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方法論記事

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

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DOI:

10.3791/61987

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2021年2月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

この記事について

サマリー

私たちは、 眠れる森の美女 (SB)トランスポゾンシステムを用いて色素上皮由来因子(PEDF)をコードする遺伝子をエレクトロポレーションすることにより、初代ヒト色素上皮細胞をトランスフェクトするプロトコルを開発しました。トランスフェクションの成功は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、イムノブロッティング、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって実証されました。

要約

高齢化が進む社会では、神経変性疾患の発生率も高まっています。これまでのところ、病理学的メカニズムは十分に理解されていないため、定義された治療法の確立を妨げています。保護因子の発現を増加させるための細胞ベースの相加遺伝子治療は、加齢黄斑変性症(AMD)などの神経変性疾患を治療するための有望な選択肢と考えられています。眠れる森の 美女 (SB)トランスポゾンシステムを用いて、神経系の神経保護・抗血管新生タンパク質として特徴付けられる色素上皮由来因子(PEDF)をコードする遺伝子を初代ヒト色素上皮(PE)細胞のゲノムに安定的に発現させる方法を開発しました。初代PE細胞をヒトドナーの眼から単離し、培養中に維持した。コンフルエントに達した後、1 x 104 細胞を11 μLの再懸濁バッファーに懸濁し、30 ngの高活性 SB (SB100X)トランスポザーゼプラスミドと470 ngの PEDF トランスポゾンプラスミドを含む2 μLの精製溶液と組み合わせました。遺伝子組み換えは、以下のパラメータを用いて毛細管エレクトロポレーションシステムで行った:電圧1,100Vおよび幅20msの2つのパルス。トランスフェクトした細胞を、ウシ胎児血清を添加した培地を含む培養プレートに移した。抗生物質および抗真菌剤を最初の培地交換で添加した。トランスフェクションの成功は、独立して実施された実験で実証されました。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、 PEDF 導入遺伝子の発現の増加を示した。PEDF分泌は、イムノブロッティングによって評価され、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定量されるように、有意に上昇し、安定したままであった。 SB100Xを介した導入は、PE細胞のゲノムへの安定したPEDF遺伝子組み込みを可能にし、AMDまたは他の網膜変性疾患を治療するための細胞ベースの遺伝子付加療法の開発に不可欠な PEDF の継続的な分泌を保証しました。さらに、 ヒトPE細胞へのPEDF トランスポゾンの組み込みプロファイルの分析は、ほぼランダムなゲノム分布を示しました。

概要

高齢は神経変性疾患の主なリスクであると説明されています。加齢黄斑変性症(AMD)は、60歳以上の患者に重篤な視力喪失をもたらす多遺伝子性疾患であり、失明と視力障害の4つの最も一般的な原因に属し1 、2040年には2億8,800万人に増加すると予想されています2。絨毛毛細血管と網膜光受容体の間に位置する密集した細胞の単層である網膜色素上皮(RPE)の機能不全は、AMDの病因の一因となります。RPEは、正常な網膜機能に不可欠な複数のタスクを実行し3、 網膜と絨毛毛細血管の構造的完全性を維持するために不可欠なさまざまな成長因子と因子を分泌し、それによって視細胞の生存をサポートし、循環と栄養素の供給の基礎を提供します。

健康な眼では、色素上皮由来因子(PEDF)は血管内皮成長因子(VEGF)の効果のバランスを取り、アポトーシスからニューロンを保護し、内皮細胞の増殖を防ぎ、毛細血管内皮を安定化させます。VEGFとPEDFの比率の変化は、動物モデル4,5、およびAMDおよび増殖性糖尿病網膜症による脈絡膜新生血管(CNV)患者のサンプルで観察された眼の新生血管に関連しています6,7,8,9,10 .強化されたVEGF濃度は、現在の標準治療の目標です。抗VEGF医薬品であるベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、そして最近ではブロルシズマブは、CNV患者の約3分の1の視力を改善するか、むしろ症例の90%で視力を安定させます11、12、13。しかし、頻繁に、しばしば毎月の硝子体内注射は、有害事象のリスクを負い14、患者のコンプライアンスを損ない、医療システム15にとって重大な経済的負担を表しています。さらに、一定の割合の患者(2%〜20%)は、抗VEGF療法に反応しないか、または反応が不十分である16,17,18,19。これらの負の付随物は、代替治療、例えば、眼内インプラント、細胞および/または遺伝子治療アプローチの開発を必要とする。

