パーキンソン病の遺伝的ラットモデルにおける歩行解析のためのラットウォーカーシステムの適用

最も一般的な加齢性神経変性運動障害であるPDは、黒質緻密症におけるDAニューロンの喪失によって引き起こされます。この黒質DAニューロンの喪失と線条体へのDA入力は、PD ^1,2の患者に見られる観察された運動機能障害につながります。パーキンソニズムと総称されるPD患者の定義運動特性には、硬直、安静時振戦、運動緩慢、姿勢不安定性、および顕微鏡写真^{が含まれます3}。さらに、PD患者によく見られる歩行障害は、疾患の経過の初期に現れます^1,4,5。健康的な食事や定期的な運動など、PDの進行を遅らせるのに役立つ特定のライフスタイルが提案されていますが、現在、PDの治療法はなく、症状を管理するための薬しかありません。これは、治療法の改善を期待して、さらなる調査の必要性の余地を残しています。したがって、PD動物モデルにおける歩行パターンの特性評価は、モデルの関連性と、PDを制御することを目的とした治療的治療が運動障害をどのように予防または改善しているかを特徴付けるための重要なツールです。

治療法の試験に使用されているさまざまなPD動物モデルがありますが、それぞれに限界があります。たとえば、神経毒1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)で治療された動物モデルは、黒質DAニューロンの喪失とその後の線条体適応に重要なプロセスに関する豊富な情報をもたらし、PD病因におけるミトコンドリアの役割を指摘しました。しかしながら、MPTPモデルの病因的背景は、ヒトPD⁶のような神経変性過程ではなく毒性の性質のものである。追加の化学的に誘導可能なモデルには、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)およびロテノンが含まれる。6-OHDAは、DAニューロンに薬物を選択的に蓄積することによってPDを誘導するために使用された最初の薬剤であり、最終的にはニューロンを殺し、PDのような症状を引き起こします。このモデルは、アンフェタミンとアポモルヒネ⁷に応答した挙動を調べることにより、DA枯渇の追跡に最初に使用されました。このPD誘導法は、DAおよびその受容体に影響を与える薬理学的物質のスクリーニングに有用であることが証明されています⁸。6-OHDAモデルは、定量化可能な運動障害を追跡するための優れたモデルですが、このモデルは、ニューロンの段階的な喪失とレビー小体の形成が動物にどのように影響するかを示していません。他の誘導方法であるロテノンは、チロシンヒドロキシラーゼとDAトランスポーターの喪失を伴う黒質線条体ニューロンの進行性変性を有することが示されており、ニューロンの喪失を経時的に追跡するためのより良いモデルを可能にする⁹。ロテノン処理ラットは、運動緩慢、姿勢不安定、および不安定な歩行を示しました¹⁰。しかし、この方法はラットの異なる系統間で大きく変動することが見出されており、ロテノンが信頼できるPDモデルであるかどうか疑問を投げかけている^11、12、13。歩行解析はラットにおけるPDの誘導によって影響を受けることが示されているが、これまで、遺伝的に誘導されたPDラットモデルは、滑走路を自由に歩くことによる歩行解析に容易に使用されていない。

自由に歩くげっ歯類の運動障害を分析する1つの方法は、FTIRイメージングを利用して実行できる運動学的歩行分析です。この確立された方法は、FTIRに基づく光学式タッチセンサを使用し、滑走路^14,15,16を下る齧歯類の足跡を記録および追跡する。他の方法と比較して、FTIRは足跡を妨げる可能性のある動物の体のマーカーに依存しません。ビデオデータの生成により、4つの手足すべてのデジタル足跡が生成され、それを組み合わせて、さまざまなげっ歯類モデルの動的で再現可能な歩行パターンを作成できます。画像ベースの歩行分析の原理は、個々の足を取り、げっ歯類が滑走路を歩くときの経時的な接触面積を測定することです。各スタンスは、足面積の増加(制動段階)と足面積の減少(推進段階)で表されます。これは、足の信号が検出されないスイングフェーズによって進行します。ビデオの評価後、野生型(WT)モデルとPDモデルを比較するために使用できるいくつかのパラメータが生成されます。パラメータの例としては、ステップ長(足が1ステップでカバーする距離)、スイング持続時間(足が滑走路に接触していない時間)、スイング速度(スイング時間の関数としてのステップ長)、およびステップパターン(斜めのステップ、横方向のステップ、またはガードルステップ)があります。

