ここでは、ゼブラフィッシュ後部体軸の3次元組織培養に関するプロトコルを提示し、脊椎動物のセグメンテーションの実生研究を可能にする。この外植モデルは、軸伸長、モルフォゲン源の変化、および細胞内分解能組織レベルのライブイメージングを制御します。
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この記事について
サマリー
要約
脊椎動物の胚は、脊椎、筋肉、および皮膚の前駆体である反復性スマイトとして主体軸をパターン化する。節内皮(PSM)から徐々に胚の尾端が後方に伸びる。スミテは、周期性とサイズの尺度を持つ形をする。ゼブラフィッシュは、遺伝的に難解であり、生きたイメージングを可能にする透明な胚を有するため、人気のあるモデル生物です。それにもかかわらず、ソミト生成の間に、魚の胚は大きな丸い黄身に包まれる。この幾何学は、特に近い目的の作業距離を必要とするより高い解像度で、ゼブラフィッシュ胚におけるPSM組織の生画像を制限する。ここでは、ゼブラフィッシュの尾葉の生画像化のための平坦化された3次元組織培養法を提示する。尾部外植は、軸伸びの比例減速とロストロコーダルスマイト長さの短縮を表示することによって、無傷の胚を模倣する。さらに、外植培養を通じて軸伸び速度を失速させることができる。これにより、信号勾配の化学入力を軸伸長の機械化入力から解き放つ。今後の研究では、この方法をマイクロ流体セットアップと組み合わせて、薬物侵入の懸念なしに、時間制御された医薬品摂動または脊椎動物セグメンテーションのスクリーニングを可能にすることができる。
概要
生物のメタメリックセグメンテーションは、自然界で広く使用されています。反復構造は、椎骨、筋肉、神経、血管、手足、またはボディプラン1の葉のような側面器官の機能性に不可欠である。このような軸対称性の生理学的および幾何学的制約の結果として、アネリド、節足動物、およびそれらの胚組織(例えば、外胚、メソダーム)の後方のセグメンテーションのようなビラテリアの大部分のフィラテリアの系統。
脊椎動物胚は、主体軸に沿ってパラキシャル中胚を、種固有の間隔、カウント、およびサイズ分布を持つスマイトに順番にセグメント化します。種内の個々の胚の間でこのような堅牢性にもかかわらず、脊椎動物種の間ではスマイトセグメンテーションが汎用性が高い。セグメンテーションは、時間間隔の広大な管理(ゼブラフィッシュの25分からヒトでは5時間まで)、サイズ(ゼブラフィッシュの尾節からマウスの幹スマイトで〜200μmまで)およびカウント(ゼブラフィッシュの32からトウモロコシヘビの〜300まで)2で起こる。さらに興味深いことに、魚の胚は、セグメンテーション間隔と軸伸び速度の両方を補うことによって、適切なサイズの分布でスマイトをそのまま維持しながら、幅広い温度(ゼブラフィッシュでは約20.5°Cから34°Cまで)で発達することができます。このような興味深い特徴を超えて、ゼブラフィッシュは、兄弟胚の豊かさの外部、同期的、透明な発達....
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プロトコル
このプロトコルは、1日より若い脊椎動物胚の使用を含む受精後1日未満。すべての動物実験はシンシナティ小児病院医療センターの倫理ガイドラインの下で行われました。動物の議定書は、制度的動物の世話と使用委員会によって見直され、承認された(プロトコル#2017-0048)。
1. 胚コレクション
- 胚採取の日の前夜に交差タンクにゼブラフィッシュのペアを設定します。胚の発達を正確にステージング制御するには、交配ペア間の障壁を使用します。
- 好ましい産卵時間の前に障壁を上げ、100 mmペトリ皿で15分以内に卵を集めます。
- ペトリ皿からきれいな破片。1つのクラッチから50個以上の胚が集められた場合は、それに応じてクラッチを複数のペトリ皿に分割します。
- 28°Cの魚系水中の胚を、50%エピボリー段階(受精後5時間)に達するまでインキュベートする。E3のような標準化された胚成長培地は、ステップ3.2まで水槽系の水の代わりに使用することもできる。
- ステレオスコープの下で未受精卵を取り除き、胚を一晩23.5°Cのインキュベーターに移動させます(O/N)。胚は、コレクションの日の翌朝に8-10スマイトステージでなければなりません。
2. 工具の準備
- マイクロサージャスナイフブ....