遺伝子治療は、遺伝性疾患および非遺伝性疾患の有望な治療法として進化しており、機能しない遺伝子配列を回復したり、機能不全の遺伝子配列を抑制したりすることを目的としています。原因因子の特定と置換がほとんど不可能な多遺伝子性疾患の場合、戦略は保護因子の継続的な送達を目指しています。AMDの場合、エンドスタチンおよびアンジオスタチン20の安定発現、VEGFアンタゴニスト可溶性FMS様チロシンキナーゼ-1(sFLT-1)21,22、分化の補体調節タンパク質クラスター59(CD59)23またはPEDF 24,25など、様々な相加療法が開発されている。.眼、特に網膜は、密閉された構造、優れたアクセス可能性、小型、および免疫特権により、遺伝子ベースの薬物療法の優れた標的であり、したがって、低治療用量の局所的な送達を可能にし、移植片を拒絶反応の影響を受けにくくします。さらに、眼は非侵襲的なモニタリングを可能にし、網膜は異なるイメージング技術によって検査することができる。

ウイルスベクターは、その高い形質導入効率のために、治療遺伝子を標的細胞に送達するための主要な媒体である。しかしながら、使用されるウイルスベクターに応じて、免疫および炎症反応26、変異原性および発癌性効果27、28、または他の組織における播種29などの異なる有害反応が記載されている。実用的な制限には、制限されたパッケージサイズ30、および臨床グレードロット31,32の製造に関連する困難とコストが含まれます。これらの欠点は、リポ/ポリプレックス、超音波またはエレクトロポレーションを介して転送される非ウイルス性のプラスミドベースのベクターのさらなる開発を促進した。しかしながら、宿主ゲノムへの導入遺伝子のゲノム組み込みは、通常、プラスミドベクターでは促進されず、したがって一過性の発現をもたらす。

トランスポゾンは、ゲノム内での位置を変える天然に存在するDNA断片であり、遺伝子治療に採用されている特性です。能動統合機構により、トランスポゾンベースのベクターシステムは、挿入された導入遺伝子の連続的かつ一定の発現を可能にする。眠れる森の美女(SB)トランスポゾンは、魚33に見られる古代のTc1 /マリナー型トランスポゾンから再構成され、分子進化によってさらに改良され、活性亢進変異体SB100X34をもたらし、さまざまな初代細胞での効率的な転位を可能にし、さまざまな疾患モデル35の表現型補正に使用されました。現在、SBトランスポゾンシステムを用いて13件の臨床試験が開始されています。SB100Xトランスポゾンシステムは、末端反転リピート(TIR)に挟まれた目的の遺伝子からなるトランスポゾンと、トランスポゾンを動員するトランスポザースの2つのコンポーネントで構成されています。細胞へのプラスミドDNA送達に続いて、トランスポザーゼはTIRに結合し、トランスポゾンの切除および細胞のゲノムへの組み込みを触媒します。

私たちは、血管新生AMDの治療のための非ウイルス細胞ベースの相加療法を開発しました。このアプローチは、SB100Xトランスポゾンシステム36,37,38による初代色素上皮(PE)細胞へのPEDF遺伝子のエレクトロポレーションベースの挿入を含む。トランスポザーゼとPEDFの遺伝情報は別々のプラスミドで提供されるため、理想的なSB100X-PEDFトランスポゾン比の調整が可能になります。エレクトロポレーションは、ピペットベースのキャピラリートランスフェクションシステムを使用して行われ、電極間のギャップサイズを最大化し、表面積を最小限に抑えます。この装置は、広範囲の哺乳動物細胞において優れたトランスフェクション速度を達成することが示された39、40、41。小さな電極表面積は、均一な電界を提供し、電気分解42の様々な副作用を低減する。