ラットの初期の歩行パターンの変化を明らかにするためのFTIRの有用性を実証するために、PDの遺伝子ラットモデルを使用しました。PDのほとんどの症例は特発性ですが。PDの遺伝型を同定すると、ミトコンドリアの品質管理に関与する2つのタンパク質であるPink1とParkinの機能喪失変異などの遺伝子変異と変異が明らかになり¹⁷、動物モデルの作成に利用できる可能性があります¹⁸。残念ながら、マウスはこれらのタンパク質(単一および複合)が失われると神経変性に耐性があります^19,20,21。ラットでは、パーキン欠損ではなくPink1は、黒質DAニューロン喪失および運動障害²²をもたらすが、完全な浸透性はない。したがって、Pink1 / Parkinダブルノックアウト(DKO)ラットを組み合わせたモデルを生成し、オスのPink1 KOラット²²で報告された明白な視覚的に明らかな後肢ドラッグ表現型を表示しますが、現在はより高い率で示されています:100%対4〜6か月のオスの30〜50%。

この方法はマウス¹⁴の運動障害を分析するのにうまく機能しますが、ラットのサイズと体重に対応するためのFTIRイメージング歩行システム仕様は、以前は非商業的に利用できませんでした。ここでは、ラットのサイズと体重に適合した場合を除き、マウスウォー^カー14をモデルにした修正されたFTIR歩行イメージングシステムであるRatWalkerの構築方法について説明します。このシステムは、光学効果であるFTIRを利用して、動物の足跡を視覚化し、その後分析のために記録する方法を提供します。動物の足が光導波路(プラットフォーム)に接触すると、光路が乱れ、目に見える散乱効果が生じ、国産グレードの高速ビデオ撮影とオープンソースソフトウェアを使用した処理を使用してキャプチャされます。この研究は、PDの遺伝子ラットモデルにおける歩行変化の研究におけるFTIRイメージングの力を実証しています。例えば、早くても4ヶ月の雄DKOラットでは、視覚的に明らかな運動変化(後肢の引きずり)が明白に観察されますが、FTIRを使用すると、生後2か月の雄DKOラットのゲート異常を明らかにすることができます。

すべての動物実験は、ネブラスカ大学医療センターの施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1.歩行装置

注:マウスウォー^カー14からモデル化されたラットウォーカーは、ラットとマウスのステップ長の違いに比例した寸法で設計されました。サイドイルミネーションバックライト、歩道筐体、光導波路通路、ミラー、カメラで構成されています(図S1)。余分な材料を収容するために、通路とバックライト導波路の両側に千鳥配置に配置されたLEDストリップが使用されました。修正された歩行装置を構築するために必要な材料は、 表S1に見出すことができる。

1. バックライト(図S2)を使用して動物のシルエットを作成し、ソフトウェアが位置、移動方向、および形態測定の品質を割り当てます。構造は、アクリルディフューザー、光導波路、リフレクター、およびストックアルミニウムフレーム内に組み立てられたLEDライトストリップの層状パネルで構成されています(表S1)。
2. 歩道の囲い(図S3)を使用して、プラットフォームに沿って動物をガイドし、動物をホームケージに誘導します。構造は、ジクロロメタンで溶接された透明なアクリルシート溶剤からなる(表S2)。
3. 歩道(図S4)を使用して、照明付きのフットプリントを生成するための媒体を提供します。通路は透明なアクリルで構成されており、ストリップLEDでサイドライトされ、アルミニウムアングルで収納されています(表S3)。
4. 歩道の真下に鏡(図S5)を45度の角度で置き、歩道の下側を反射してビデオ撮影します。アクリルで支えられた厚さ1/4インチのガラスミラーと、一列に配置された角度の付いたブラケットで構成されています(表S4)。
5. 三脚に取り付けられた国産品質の高速アクションカメラを使用してビデオ撮影を実行します。

2.機器のセットアップ

1. バックライト、通路、ミラーを 図S1に従って、カウンタートップ、ワークベンチ、または安定したカートの上に合わせます。各コンポーネントが歩道に対して中央に配置されていることを確認します。
2. 水準器を使用して、コンポーネントが水平方向に垂直であることを確認します。
3. 歩道の囲いを歩道の上に置きます。
4. すべての接触表面積を70%エタノールで洗浄します。歩道の傷を防ぐために、必ず非研磨性のタオルを使用してください。
5. ハイスピードカメラを57インチの三脚に取り付け、ミラーの中間線に配置し、視野内の通路全体をキャプチャするのに十分な間隔を空けます。ビデオ設定メニューから、ハイスピードカメラが120フレーム/秒(fps)の1080pモードでリニアアクイジションに設定され、すべてのタイプの自動調整または最適化がオフになっていることを確認します。
6. バックライトと通路のLEDストリップライトを接続してオンにします。背景キャプチャを減らすために、バックライトを暗くする必要がある場合があります。

