このモデルを用いて、高レベルのO2に曝露される網膜色素上皮細胞に対するH2O2-媒介酸化ストレス、可視光、光受容体外皮膜の貪食作用、活性酸素種(ROS)1に対する保護効果を調べた。 2.彼らは血管の加齢黄斑変性症(aAMD)3、4、5、6、7、8の病因に大きく貢献していると考えられている。また、RPE合成神経保護因子、特に色素上皮由来因子(PEDF)、インスリン様成長因子(IIF)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)がRPE細胞の機能不全および喪失をもたらし、続いて光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死亡が減少している。.AMDは、代謝、機能、遺伝的、および環境因子4間の相互作用から生じる複雑な疾患である。aAMDの治療の欠如は、先進国9,10の60歳以上の患者における失明の主な原因である。PEDFおよびGM-CSFを過剰発現する遺伝子組み換えRPE細胞の遺伝子組み換え後移植による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を軽減し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性を秘めている11、12、13、14、15、16.細胞に遺伝子を送達するいくつかの方法論があるにもかかわらず、我々は、その安全性プロファイル、宿主細胞のゲノムへの遺伝子の統合、および以前に示したように非転写活性部位に提供された遺伝子を統合する傾向のために、PEDFおよびGM-CSF遺伝子をRPE細胞に送達する非ウイルス性多動性睡眠美容トランスポゾンシステムを選択した。 18,19.

細胞酸化ストレスは、過酸化水素(H2O2)、4-ヒドロノネナー(HNE)、テルブチルヒドロペルオキシド(tBH)、高酸素張力、可視光(全スペクトルまたはUV照射)20、21を含む、いくつかの酸化剤によってインビトロで培養された細胞において誘導され得る。高い酸素の緊張およびライトは他のシステムへの移動性を制限する特別な装置および条件を要求する。H2O2、HNE、およびtBHなどの薬剤は、分子および細胞変化と重なり合う酸化ストレスを誘発する。我々は、RPE細胞が感光体外セグメント食細胞化22中に活性酸素中間体としてRPE細胞によって産生され、生体23の眼組織に見られるため、PEDFおよびGM-CSFの抗酸化活性を試験するためにH2O2を選択した。グルタチオンの酸化は、目の中のH2O2の産生に部分的に関与する可能性があるため、我々は、H2O2誘導酸化ストレスおよび細胞21,22の再生能力に関連するGSH/グルタチオンのレベルを分析した。グルタチオンレベルの分析は、眼24における抗酸化保護機構に関与するため、特に関連性が高い。H2O2への曝露は、RPE細胞1、25、26、27、28、29、30、および加えて、酸化ストレスの「生理学的」な刺激源である、酸化ストレスの「生理学的」源であるRPE細胞の酸化ストレス感受性および抗酸化活性を調べるモデルとして頻繁に使用される。

神経保護因子の機能性と有効性を評価するために、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するように遺伝子組み換え細胞によって発現される成長因子の抗酸化効果を定量化する分析を可能にするインビトロモデルを開発した。ここでは、PEDFおよびGM-CSFの遺伝子にトランスフェクトされたRPE細胞は、細胞の形態、密度、生存率、グルタチオンの細胞内レベル、およびミトコンドリア非結合タンパク質2の発現によって証明されるように、非トランスフェクション対照細胞よりもH2O2の有害な影響に対してより耐性があることを示す(ROS1酸素種)。

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プロトコル

人間の目の収集と使用のための手順は、研究のための教育倫理委員会によって承認されました (no. 2016-01726).

1. 細胞の分離と培養条件

  1. ヒトARPE-19細胞株
    1. ダルベッコの修飾ワシのミディアム/栄養素混合物F-12ハム(DMEM/ハムのF-12)に10%のウシ胎児血清(FBS)、80 U/mLペニシリンを加えた培養5 x 105 ARPE-19細胞、 T75フラスコの加湿雰囲気で37°Cで80μg/mLレンサプレプトマイシン、2.5μg/mLアンホテリシンB(完全培地)を37°Cで、T75フラスコの5%CO2および95%の空気の空気(他の細胞密度については表1参照)
    2. 週に 3 回、メディアを変更します。
    3. 細胞が約90%合流(定性評価)に成長したら、培地を吸引し、滅菌1x PBSで細胞を洗浄する。


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結果

ヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導
ARPE-19および一次hRPE細胞を24時間H2O2の様々な濃度で処理し、抗酸化グルタチオンの細胞内レベルを定量化した(図2A、B)。H2O2は50μMおよび100μMでグルタチオンの産生に影響を与えなかったのに対し、350μMではARPE-19および一次hRPE細胞においてグルタチオンが有意に減少した。細胞毒性の分析は、350μMが細胞生存率の有意な低下を引き起こすH2O2の最低濃度であることを示した(図2C)。形態学的には、H2O2で処理されたARPE-19細胞は、より広がり、より丸みを帯びて見えない、H2O2濃度の増加に伴ってより明...