トランスフェクトされた色素上皮細胞によって分泌されるPEDFの抗血管新生機能は、ヒト臍帯静脈内皮細胞の発芽、遊走、およびアポトーシスを分析する様々なin vitro実験で示された43。さらに、角膜新生血管のウサギモデル44およびCNV43,45,46のラットモデルにおけるPEDFトランスフェクト細胞の移植は、新生血管形成の低下を示した。

ここでは、キャピラリートランスフェクションシステムを用いたSB100Xトランスポゾンシステムを介して初代ヒトRPE細胞にPEDF遺伝子を安定的に挿入するための詳細なプロトコルについて説明します。トランスフェクトした細胞を21日間培養し、その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によるPEDF遺伝子発現、およびイムノブロッティングおよび酵素結合免疫吸着アッセイによるPEDFタンパク質分泌の観点から分析しました(ELISA、図1)。

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プロトコル

ヒトドナーの目は、ヘルシンキ宣言プロトコルに従ってインフォームドコンセントを取得した後、眼科のアーヘン角膜バンク(アーヘン大学病院)から取得されました。ヒトサンプルの収集と使用の手順は、機関倫理委員会によって承認されています。

1. 初代ヒトRPE細胞の単離

  1. 滅菌防護服と手袋をレイアウトします。層流の下に滅菌ドレープを置きます。
  2. 滅菌調製器具およびその他の必要な滅菌機器を層流の下に置きます。
  3. アイグローブの受け取り、準備の開始、および起こりうる異常を記録します。ドナーの年齢、性別、死因、死亡から除眼までの期間を登録します。
  4. アイグローブを滅菌ガーゼ湿布に入れ、片手で持ちます。
  5. メスと非常に細かい先のとがった目のはさみを使用して、辺縁の後方約3.5 mmの円周方向のカットによって、前部を後部セグメントから分離します。
  6. 後部を下に傾けた後、コリブリ鉗子を使用して硝子体と網膜を慎重に取り除きます。
  7. まっすぐな虹彩鉗子を使用して、崩壊したRPE /choroidea複合体を慎重に再配置し、その後、湾曲した虹彩鉗子で所定の位置に保持します。
  8. 後眼カップに、10%ウシ胎児血清(FBS)、80 U / mLペニシリンと80 μg / mLストレプトマイシン(ペン/ストレプトマイシン)、および2.5 μg / mLアムホテリシンB(AmphoB)を添加したダルベッコの改変イーグル培地/ハムのF-12栄養混合物(DMEM / F12)1mLを入れます。
    注:ブタまたはウシの目からの初代RPE細胞の単離とは対照的に36,37、後部アイカップを充填してトリプシンでインキュベートする必要はありません。
  9. RPE細胞を採取するには、網膜色素上皮を視神経から眼縁部に向かって、火で磨いた湾曲したガラス製パスツールピペットで穏やかにブラッシングし、RPE/choroidea複合体をコリブリ鉗子を使用して四肢に固定します。細胞懸濁液をペトリ皿に移す。
  10. 手順1.8と1.9を繰り返し、ペトリ皿内のすべての細胞を収集します。シングルチャンネルピペット(100-1,000 μL)を使用して上下にピペッティングし、細胞懸濁液を注意深く再懸濁します。
  11. 各眼球のRPE細胞懸濁液を24ウェル細胞培養プレートの3つのウェルに播種し、FBS、ペン/ストレプト、およびAmphoBを添加したDMEM/F12を1 mLまで充填します。
  12. コンフルエントに達するまで、95%の空気と5%のCO2 の加湿雰囲気下でRPE細胞培養物を37°Cに維持します。細胞培養培地を週に2回交換してください。