3.動物の順応

注:最初の実験の1週間前に、改造された歩行装置を通して動物を走らせます。

1. 歩道の終点にホームケージを配置します。
2. エンクロージャーを設置し、ライトを消した状態で、ラットをホームケージの反対側の通路の端に置き、強制せずに通路を横切って歩くようにします。
3. 各ラットを、歩道全体をスムーズに横断できるようになるまで、修正された歩行装置に数回通します。
4. 実験の2日前にこのプロセスを繰り返します。

4.歩行手順

1. 各ランの開始前に歩道の端にホームケージを配置して、ラットが歩道を横断するための前向きな合図として機能します。
2. 部屋の照明を消し、カメラの電源を入れ、ラットがプラットフォームに置かれる数秒前に録画を開始します。
   注意: カメラの製造元が公式に推奨するメモリカードを必ず使用してください。リストにないメモリカードは引き続き機能する可能性がありますが、意図されたフレームレートでキャプチャすることは保証されません。
3. エンクロージャーを取り付けたら、ホームケージの反対側の通路の端にラットを置き、強制せずに通路を横切って歩くようにします。
4. 動物が歩道の終点に到達したら、記録を停止します。
5. ランニングの合間や動物の排尿や排便後に、70%エタノールと非研磨性のタオルを使用して歩道を掃除し、エタノールを蒸発させてから別の動物を紹介します。
6. 各観察期間中にラットを歩道に合計7回走らせ、最初の3回の実行を分析の合格として採点します。
7. 動物がグルーミング、一時停止、または誤った動きのために中断することなく、ホームケージの方向に4つ以上の連続したステップを行った場合、ランをパスとしてスコアリングします。
   注:各ラウンドの測定の前に動物の質量を記録することをお勧めします。我々の研究では、WT(n = 7)およびDKO(n = 8)の重量はそれぞれ200.3 ± 21.67 gおよび296.6 ± 3.85 gであった(p = 0.004、ウェルチの補正による対応のないt検定)。年齢やサイズのラットには問題は見られません。

5.ビデオの前処理

注: ハイスピード カメラでキャプチャされたビデオは、120 fps および 1080p の解像度で mp4 形式でレンダリングされます。ダウンストリームの分析ソフトウェアの負担を軽減するには、まず不要な映像をトリミングし、LosslessCutソフトウェア(バージョン3.23.7、https://github.com/mifi/lossless-cut)を使用して各ビデオからオーディオを取り除き、次にオープンソースソフトウェアFFmpeg(バージョン4.2、http://ffmpeg.org/)を使用してmp4ビデオストリームをpng画像シーケンスに変換します。注:pngの代わりにtiffなどの他の可逆形式を利用できます。

1. Windows 7以降を実行しているPCでビデオのディレクトリを作成し、高速カメラのストレージデバイスから新しく作成したディレクトリにビデオを転送します。さらに、ffmpeg.exe を同じ場所にコピーします。
2. LosslessCutで、ビデオをインターフェイスにドラッグして開きます。オーディオを破棄し、ビデオの分析上関連する部分のみを含むように開始カットポイントと終了カットポイントを設定し、キャプチャフレーム形式をpngに設定してエクスポートします。ビデオがエクスポートされたら、任意の命名規則の後に「_trimmed」を付けてビデオファイルの名前を変更します。
3. ビデオを画像シーケンスにバッチ変換するには、コマンドプロンプトを開き、作業ディレクトリを「cd [ディレクトリへのパス]」を使用してビデオの場所に設定し、次のコマンドを実行します。
   (*) の %i の場合は、mkdir "%~ni_cropped" を実行します。
   (*) の %i に対しては mkdir "%~ni_trimmed" を実行します。
   /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed.MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png"
4. バッチプロセスが完了したら、ImageJフィ^ジー23 の各画像シーケンスを開き、ラットが観察される床の領域を含む関心領域(ROI)にシーケンスをトリミングします。
5. 歩道の照明からの背景を減らすには、シアンチャンネルのカラーバランスの最小値を76に増やします。
6. 画像シーケンスとして保存し、「_trimmed」サフィックスを「_cropped」に変更して、ファイルをそれぞれの「_cropped」フォルダーに保存します。

