新生児マウスからの白色および褐色の前読細胞の分離と分化

サマリー

この報告書は、新生児マウスからの原発性褐色および白色の前突細胞の同時分離のためのプロトコルを記述する。単離された細胞は培養中に増殖させ、完全に成熟した白および褐色のアディポサイトに分化するように誘導することができる。この方法は、培養中の一次脂肪細胞の遺伝的、分子的、機能的特徴付けが可能となる。

要約

アディポサイト分化と機能の基礎となるメカニズムの理解は、不死化白色前準備細胞細胞株の使用から大きな恩恵を受けている。しかし、これらの培養細胞株には制限があります。彼らは、現在白い脂肪貯蔵所内に存在することが知られている異種脂肪細胞集団の多様な機能的スペクトルを完全に捉えていない。白色脂肪組織の複雑さを研究するためのより生理学的に関連するモデルを提供するために、新生児マウスからの原発性白色および茶色の脂肪細胞前駆物質の同時分離、培養の急速な拡大、および成熟した完全に機能的な脂肪細胞への分化を可能にするプロトコルが開発され、最適化された。初代細胞を成体マウスではなく新生児から単離する主な利点は、脂肪デポが積極的に発達しており、したがって、増殖性の豊富な豊富なプリディサイト源である点である。このプロトコルを用いて分離された原発性前脂肪細胞は、合流に達すると急速に分化し、4〜5日で完全に成熟し、新生児マウスにおける発達した脂肪パッドの出現を正確に反映する時間的な窓である。この戦略を用いて調製された一次培養物は、高い再現性を持って拡大・研究することができ、遺伝子およびフェノミピックスクリーンに適しており、遺伝的マウスモデルの細胞自律型のアディポサイト型の研究を可能にする。このプロトコルは、脂肪組織の複雑さをインビトロで研究するための、シンプルで迅速で安価なアプローチを提供します。

概要

肥満は、エネルギー摂取とエネルギー支出の間の慢性的な不均衡から生じる。肥満が発症するにつれて、白色のアディポサイトは、微小環境、細胞死、炎症、および^{インスリン抵抗性}の低酸素症をもたらす細胞サイズの大規模な拡張を受ける。機能不全、肥大化脂肪細胞は、インスリン作用^2、3を湿らせる他の組織に蓄積する余分な脂質を適切に保存することができない。脂肪細胞機能を改善し、組織間で正常な脂質区分を回復させる薬剤は、2型糖尿病などのインスリン抵抗性を特徴とする肥満関連条件の治療に有益であると予測される。3T3-L1、F442A、および10T 1/2のような不死化細胞株を用いた藍細胞のフェノチスクリーンは、遺伝を調節する遺伝的要因を同定し、抗糖尿病特性^{4、5、6、7}を有する抗糖尿病性分子を単離するのに有用であることが証明されている。しかし、これらの細胞株は、白、茶色、ベージュ、および独特な特徴を有する他の脂肪細胞サブタイプを含む脂肪デポに存在する細胞型の異質性を完全に反映しておらず、そのすべてが全身恒常性^8、9、10に寄与する。さらに、培養細胞株は、外部刺激に対する応答が減少することを示すことが多い。

対照的に、一次葉細胞の培養は、生体内の異形成の複雑性をより正確に再現し、一次アディポサイトは、堅牢な機能的応答を示す。原発性前脂肪細胞は、典型的には、成体マウス^{11、12、13、14}の脂肪デポの間質血管分画から単離される。しかし、成虫動物の脂肪デポは、主に^15、16、17の非常に遅い離職率を有する完全成熟脂肪細胞で構成されているため、このアプローチは低増殖速度で限られた量の予後細胞を生み出す。したがって、新生児マウスからの前備細胞の単離は、インビトロで分化され得る急速に増殖する細胞を大量に得ることが好ましい。ここでは、Kahnらの一次褐色の藍藻細胞との最初の^{研究に触発}されたプロトコルが記載されており、完全に機能的なプライマリアディポサイトにインビトロで拡大および分化することができる白色および褐色の前読細胞の両方を効率的に分離する(図1A)。新生児から初等細胞を単離する利点は、成体マウスとは対照的に、脂肪デポが急速に成長しており、したがって、積極的に増殖する予後細胞¹⁷の豊富な供給源である。このプロトコルを用いて分離された細胞は、増殖能力が高く、培養物の迅速なスケールアップを可能にする。さらに、新生児由来の前駆細胞からの前読細胞は、成人前駆細胞よりも高い分化可能性を示し、分化の程度における十分な変動を減少させ、したがって再現性を高める。

プロトコル

このプロトコルは、スクリプス研究所とウィスコンシン大学のすべてのIACUCガイドラインに従います - 医学と公衆衛生のマディソン学校.