2. 初代ヒトRPE細胞のエレクトロポレーション

  1. SB100Xトランスポザーゼ/PEDFトランスポゾンプラスミド混合物の調製
    1. SB100XトランスポザーゼおよびPEDFトランスポゾンプラスミドDNAは、トランスフェクションなどのアプリケーションでの使用に適していることが確認されている通常のプラスミド精製キットを使用して、製造元のプロトコルに従って精製します。
    2. マイクロボリューム分光光度計を使用してプラスミドDNA含有量を定量し、10 mM Tris-HCl(pH 8.5)で250 ng/μLの濃度に調整します。
    3. 250 ng/μL SB100X トランスポザーゼプラスミドDNA(例:2.5 μL)の一部と250 ng/μL PEDF トランスポゾンプラスミドDNA(例:40 μL)の16部を混合します。残留プラスミド混合物は-20°Cで保存することができる。
      注:プラスミド混合物の凍結および解凍サイクルを複数回繰り返すことは避けてください。
    4. 29.4 ngのSB100Xトランスポザーゼプラスミドと470.6 ngのPEDFトランスポゾンプラスミドを含むSB100Xトランスポザーゼ/PEDFトランスポゾンプラスミド混合物2 μLを滅菌済みの1.5 mLセーフロックマイクロ遠心チューブに入れます。細胞と混ざるまで氷上に保管してください。
  2. キャピラリートランスフェクションシステムのセットアップ
    注:初代ヒトRPE細胞のエレクトロポレーションは、メーカーのプロトコルに従って10 μLキットを使用してキャピラリートランスフェクションシステムを介して実行されています。このシステムは、トランスフェクションデバイス、トランスフェクションピペット、およびピペットステーションで構成されています。このキットには、10 μLのトランスフェクションチップ、バッファーチューブ、電解バッファーE(バッファーE)、および再懸濁バッファーR(バッファーR)が含まれています。
    1. ピペットステーションをトランスフェクションデバイスに接続します。
    2. バッファーチューブに3 mLのバッファーEを満たし、カチッという音が聞こえるまでピペットステーションに挿入します。
      注意: バッファーチューブのサイド電極がピペットステーションのサイドボールプランジャーに接続されていることを確認してください。
    3. 初代ヒトRPE細胞のエレクトロポレーションでは、トランスフェクションデバイスで1,100 V(パルス電圧)、20 ms(パルス幅)、2パルス(パルス数)のパルス条件を設定します。
  3. 培養初代ヒトRPE細胞の調製
    1. 初代RPE細胞培養物の形状と形態を位相差顕微鏡で文書化します。低倍率の顕微鏡写真では、RPE細胞がコンフルエントで統合された単層に成長していることを実証し、高倍率の顕微鏡写真を使用して、RPE細胞の典型的な石畳の形態を指摘します。
    2. 細胞培養液を吸引し、1 mL緩衝リン酸生理食塩水(PBS、pH 7.4)で細胞を2回洗浄します。
    3. 初代ヒトRPE細胞を0.5 mL 0.05%トリプシン-EDTAで37°C、95%空気と5%CO2 の加湿雰囲気中で7〜15分間(最大)トリプシン処理します。細胞剥離を顕微鏡で確認してください。