6.歩行処理

注意: 歩行データは、無料で入手できるソフトウェアであるMouseWalker(http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)¹⁴を使用して処理および定量化されます。

1. マウスウォーカーソフトウェアを解凍し、Microsoft Excelがインストールされている64ビットWindows環境を実行しているPCにインストールします。
2. MouseWalker.exeを起動した後、実行セットごとに初期スケールキャリブレーションを実行します。画像シーケンスをロードし、ビデオでキャプチャされたランドマークまたは定規を使用して、既知の距離の2つのポイントを測定します。ビデオフレームのセンチメートルあたりのピクセル数を計算し、この値をビデオ取得フレームレートとともに設定フォームのパラメーターセクションに入力します。
3. 同様に、ラットの頭、尾、足を測定して、頭の長さ、最大尾の幅と面積、最小足面積と最大足面積、およびMouseWalker設定フォームの追跡パラメーターセクションを完了するために必要なその他の機能を決定します。ユーザーマニュアルおよびその他のドキュメントについては、http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ を参照してください。
4. 体の面積の値を取得するには、ImageJで同じ画像シーケンスを開き、ラットの輪郭を描いた選択範囲を描画し、関心領域(ROI)ピクセルカウントを実行します。
5. このパブリケーションに使用されるパラメータと設定(図S6)。
   注:パラメータは説明のために提供されており、ビデオのスケール、集録ハードウェア、および条件によって異なります。カメラまたは機器を再配置するたびに、ソフトウェアのキャリブレーションと調整が必要です。アクイジション内で測定デバイスをキャプチャすると、精度が向上し、キャリブレーションが容易になります。
6. キャリブレーション後、各画像シーケンスをロードします。[自動] を選択すると、フットプリントの自律的な割り当てが開始されます。
7. シーケンスの各フレームをスクロールして、誤って割り当てられたフットプリントを手動で修正します。この手順が完了したら保存します。
8. 最後に、[評価]を選択して、フットプリントの位置と圧力データを処理します。一連のグラフ、画像、および定量的歩行メトリックを含むスプレッドシートが結果フォルダーにエクスポートされます。

7.データ分析

1. 各評価の最後にエクスポートされた、各実行の定量的歩行データを含むスプレッドシートを使用します。各実行のデータとラットあたりの平均を連結します。平均データをプロットし、グラフパッドプリズムバージョン7.0aを使用して有意性をテストします。

ラットコロニーのメンテナンス
Pink1およびParkinシングルKOラットの生成および特徴付けは、以前に記載されている22。Pink1およびParkinシングルKOラットはSAGE Labsから入手した(現在はEnvigoから入手可能)。DKOラットは、Pink1-/-ラットとパーキン-/-ラットを交配してPink1+/-/Parkin+/-ラットを得、これを交配してPink1-/-/Parkin-/-ラットを得ることによって生成されました(Envigoから入手可能になります)。Park6(Pink1をコードする遺伝子)における26 bpの欠失を確認するために、5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3'フォワードプライマーおよび5'-CCACCACCACTACCACTTACT-3'リバースプライマーを用いてジェノタイピングを行った。Park2(パーキンをコードする遺伝子)における5bpの欠失は、前方5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGA-3'および逆5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3'を用いてDNAを増幅した後に試験した。増幅ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)サンプルを、シーケンシングのためにACGT Inc(イリノイ州ホイーリング)に送った(図S7)。すべてのラットは、ロングエバンスフード付き(LEH)の背景に保たれました。DKOラットは生存可能で繁殖力がありました。しかし、分娩時のDKOダムの死亡率は高かった(約30%)。これらの実験では雄ラットのみが利用された。ラットは、12時間の明暗サイクルとラットの飼料と水への自由なアクセスを備えた温度制御された環境に保たれました。

結果
14歳から適応されたラット用FTIR歩行分析システムの有用性の例として、生後2か月の雄のWTおよびPink1 / Parkin DKOラットで歩行分析を実施し、運動学的歩行分析の使用が、生後4か月から始まる肉眼的運動障害の出現前に人間の視覚では観察されなかった微妙な運動障害を発見できるかどうかを判断しました。