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ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、トランスフェクトされた細胞によって産生されるPEDFおよびGM-CSFの抗酸化および保護機能を分析するアプローチを提供し、これは任意の推定有益な遺伝子をトランスフェクトした細胞に適用することができる。遺伝子組換え細胞を移植してタンパク質を組織に送達することを目的とする遺伝子治療戦略では、タンパク質発現のレベル、発現の長さ、および発現タンパク質の有効性に関する情報を得ることが重要です。我々の研究室では、ここで提示されるプロトコルは、aAMD6,7の病因において重要な要素として仮説されている酸化ストレスに対するPEDFおよびGM-CSFの有効性を定義するのに有用であった。具体的には、このプロトコルを用い、SB100X-媒介PEDF/GM-CSFトランスフェクトされた原発hRPE細胞の抗酸化効果を定義しました。いくつかの研究者は、H2O2が酸化ストレスの重大な症状を誘発するが、24時間の350 μMがヒトARPE-19および一次RPE細胞...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、グレッグ・シーリーとアラン・コンティに優れた技術支援と、ベルリンのマックス・デルブリュック・センターのツズザンナ・イズスヴァーク教授に感謝したいと考えています。この研究は、第7枠組みプログラムの文脈でスイス国立科学財団と欧州委員会によって支援されました。Z.Iは欧州研究評議会、ERCアドバンス[ERC-2011-ADG 294742]によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェルプレートCorning353047
6ウェルプレートGreiner 7657160
96ウェル培養プレート ホワイト、透明で平底 Costar3610発光を測定する前に細胞をチェックできます(GSH-Glo Assay)
96ウェルプレートCorning 
アクリルアミド40%Biorad161-0144
アムホテリシンBAMIMED4-05F00-H
抗体抗GMCSFサーモフィッシャーサイエンティフィックPA5-24184
抗体抗マウスIgG/IgA/IgM AgilentP0260
抗体抗PEDF Santa Cruz Biotechnology Incsc-390172
抗体抗ペンタ-His Qiagen34660
抗体抗リン酸化Akt細胞シグナル伝達技術9271
抗体抗ウサギIgG H&L-HRPAbcamab6721
抗体ロバ抗ウサギAlexa Fluor 594 サーモフィッシャーサイエンティフィック A11034
抗体ヤギ抗マウス Alexa 488ThermoFisher ScientificA-11029
ARPE-19 細胞株ATCCCRL-2302
BSA Sigma-AldrichA9418-500G
チャンバー培養ガラススライドCorning354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay プロメガG9291
DAPIシグマ - アルドリッチD9542-5MG
DMEM/ハムのF12 Sigma-AldrichD8062
デュオセット ELISAキットR&Dシステムズ DY215-05
EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィック78440
ELISAquant キットBioProducts MDPED613-10-Human
Eyes (human)Lions Gift of Sight Eye Bank (ミネソタ州セントポール)
FBS BrunschwigP40-37500
フルオロマウント 水性マウント ミディアムSigma-AldrichF4680-25ML
FLUOstar Omega プレートリーダー BMG Labtech
GraphPad Prismソフトウェア(バージョン8.0)GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione AssayPromegaV6912
hydrogen peroxide (H2O2)Merck107209
ImageJ software (image processing program)W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
イミダゾール AxonlabA1378.0010
ライカDMI4000B顕微鏡 ライカ マイクロシステムズ
LightCycler 480 インストゥルメント II Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 softwareRoche Molecular Systems
NaClSigma-Aldrich71376-1000
NaH2PO4Axonlab3468.1000
ネオントランスフェクションシステム ThermoFisher ScientificのMPK5000
ネオントランスフェクションシステム 10 µLキットサーモフィッシャー サイエンティフィックMPK1096
ノイバウアーチャンバーマリエンフェルト・スーペリア640010
Ni-NTA スーパーフロー キアゲン30410
ニトロセルロース VWR732-3197
Omega Lum G Gel Imaging SystemAplegen Life Science
PBS 1XSigma-AldrichD8537
ペニシリン/ストレプトマイシンSigma-AldrichP0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuantabio95072-012
PFA Sigma-Aldrich158127-100G
Pierce BCA Protein Assay キット サーモフィッシャーサイエンティフィック23227
プライマー インビトロジェン 補足資料
pSB100X(250 ng/µL)MátéSら、2009年。Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His プラスミド DNA (250 ng/µL)Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796 で報告された既存の pT2-CMV-PEDF-EGFP プラスミドを使用して構築。
pT2-CMV-PEDF-HisプラスミドDNA(250 ng/µL)Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796 で報告された既存の pT2-CMV-PEDF-EGFP プラスミドを使用して構築。
QIAamp DNA ミニキットQIAGEN51304
組換え hGM-CSF Peprotech100-11
組換え hPEDF  BioProductsMD004-096
ReliaPrep RNA細胞 Miniprep SystemPromegaZ6011
RIPAバッファーThermoFisher Scientific89901
RNaseフリーDNaseセットQIAGEN79254
RNeasyミニキットQIAGEN74204
SDSApplichemA2572
セミドライトランスファーWB用システム Bio-Rad
SuperMix qScriptQuantabio95048-025
トリスバッファー生理食塩水 (TBS) サーモフィッシャーサイエンティフィサイエン
Triton X-100AppliChemA4975
トリプシン/EDTASigma-AldrichT4174
TweenAppliChem A1390
尿素サーモフィッシャーサイエンティフィック29700
WesternBright ECL HRP 基質AdvanstaK-12045-D50
Whatman ニトロセルロース 膜Chemie BrunschwigMNSC04530301
353072ック ティフィック 15504020

参考文献

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