    4. FBSを添加した1 mLのDMEM/F12でトリプシン処理を停止します。血球計算盤を使用した細胞計数のために20 μLのアリコートを取ります。RPE細胞懸濁液を106 x g で10分間遠心分離します。
    5. 20 μLのアリコートを20 μLのトリパンブルー溶液と混合します。血球計算盤の各半分に10 μLをピペットし、位相差顕微鏡下で細胞を計数した。
    6. 遠心分離後、RPE細胞ペレットを1 mLのPBSに再懸濁します。
    7. トランスフェクション反応ごとに10,000〜100,000 RPE細胞を採取し、106 x g で10分間遠心分離します。
      注:電場印加およびプラスミドDNAの添加によるトランスフェクション反応に加えて、各アプローチには2つの異なる対照培養も含まれます:(1)電界印加なしおよびプラスミドDNAなし。(2)電界印加あり、プラスミドDNAなし。
    8. 細胞ペレットを11 μLのバッファーRに再懸濁し、2 μLの SB100X トランスポザーゼ/PEDF トランスポゾンプラスミド混合物と混ぜ合わせます(ステップ2.1.4を参照)。
      注:バッファーRに再懸濁した後、細胞の生存率とトランスフェクション効率の低下を避けるために、細胞を15分以内に処理する必要があります。
    9. クランプがピストンの取り付けステムを完全に持ち上げるまで、トランスフェクションピペットのヘッドを10 μLのトランスフェクションチップに挿入します。細胞/プラスミド溶液をトランスフェクションチップに吸い込みます。
      注:気泡の発生とトランスフェクションチップへの気泡の吸引は避けてください。
    10. FBSを添加したDMEM/F12を1 mL、ペン/ストレプトおよびAmphoBを含まないものを、24ウェル細胞培養プレートの必要な数のウェルに入れます。
  4. エレクトロポレーションプロセス
    1. トランスフェクションピペットをピペットステーションに置かれたバッファーチューブに挿入します(ステップ2.2.2を参照)。
      注:トランスフェクションピペットのメタルヘッドが、ピペットステーション内のボールプランジャーとバッファーチューブに接続されていることを確認してください。
    2. トランスフェクションデバイスのタッチスクリーンで [開始 ]を押します。電気パルスを印加する前に、バッファーチューブとトランスフェクションピペットが正しく挿入されているかどうかを自動的にチェックします。電気パルスの送達後、 タッチスクリーンにコンプリート が表示されます。
    3. トランスフェクションピペットをピペットステーションから慎重に取り出し、細胞/プラスミド溶液を細胞培養プレートの準備ウェルにピペッティングして、エレクトロポレーションされた細胞を10 μLトランスフェクションチップから直ちに放出します(ステップ2.3.10を参照)。
    4. トランスフェクトしたRPE細胞培養物を、95%の空気と5%のCO2の加湿雰囲気下で37°Cに維持します。エレクトロポレーションの3日後に最初の培地交換でペン/StrepとAmphoBを追加します。