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結果
このプロトコルは生きているゼブラフィッシュ尾の外植の平らな幾何学的培養を可能にする。組織培養は、全胚に対して3つの大きな利点を提示する:1)軸伸長速度の制御、2)単純解剖による様々なシグナル伝達(モルフォゲン)源の制御、および3)ほぼ客観的で高い拡大および高NAライブイメージング。
化学的に未処理のスライドチャンバーは、尾部外植が下の組織の周りに包む皮膚外皮によってその主軸(図2A)を伸長することを可能にする。化学活性スライドチャンバー(I型コラーゲン付き)の外植物を培養すると、皮膚外皮が伸びてスライドチャンバーに付着し、外植の軸伸びが止まりました。それにもかかわらず、スマイトはセグメント化を続けました(図2B、補助映画S1およびS2)。プロトコルに記載されているように、軸伸長は、取り付けプロセス中に物理的な圧力を加えたり、より浅いスライドチャンバに外植を取り付けることによって直接停止することもできる。このような身体拘束の下での軸.......
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ディスカッション
この記事では、ゼブラフィッシュ胚のために最近開発し、使用した組織培養外植技術の詳細なプロトコルを提示します。私たちの技術は、ひよこ8とゼブラフィッシュ9、10、11モデル生物の以前の外植方法に基づいています。このプロトコルで調製された尾の外植は、単純なスライドチャンバーで>12hまで生き残ることができ、その主要な体の軸とセグメントスマイトを、ソミト形成の終わりまで伸び続ける。
外植組織を健康に保ち、長期間正常に伸びるように注意する必要があります。まず、組織外植は、後部組織の無傷性を損なうことなく解剖されるべきである。我々は、皮膚細胞が後尾芽に侵入する神経中胚葉前駆細胞のパウチを提供していることを観察した。外植の皮膚がこれらの非常に可動性細胞を剥がれた場合は、尾芽組織を離れ、組織の限界を超えてカバースリッ.......
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開示事項
著者らは利益相反を開示し、宣言するものは何もない。
謝辞
私たちは、魚のメンテナンスのためのAECOMゼブラフィッシュコア施設とシンシナティ子供獣医サービス、技術的支援のためのシンシナティ子供イメージングコア、ビデオ制作の支援のためのディダルサパロフと原稿を編集するためのハンナシーウォールに感謝します。この出版物で報告された研究は、E.M.Öに賞番号R35GM140805の下で国立衛生研究所の国立一般医学研究所によってサポートされました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mL Sub-Q シリンジ (PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co.) | REF 309597 | 胚の解体および操作用 |
| 200プルーフエタノール、免疫 | 染色用 | デコンラボ | 2701 |
| 抗生物質抗真菌薬溶液 (100回;) | 組織解剖培地用 | Sigma-Aldrich | A5955 |
| 塩化カルシウム無水物、粉末 | 組織解剖培地用 | Sigma-Aldrich | 499609 |
| ジメチルスルホキシド | 染色用 | Sigma-Aldrich | D5879 |
| ディスポーザブルメス、#10 ステンレススチール | インテグラ-ミルテック | MIL4-411 | テープスライドウェル調製用 |
| エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (トリカイン) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (オプション) 20 体節より古い組織の麻酔用 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | サーモフィッシャー | A3160601 | 組織培養培地に追加 |
| ヤギ 抗マウス IgG2b、Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145;RRID: | 免疫染色用AB_2535781二次抗体 |
| L-15培地 L-グルタミン w/o フェノールレッド | 解剖培地用 | GIBCO | 21083-027 |
| メタノール | 免疫染色用 | シグマ・アルドリッチ | 179337 |
| マイクロサージカル 角膜ナイフ 2.85 mm 角度付きチップ ダブルベベルブレード | 組織解剖用 | 外科専門 | 72-2863 |
| マウスモノクローナル反ppERK | シグマアルドリッチ | 猫#M8159;RRID: | ppERK免疫染色用AB_477245 |
| NucRed Live 647 ReadyProbes 細胞 | 核の生染色用 | Invitrogen | R37106 |
| パラホルムアルデヒド粉末、95% | Sigma-Aldrich | 免疫 | 染色用サンプル固定 |
| ラットテールコラーゲンコーティング液 | Sigma-Aldrich | 122-20 | (オプション) 化学活性化スライドチャンバー用 |
| ステージトップインキュベーター | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (オプション) ライブイメージング時の温度制御用 |
| 透明テープ 3/4インチ | スコッチ | S-9782 | テープスライドウェル調製用 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 免疫染色用 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| ゼブラフィッシュ用:Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| ゼブラフィッシュ: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
参考文献
- Assheton, R. Growth in length: Embryological Essays. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M.
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