1. 脂肪採取庫の収集と消化(1日目)

1. 各子犬のための2つの1.5 mLチューブを準備します:茶色の脂肪組織(BAT)用と白い脂肪組織(WAT)のための1つ。2x分離バッファー(123 mM NaCl)のリン酸緩衝生理食塩分(PBS)+ 200 μL を 250 μL 追加 5 mM KCl、1.3 mM CaCl_2、5mMグルコース、100 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)、ペニシリンストレプトマイシン、および4%脂肪酸フリーウシ血清アルブミン。無菌で氷の上にソリューションを保管してください。
2. 子犬を小さなチャンバー(例えば、6ウェルプレートの井戸)に入れ、低体温になるまで氷の上に置きます。子犬と氷の間に直接接触がないことを確認してください。意識の喪失を保証するために先端で足を刺し、鋭いはさみを使用して切断することによって子犬を安楽死させます。
   注:異なる遺伝子型で作業する場合は、ジェノタイピングのためのテールバイオプシー(3mmカット)を収集するために追加のチューブを準備してください。ジェノタイピングが直ちに行われる場合は、脂肪脱地を採取するために解剖するまで安楽死させた子犬を氷の上に置いておきます。
3. すべてのデポを消化するために必要なコラゲナーゼの量を計算し、計量します。15 mg/mL コラゲナーゼタイプIの50 μLを各チューブに2x分離バッファーに加えます。すべての組織が採取されるまで、コラゲナーゼを分離緩衝液で再中断しないでください。
4. 皮下WATを採取するには、子犬の腹部の周りの皮膚を切断し(腹膜破裂を避ける)、そして脚の下の皮膚をそっと引っ張ります。皮膚を服用することなく、透明(P1以下)または白(P2以上)として現れる脂肪貯蔵所を慎重に収集し、四頭筋の内側または上に付着した細長い組織(図1B)。PBSで脂肪貯蔵所をすすいで、2x分離バッファーのPBS + 200 μLの250 μLを含むチューブの1つに入れます。氷の上に置いておきなさい。
   注:P0およびP1マウスは最高の収率を与えます。P0-1の子犬では、皮下WATデポはほぼ透明です。P2マウスおよび古いマウスでは、デポはすでに白色に変わり、完全に成熟した脂質負荷の白色脂肪細胞の存在を示すため、より容易に識別できます。
5. 肩甲骨BATを採取するには、肩甲骨から頭の上に皮膚を引っ張ります。BATを持ち上げる - 肩甲骨の間の深い赤い組織 - と慎重に体からそれを取り外すために、その周りの切開を行います(図1B)。一貫性と色を確認します。PBS でリンス;2x分離バッファーのPBS + 200 μL の 250 μL を含む他のチューブに置きます。氷の上に置いておく。
   注: P2 マウスおよび古いマウスから BAT を収穫する場合は、BAT を囲む白い脂肪組織を慎重に取り除いてください。これは、肩甲骨の間に深い皮膚とBATの間に位置する薄い、柔らかく、白いアディポサイトのシートで構成されています。
6. すべてのデポが回収されたら、小さなはさみを直接チューブの中に使用して各デポ(4〜6回)を静かにミンチします。
7. コラゲレーターーゼタイプIを適切な2倍の分離バッファーの体積で再中断し、15mg/mLで10倍のストック溶液を得る。各チューブに50μLのコラゲナーゼを加えるとともに、すべてのチューブにコラゲナーゼが加わるまでチューブを氷の上に置く。
8. チューブを素早く反転して混合し、温度調節されたミキサーに移します。37°Cで30分間サンプルをシェーカー(効果的なサンプル混合のための1,400 rpm周波数)にインキュベートします。