3. 初代ヒトRPE細胞をトランスフェクトした解析

  1. サンプル調製
    1. 3週間の培養時間の後、最終的に、FBS、Pen/Strep、およびAmphoBを添加した1.0 mL DMEM/F12の規定容量でRPE細胞培養物を24時間規定のインキュベートします。
    2. 細胞培養上清を採取し、さらに近い時間処理が行われるまで-20°Cで保存するか、熱的に不安定なサンプルと長期保存の場合は-80°Cで保存します。
    3. トランスフェクトしたRPE細胞培養液を、0.5 mLの0.05%トリプシン-EDTAで、95%の空気と5%のCO2 の加湿雰囲気下で37°Cで10分間トリプシン処理します。
    4. FBSを添加した1 mLのDMEM/F12でトリプシン処理を停止します。血球計算盤を使用して細胞計数するために少量のアリコートを取ります(ステップ2.3.5を参照)。RPE細胞懸濁液を106 x g で10分間遠心分離します。
    5. RPEセルペレットは、さらに処理されるまで-80°Cで保管してください。
  2. ウェスタンブロッティングによるPEDF分泌の評価
    注:定性評価のために、細胞培養上清(ステップ3.1.2を参照)は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびその後のウェスタンブロッティングによって分析されます。に応じて PEDF 使用するトランスポゾンプラスミドDNAは、上清を異なる方法で処理しなければならない。
    1. 細胞培養上清からのHisタグ付きPEDF融合タンパク質の精製
      1. ベベルカットチップを使用してサンプルあたり30 μLのニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)スラリーを取り、遠心分離によってNi-NTA樹脂をペレット化します(2,660 x g で30秒間)。
      2. Ni-NTA樹脂を200 μLの1xインキュベーションバッファー(50 mM NaH 2 PO4、300 mM NaCl、10 mM イミダゾール、pH 8.0)で慎重に再懸濁し、遠心分離(2,660 x gで30秒間)してペレット化します。
      3. 前の手順を繰り返します。
      4. Ni-NTA樹脂をサンプルあたり40 μL 4xインキュベーションバッファー(200 mM NaH 2 PO4、1.2M NaCl、40 mMイミダゾール、pH 8.0)で注意深く再懸濁します。
      5. 900 μLの細胞培養上清を260 μLの4xインキュベーションバッファーおよび55 μLの前処理Ni-NTAスラリーと混合します(ステップ3.2.1.4を参照)。
      6. 混合物をロッキングシェーカー上で室温で60分間インキュベートする。
      7. 遠心分離(2660 x g で60秒間)によりNi-NTA樹脂をペレット化します。
      8. Ni-NTA樹脂を175 μLの1xインキュベーションバッファーとペレット樹脂で遠心分離(2,660 x g で60秒間)で慎重に再懸濁します。
      9. 前の手順を繰り返します。
      10. Ni-NTA樹脂を30 μLの溶出バッファー(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、250 mM イミダゾール、pH 8.0)で注意深く再懸濁し、混合物をロッキングシェーカー上で室温で20分間インキュベートします。
      11. 遠心分離によりNi-NTA樹脂をペレット化します(2,660 x g で30秒間)。
      12. 上清を注意深く採取し、2x SDSサンプルバッファー47と混合します。
      13. 混合物を95°Cで5分間加熱し、Ni-NTA精製タンパク質を10%SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離します。
      14. 前述のように、抗ペンタヒス抗体(マウスモノクローナル、1:500)および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗マウス抗体(ウサギポリクローナル、1:1,000)を使用してウェスタンブロッティングを実行します36,37。
    2. タグなしPEDFタンパク質の直接分析
      1. 15 μLの細胞培養上清を取り、2x SDSサンプルバッファー47と混合します。
      2. 混合物を95°Cで5分間加熱し、10%SDS-ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分離します。
      3. 前述のように、抗ヒトPEDF抗体(ウサギポリクローナル、1:4,000)およびHRP結合抗ウサギ抗体(ヤギポリクローナル、1:2,000)を使用してウェスタンブロッティングを実行します38。
    3. ELISA法によるPEDF分泌量の定量
      1. 製造元のプロトコルに従って、ヒトPEDF ELISAキットを使用して細胞培養上清を分析します(ステップ3.1.2を参照)。
      2. 分泌されたPEDFの量を、各トランスフェクション反応で決定された時間と細胞数に関連付けます(ステップ3.1.4を参照)。
    4. トランスフェクトRPE細胞における PEDF 遺伝子発現の解析
      1. 製造元のプロトコルに従って市販のキットを使用して、RPE細胞ペレットから全RNAを単離します(ステップ3.1.5を参照)。
      2. マイクロボリューム分光光度計を使用してRNA含有量を定量します。
      3. メーカーのプロトコルに従って、逆転写システムを使用して0.1 μg RNAの逆転写を実行します。
      4. 前述のようにリアルタイムqPCRを実行します38。
    5. トランスフェクトRPE細胞における導入遺伝子挿入部位の解析
      1. 製造元のプロトコルに従って市販のキットを使用して、RPE細胞ペレットからゲノムDNAを単離します(ステップ3.1.5を参照)。
      2. 微量分光光度計を使用してDNA含有量を定量します。
      3. 前述のように、計算支援ヘミ特異的PCRスキームを使用して挿入部位ライブラリを生成する38。
      4. 前述のように計算解析を実行する38。