マウス14での以前の歩行研究と同様に、適応FTIRシステムは、歩行ラットによって作成された足跡パターンと、体の中心によって作成された経路を表示することができました(図1A)。WTと比較してDKOラットの体重が増加したにもかかわらず(図1B)、FTIR信号の強度によって決定される歩行面に加えられた足圧(ヒートマップとして視覚化)は変化しなかった(図1C)。歩行速度の関数としていくつかの歩行パラメータを評価したところ(図1D-H)、歩行速度と歩幅はWTラットとDKOラットの間で類似していることがわかりました(図1D)。しかし、WTラットとDKOラットの間の変動は、より遅い歩行速度での立脚期とスイング持続時間で明らかになりました(図1E、F)。脚が立脚段階にあるステップサイクルの割合(立脚時間/期間)がデューティファクターであり、このパラメーターは、ランニングに典型的なデューティファクターが減少するにつれて、スタンスフェーズよりもスイングフェーズで費やされた時間が長くなります(図1G)。ここでも、低速では違いが強調表示されます。さらに、WT動物ではスイング速度が速度の増加とともに増加するのに対し、DKOラットでは相関関係が鈍化している(図1H)。

FTIR歩行分析では、自由に歩くラットの体に対する各脚の立脚位相トレースのプロットも可能になりました(図2A、B)。スタンストレースは体長に正規化され、足のタッチダウン(前端位置、AEP)からスタンスフェーズの終わり(後端位置、PEP)までの体の中心に対する足の位置として定義されます。足の位置を比較すると、AEP(左後肢)とPEP(右後肢)に有意な変化が見られ、WTラットと比較して、DKOでは足の離陸(PEP)中に左後肢が体に近いこと、右後肢が体から離れていることが示唆されました(図2C)。

いくつかの追加のパラメータは、WTと比較してDKOラットにおいて有意に変化した。特に、後肢のスイングパターンの変化が明らかになりました。左後肢と右後肢の両方のスイング速度は、WTラットと比較してDKOラットで増加しましたが(図3A)、左右の後肢の両方のスイング時間は減少しました(図3B)。注目すべきは、ステップ長が変更されていないことです(図4)。

図 1.フットプリントパターンとステップパラメータの分析。 (A)WTおよび(B)DKOラットの代表的なフットプリントパターン(上パネル)ピクセル強度を表すフットプリントヒートマップと、体の経路を表す水平線、および(下パネル)異なる色でラベル付けされた個々の足:左前(LF、黄色)、左後方(LH、青)、右前(RF、オレンジ)、および右後方(RH、緑)。(c)各WT(n=7)およびDKO(n=8)ラットの平均歩行速度。SEMで平均します。 重要ではありません。(D-H)WT(n=7)およびDKO(n=8)ラットにおける速度の関数としてのステップパラメータ。線形回帰直線とR平方値が含まれています。(D)ステップ長は、WTラットとDKOラットの速度とともに増加します。(E)スイング持続時間は、WTラットでは速度に反比例するが、DKOラットではそうではない(有意ではない)。(F)スタンス持続時間は、WTおよびDKOラットの速度とともに減少します。.(G)デューティファクターは、DKOラットの速度に反比例しますが、WTラットではそうではありません(有意ではありません)。(H)スイング速度はWTラットでは速度とともに直線的に増加しますが、DKOラットでは増加しません(有意ではありません)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.スタンストレースと足の位置分析。 (A)WTラットの代表的な歩行軌跡解析(背景補正前後)を鼻(赤実線)、頭部輪郭(青破線)、尾輪郭(緑破線)、体心(白破線)、足跡(円:緑、RF、水色、LH)で可視化した。(B)自由に歩くWTおよびDKOラットのスタンストレースの代表的なプロット。(c)WT(n=7)およびDKO(n=8)ラットにおける足の位置を示す。AEP、前方極端位置;PEP、後方極端位置;L、左;R、右;F、前足;H、後足。SEMによる平均は、二元配置分散分析とシダックの多重比較検定を使用したWT(p < 0.05*、0.001***)と比較して有意です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.後足のスイングパラメータはDKOラットで変化しました。 WT(n = 7)およびDKO(n = 8)ラットにおける(A)足が動いている速度および(B)時間足が空中に浮遊している前足および後足の測定。L、左;R、右;F、前足;H、後足。ウェルチの補正を使用したスチューデントの対応のない両側t検定を使用したWT(p < 0.01**)と比較して有意。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.DKOラットではステップ長は変化していません。 WT(n=7)およびDKO(n=8)ラットにおける前足および後足のステップ長の測定。L、左;R、右;F、前足;H、後足。SEMの平均。 ウェルチの補正を伴うスチューデントの対応のない両側t検定を使用したWT(有意ではない)と比較して有意。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。