2. 前読細胞のめっき(1日目)

1. 組織を消化した後、チューブを氷の上に戻します。
   注:このステップ以降、すべての作業は、バイオセーフティキャビネットで無菌状態で行われます。
2. 消化した組織を100 μmの細胞ストレーナーを通して新しい50 mLチューブにひずみます。WTマウスのみで作業する場合、または遺伝子型が既知の場合は、関連する解別されたBATを一緒にプールします。これを WAT に対して繰り返します。細胞収量を最大化するには、各チューブを1 mLの分離培地(DMEM)+20%ウシ胎児血清(FBS)、10mM HEPES、1%ペニシリンストレプトマイシン)でリンスし、細胞ストレーナーを通して濾過します。未知の遺伝子型を使用する場合は、ステップ 2.4 に進みます。
   注: FBS は、プリディポサイトの増殖と分化の両方の必須の決定要因です。さまざまな FBS を厳密にテストして、ロット間の高いパフォーマンスと一貫性を確保します。
3. BATとWATサスペンションを希釈して、各BATサンプルに6ウェルプレートの2-3ウェル、各WATサンプルに6ウェルプレートの4-6ウェルをプレートします。たとえば、6 つの BAT と 6 つの WA がプールされた場合、BAT 細胞懸濁液を 24~36 mL まで希釈し、WAT セル懸濁液を 48-72 mL まで希釈します。ウェルあたり細胞懸濁液のプレート2mL。
4. 未知の遺伝子型を持つサンプルの場合は、各サンプルを別々に保管してください。6ウェルプレートの各ウェルの上に100 μmのセルストレーナーを置き、ウェルごとに1つのサンプルをフィルターします。1.5 mLの分離媒体でチューブをすすいで、ストレーナーを通して最終容積を井戸あたり2mLにします。セルストレーナーを捨て、蓋をプレートに置き、プレートをインキュベーターに移します。
   注:ウェル内の媒体は、浮遊血液細胞、細胞破片、およびリセド細胞からの脂質のために濁って見えるはずです。
5. めっき後1〜1.5時間、吸引媒体と2 mLのDMEMで血清を使用して洗浄する。プレートを軽く攪拌して、ウェルの底から血液細胞を取り外します。3回の清水の後、2mLの新鮮な単離培地を加え、細胞をインキュベーター(37°C、5%CO2)に移す。
   メモ:顕微鏡の下のセルを確認してください。浮遊物質(血液細胞、細胞の破片)は最小限にする必要があります。褐色の血小細胞は小さな非半透明細胞として現れ、白色の血小細胞はより細長い形を示す。茶色と白の両方の前読細胞は、プレートにしっかりと取り付ける必要があります。

3. 予後細胞文化の拡大(2日目~5日目)

1. 翌日、培地を吸引し、血清を含まない2mLのDMEMで細胞を洗浄し、2mLの分離培地を添加します。
2. 細胞が80-90%合流に達するまで、2日に1回ステップ3.1を繰り返します。
   注:原発性褐色の前読細胞の場合、合流率が80~90%に達すると4~5日かかる場合があります。原発白色の前読細胞の場合、通常は2〜3日かかります。前置細胞が60%合流すると、ノックダウンや過剰発現実験のためにウイルス粒子に効率的に感染することができます。適切なウイルス負荷で、最大 8 時間の予後細胞に感染する。カチオン性ポリマーを使用して感染効率を高めることが多いため、毒性が高まり、感染した前体細胞の有数化能が有意に低下するため、推奨されます。
3. 細胞を分割するには、0.1%w/vゼラチンの無菌溶液を使用して新しい目的地プレートをコーティングします(蒸留水に溶解し、熱を使用しないでください)。井戸/皿の底を覆うのに十分な量を使用してください。細胞を播種する準備ができるまで37°Cでプレートをインキュベートする(少なくとも10分)。
   注: この手順はオプションです。細胞培養プレートのコーティングは、収率や分化電位に影響を与えませんが、分化されたアディポサイトの維持と取り扱いを大幅に簡素化します。
4. 細胞がサブコンフルエント密度(85-95%)に達したら、培地を吸引し、PBSで洗浄し、トリプシンを3分間添加して細胞を取り外します。分離媒体の2.5xトリプシン容量を追加することによりトリプシン活性をブロックします。細胞の懸濁液を上下にピペットして細胞の回復を最大化し、新しいチューブに移します。1 mLの分離培地でウェルを洗い、最初のコレクションに加えます。
5. 800〜1200×gで5分間細胞を遠心分離し、上清を吸引し、分離培地の3〜5mLで細胞を再懸濁する。細胞を数え、目的の最終密度に希釈します。
   注:例えば、50,000-80,000細胞/mL(6-、12-および24ウェルプレートの2.5、1、0.5 mL)は、72-96時間以内に完全にコンフルなウェルになります。
6. 工程3.3でコーティング溶液を吸引し、過剰なゼラチンをPBSで洗い流す。細胞を播種し、プレートを完全にコンフルエントになるまでインキュベーターに戻します。