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結果

初代ヒトRPE細胞の培養とエレクトロポレーション
我々は、動物起源の十分な数の初代RPE細胞の播種が、色素沈着した六角形の細胞の統合された単層への培養および成長を可能にすることを示した36、37、48。タイトジャンクションを形成し、食作用活性を示し、およびインビトロで特異的マーカー遺伝子を発現するそれらの能力48は、インビボでの網膜色素上皮の実質的なタスクを反映しています。ヒトドナーの眼から単離された培養初代RPE細胞も、ドナーの年齢(65.3 ± 9.94 a、最小:49 a、最大:83 a、n = 12)、死後の分離時間(37.3 ± 17.0時間、最小:16時間、最大:68時間、n = 12)、および培養時間(27.6 ± 14.1 d、最小:13 d、 最大:61 d、n = 12)(

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ディスカッション

本プロジェクトでは、遺伝子導入細胞を保護環境の確立と維持のための長期治療薬として使用するために、有効な因子を継続的に過剰発現および分泌する遺伝子改変初代ヒトRPE細胞の非ウイルス産生を目指しています。私たちは、抗血管新生機能と神経保護機能を有する遍在的に発現する多機能タンパク質であるPEDFをコードする遺伝子の導入を確立しました。ここで説明するプロトコルは、 SB100X トランスポゾンシステムを使用して初代ヒトRPE細胞を安定かつ再現性よくトランスフェクションするために使用できます。DNAの送達とRPE細胞への導入は、キュベットの代わりにエレクトロポレーションチャンバーとして特定のチップを使用するピペットベースのキャピラリートランスフェクションシステムを使用して行われます。

その後のトランスフェクションに使用される形態学的によく分化した細胞からなる初代RPE培養物の濃縮は、ヒトドナー(年齢および一般的な健康状態)および眼の受容(細胞分離の死後時間)に関連するいくつかの要因の影響を受けます。新たに単離および播種された初代RPE細胞は、六角形の細胞の単層を発達させる...

