網膜色素上皮細胞をH2O2で処理し、細胞の形態、生存率、密度、グルタチオン、UCP-2レベルを解析することにより、酸化ストレスモデルの開発と使用に関するプロトコルを提示します。これは、トランスポゾントランスフェクション細胞によって分泌されるタンパク質の抗酸化効果を調べて神経レチンの変性を治療するのに有用なモデルです。
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この記事について
サマリー
要約
酸化ストレスは、加齢黄斑変性症(AMD)を含むいくつかの変性疾患において重要な役割を果たします。網膜色素上皮(RPE)合成神経保護因子の減少、例えば、色素上皮由来因子(PEDF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、RPE細胞の喪失、そして最終的には光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死につながる。我々は、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するトランスフェクションRPE細胞の遺伝子導入による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を緩和し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性があると仮定する。眠れる森の美しさトランスポゾンシステム(SB100X)を用いて、ヒトRPE細胞はPEDFおよびGM-CSF遺伝子にトランスフェクトされ、qPCR、ウェスタンブロット、ELISA、および免疫蛍光を用いた安定した遺伝子集積、長期遺伝子発現、タンパク質分泌を示した。トランスフェクトされたRPE細胞によって分泌されるPEDFおよびGM-CSFの機能性と効力を確認するために、培養中のRPE細胞に対するH2O2誘導酸化ストレスの低減を定量化するインビトロアッセイを開発しました。細胞保護は、細胞の形態、密度、グルタチオンの細胞内レベル、UCP2遺伝子発現、および細胞生存率を分析することによって評価した。いずれも、トランスフェクトされたRPE細胞は、非トランスフェクトされたPEDFおよびGM-CSFおよび未導入の細胞および未導入の細胞(市販または遺伝子組み換え細胞から精製された)で前処理された細胞は、非治療対照と比較して有意な抗酸化細胞保護を示した。本H2O2-modelは、AMDまたは類似の神経変性疾患を治療するのに有効であり得る因子の抗酸化効果を評価するための簡便かつ有効なアプローチである。
概要
ここで説明するモデルは、細胞内の酸化ストレスを低減するためのバイオ医薬品の効率を評価するのに有用なアプローチを提供する。このモデルを用いて、高レベルのO2に曝露される網膜色素上皮細胞に対するH2O2-媒介酸化ストレス、可視光、光受容体外皮膜の貪食作用、活性酸素種(ROS)1に対する保護効果を調べた。 2.彼らは血管の加齢黄斑変性症(aAMD)3、4、5、6、7、8の病因に大きく貢献していると考えられている。また、RPE合成神経保護因子、特に色素上皮由来因子(PEDF)、インスリン様成長因子(IIF)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)がRPE細胞の機能不全および喪失をもたらし、続いて光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死亡が減少している
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プロトコル
人間の目の収集と使用のための手順は、研究のための教育倫理委員会によって承認されました (no. 2016-01726).
1. 細胞の分離と培養条件
- ヒトARPE-19細胞株
- ダルベッコの修飾ワシのミディアム/栄養素混合物F-12ハム(DMEM/ハムのF-12)に10%のウシ胎児血清(FBS)、80 U/mLペニシリンを加えた培養5 x 105 ARPE-19細胞、 T75フラスコの加湿雰囲気で37°Cで80μg/mLレンサプレプトマイシン、2.5μg/mLアンホテリシンB(完全培地)を37°Cで、T75フラスコの5%CO2および95%の空気の空気(他の細胞密度については表1参照)
- 週に 3 回、メディアを変更します。
- 細胞が約90%合流(定性評価)に成長したら、培地を吸引し、滅菌1x PBSで細胞を洗浄する。
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結果
ヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導
ARPE-19および一次hRPE細胞を24時間H2O2の様々な濃度で処理し、抗酸化グルタチオンの細胞内レベルを定量化した(図2A、B)。H2O2は50μMおよび100μMでグルタチオンの産生に影響を与えなかったのに対し、350μMではARPE-19および一次hRPE細胞においてグルタチオンが有意に減少した。細胞毒性の分析は、350μMが細胞生存率の有意な低下を引き起こすH2O2の最低濃度であることを示した(図2C)。形態学的には、H2O2で処理されたARPE-19細胞は、より広がり、より丸みを帯びて見えない、H2O2濃度の増加に伴ってより明.......