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開示事項

Zoltán IvicsとZsuzsanna Izsvákは、SBトランスポゾン技術に関するいくつかの特許の発明者です。

謝辞

この作業は、研究、技術開発、実証のための欧州連合の第7次フレームワークプログラム、助成金契約第305134号によってサポートされました。Zsuzsanna Izsvákは、欧州研究会議、ERC Advanced(ERC-2011-ADG 294742)から資金提供を受けました。著者らは、優れた技術サポートを提供してくれたAnna DobiasとAntje Schiefer(アーヘン大学病院眼科)と、人間のドナーの目を提供してくれたアーヘン角膜銀行(アーヘン大学病院眼科)に感謝したい。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
初代ヒトRPE細胞の単離
24ウェル細胞培養プレートエッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ0030722019
アムホテリシンB [250 µ(AmphoB)Merck, Darmstadt, GermanyA2942
Colibri ForcepsGeuder, Heidelberg, GermanyG-18950
Curved Iris Forceps ドイツ・ハイデルベルク・ゴイダーG-18856
メス(No.11)Feather, Osaka, Japan
Dulbecco'のモディファイドイーグル」s ミディアム/ハム's F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor Geuder、ハイデルベルク、ドイツG-19405
ウシ胎児血清[0.2µm 滅菌フィルター] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP40-37500
Glass Pasteur PipettesBrand, Wertheim, Germany747715
ペニシリン [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, GermanyP0781
ピペットチップ (1000 µL)Starlab、ハンブルク、ドイツ
シングルチャンネルピペット (100-1000 µL)エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ
滅菌ドレープLohmann &ラウシャー、レングスドルフ、ドイツ
滅菌ガーゼ湿布 フィンク・ヴァルター、メルヒヴァイラー、ドイツ321063
滅菌手袋Sempermed、ウィーン、オーストリア
滅菌ペトリ皿 (ファルコン 60 mm x 15 mm)コーニング、コーニング、ニューヨーク351007 滅菌
手術用ガウンハリヤード ヘルス、アルファレッタ、ジョージア
ストレート虹彩鉗子 Geuder, Heidelberg, GermanyG-18855<
em>Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture PlateThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
24-Well Cell Culture PlateEppendorf, Hamburg, Germany
アムホテリシンB [250 µ(AmphoB)Merck, Darmstadt,Germany A2942
Dulbecco'のモディファイドイーグル」s ミディアム/ハム's F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 & micro;(FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP40-37500
倒立顕微鏡Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germanyライカ DMi8
微量分光光度計 (NanoDrop 分光光度計)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
ピラリートランスフェクションシステム (Neon Transfection System)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
ネオントランスフェクションシステム 10 & micro;L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)Paul Marienfeld, Lauda-Köニグスホーフェン、ドイツ0640110
PBS ダルベッコ w/o Ca2+ w/o Mg2+Biochrom、ベルリン、ドイツL182-50
ペニシリン [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)メルク、ダルムシュタット、ドイツP0781
ピペットチップ (10 µL)Starlab、ハンブルク、ドイツ
ピペットチップ(1000µL)Starlab、ハンブルク、ドイツ
ピペットチップ(200&マイクロ;L)Starlab、ハンブルク、ドイツ
プラスミドマキシキットQiagen、ヒルデン、ドイツ12163
シングルチャンネルピペット (0.1-10 µL)エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ
シングルチャンネルピペット (100-1000 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
シングルチャンネルピペット (10-200 & micro;L)Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue SolutionMerck, Darmstadt, GermanyT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1 x インキュベーションバッファー (50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM イミダゾール、pH 8.0)
2x SDS サンプルバッファー
4x インキュベーションバッファー 4x インキュベーションバッファー (200 mM NaH2PO4、1.2 M NaCl、 40 mM イミダゾール、pH 8.0)
アマシャム プロトラン支持 0.2 µm ニトロセルロースブロッティングメンブレンCytiva、マールボロ、マサチューセッツ10600015
アムホテリシンB [250 µg/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, GermanyA2942
Anti-PEDF 抗体 (Rabbit Polyclonal)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
Anti-Penta-His 抗体 (Mouse Monoclonal)Qiagen, Hilden, Germany34660
Dulbecco'のモディファイドイーグル」s ミディアム/ハム'f F-12 栄養混合物 (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP04-41150
溶出バッファー (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM イミダゾール, pH 8.0) 
ウシ胎児血清 [0.2 & micro;(FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermanyP40-37500
血球計算盤 (Neubauer Chamber)Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany0640110
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体 (ウサギポリクローナル)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体 (ヤギポリクローナル)Abcam, Cambridge, United Kingdomab6721
Human PEDF ELISA Kit BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Imaging System富士フイルム, 港区, 日本
LightCycler 1.2 InstrumentRoche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Germany12239264001
LightCycler キャピラリー(20 μl)Roche Life Science, Penzberg, Germany4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting ModuleBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gelBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Germany30410
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
ペニシリン [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, GermanyP0781
ピペットチップ(10 & micro;L)Starlab、ハンブルク、ドイツ
ピペットチップ(1000µL)Starlab、ハンブルク、ドイツ
ピペットチップ(200&マイクロ;L)Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, Hilden, Germany51304
Reverse Transcription System プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州 A3500
RNaseフリーDNaseセットQiagen、ヒルデン、ドイツ79254
RNeasyミニキット Qiagen, Hilden, Germany74104
Rocking ShakerCole-Parmer, Staffordshire, United KingdomSSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)Eppendorf, Hamburg, Germany
シングルチャンネルピペット (0.1-10 µL)エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ
シングルチャンネルピペット (100-1000 µL)Eppendorf, Hamburg, Germany
シングルチャンネルピペット (10-200 & micro;L)Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany1704150
Trypan Blue SolutionMerck, Darmstadt, GermanyT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
州 0030722019 キャMPK5000州

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