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ディスカッション
ここで紹介するプロトコルは、トランスフェクトされた細胞によって産生されるPEDFおよびGM-CSFの抗酸化および保護機能を分析するアプローチを提供し、これは任意の推定有益な遺伝子をトランスフェクトした細胞に適用することができる。遺伝子組換え細胞を移植してタンパク質を組織に送達することを目的とする遺伝子治療戦略では、タンパク質発現のレベル、発現の長さ、および発現タンパク質の有効性に関する情報を得ることが重要です。我々の研究室では、ここで提示されるプロトコルは、aAMD6,7の病因において重要な要素として仮説されている酸化ストレスに対するPEDFおよびGM-CSFの有効性を定義するのに有用であった。具体的には、このプロトコルを用い、SB100X-媒介PEDF/GM-CSFトランスフェクトされた原発hRPE細胞の抗酸化効果を定義しました。いくつかの研究者は、H2O2が酸化ストレスの重大な症状を誘発するが、24時間の350 μMがヒトARPE-19および一次RPE細胞.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者らは、グレッグ・シーリーとアラン・コンティに優れた技術支援と、ベルリンのマックス・デルブリュック・センターのツズザンナ・イズスヴァーク教授に感謝したいと考えています。この研究は、第7枠組みプログラムの文脈でスイス国立科学財団と欧州委員会によって支援されました。Z.Iは欧州研究評議会、ERCアドバンス[ERC-2011-ADG 294742]によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24ウェルプレート | Corning | 353047 | |
| 6ウェルプレート | Greiner 7657160 | ||
| 96ウェル培養プレート ホワイト、透明で平底 | Costar | 3610 | 発光を測定する前に細胞をチェックできます(GSH-Glo Assay) |
| 96ウェルプレート | Corning | ||
| アクリルアミド40% | Biorad | 161-0144 | |
| アムホテリシンB | AMIMED | 4-05F00-H | |
| 抗体抗GMCSF | サーモフィッシャーサイエンティフィック | PA5-24184 | |
| 抗体抗マウスIgG/IgA/IgM | Agilent | P0260 | |
| 抗体抗PEDF | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-390172 | |
| 抗体抗ペンタ-His | Qiagen | 34660 | |
| 抗体抗リン酸化Akt | 細胞シグナル伝達技術 | 9271 | |
| 抗体抗ウサギIgG H&L-HRP | Abcam | ab6721 | |
| 抗体ロバ抗ウサギAlexa Fluor 594 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A11034 | |
| 抗体ヤギ抗マウス Alexa 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | |
| ARPE-19 細胞株 | ATCC | CRL-2302 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
| チャンバー培養ガラススライド | Corning | 354118 | |
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | プロメガ | G9291 | |
| DAPI | シグマ - アルドリッチ | D9542-5MG | |
| DMEM/ハムのF12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| デュオセット ELISAキット | R&Dシステムズ | DY215-05 | |
| EDTA | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 78440 | |
| ELISAquant キット | BioProducts MD | PED613-10-Human | |
| Eyes (human) | Lions Gift of Sight Eye Bank (ミネソタ州セントポール) | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| フルオロマウント 水性マウント ミディアム | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| FLUOstar Omega プレートリーダー | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prismソフトウェア(バージョン8.0) | GraphPad Software, Inc. | ||
| GSH-Glo Glutathione Assay | Promega | V6912 | |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Merck | 107209 | |
| ImageJ software (image processing program) | W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014 | ||
| イミダゾール | Axonlab | A1378.0010 | |
| ライカDMI4000B顕微鏡 | ライカ マイクロシステムズ | ||
| LightCycler 480 インストゥルメント II | Roche Molecular Systems | ||
| LightCycler 480 SW1.5.1 software | Roche Molecular Systems | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
| NaH2PO4 | Axonlab | 3468.1000 | |
| ネオントランスフェクションシステム | ThermoFisher Scientific | のMPK5000 | |
| ネオントランスフェクションシステム 10 µLキット | サーモフィッシャー サイエンティフィック | MPK1096 | |
| ノイバウアーチャンバー | マリエンフェルト・スーペリア | 640010 | |
| Ni-NTA スーパーフロー | キアゲン | 30410 | |
| ニトロセルロース | VWR | 732-3197 | |
| Omega Lum G Gel Imaging System | Aplegen Life Science | ||
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
| Pierce BCA Protein Assay キット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 23227 | |
| プライマー | インビトロジェン | 補足資料 | |
| pSB100X(250 ng/µL) | MátéSら、2009年。Prof. Zsuzsanna Izsvak | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His プラスミド DNA (250 ng/µL) | Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796 で報告された既存の pT2-CMV-PEDF-EGFP プラスミドを使用して構築。 | ||
| pT2-CMV-PEDF-HisプラスミドDNA(250 ng/µL) | Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796 で報告された既存の pT2-CMV-PEDF-EGFP プラスミドを使用して構築。 | ||
| QIAamp DNA ミニキット | QIAGEN | 51304 | |
| 組換え hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
| 組換え hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
| ReliaPrep RNA細胞 Miniprep System | Promega | Z6011 | |
| RIPAバッファー | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
| RNaseフリーDNaseセット | QIAGEN | 79254 | |
| RNeasyミニキット | QIAGEN | 74204 | |
| SDS | Applichem | A2572 | |
| セミドライトランスファーWB用システム | Bio-Rad | ||
| SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
| トリスバッファー生理食塩水 (TBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | サイエン | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| トリプシン/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Tween | AppliChem | A1390 | |
| 尿素 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 29700 | |
| WesternBright ECL HRP 基質 | Advansta | K-12045-D50 | |
| Whatman ニトロセルロース 膜 | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |
参考文献
- Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
- Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P.
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再版と許可