4. 白色と茶色の前読細胞の分化(日7-12)

1. 前置細胞がコンフルエントになると、培地を吸引し、170nMインスリン、1μMデキサメタゾン、および0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチンを含むDMEM中の10%FBSからなる分化培地に置き換えます。BATの前読細胞を分化する場合は、1 nMトリヨードサイロニン(T3)も加える。分化の0日目として、有量分化が誘発される日をマークする。
   注:白と茶色の両方の前ふし細胞は、合流に達すると自発的に区別することができます。しかし、アディポサイト分化を最大化するために、上述の伝統的なプロアディポジェニックカクテル(BATプリディポサイトのT3を加えて)を使用する必要があります。
2. 48時間後(分化の2日目)、DMEMの10%FBSおよび170 nMインスリン(BATの場合は1 nM T3を加えた)からなる維持媒体で培地をリフレッシュします。
   注:2日目には、顕微鏡下の細胞に蓄積する小さな脂質滴を、標準的な明視野を用いて観察することができます。
3. 細胞が実験に使用されるまで、2日に1回ステップ4.2を繰り返します。
   注:分化の4日目または5日目には、細胞の大部分が脂質を搭載して表示されます。終末分化されたアディポサイトは、培養中に長く保つか、この段階で実験に使用することができる。

5. バイオエネルギー実験の再めっき

注:意図は、96ウェル形式で成熟したアディポサイトでバイオエネルギー研究を行うことである場合は、次の手順を実行する必要があります。理想的には、完全に分化した(4日目または5日目)細胞を使用する必要があります。以下に説明する手順は、6ウェルプレートの1ウェルから始まります。

1. トリプシン消化の前に、96ウェルプレート用のコーティングを準備します。各ウェルに0.1%ゼラチンの50 μLを加えます。細胞が播種される準備が整うまで、組織培養インキュベーターにプレートを残します。
2. 分化の4日目または5日目に、培地を吸引し、1mLのPBSで洗浄し、0.25%トリプシンエチレンジアミンテトラ酢酸(6ウェルプレートの1ウェル)の300 μLを加えます。プレートを軽く傾けてトリプシンが井戸の底を完全に覆っていることを確認します。室温で2分間インキュベートする。700 μLのメンテナンスメディアでトリプシンの作用をブロックし、ピペットを上下にして細胞回収を最大化し、細胞懸濁液を新しい1.5 mLチューブに移します。
3. 1200×gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、ペレットを1mLの維持培地に再懸濁し、細胞を数えた。
   注:6ウェルプレートの1つのウェルは、約15〜180万個の細胞を得るはずです。
4. 細胞を希釈して、褐色のアディポサイトの場合は60,000〜80,000細胞/mL、白色のアディポサイトの場合は100,000〜120,000細胞/mLの最終濃度を有する。ゼラチンコーティング96ウェルプレートのウェル当たりの100 μLのプレート。
   注:6ウェルプレートの1つの井戸は、最大2つの96ウェルプレートに十分なセルを提供します。バイオエネルギー実験では、酸素消費量を正確に測定し、アッセイ中にウェルの酸素欠乏を避けるために低密度めっき(30-40%合流)が必要です。
5. 細胞がプレートの底部に少なくとも48時間接着するようにします。細胞をプレートに48時間以上保持する場合は、2日後に培地をリフレッシュします。
6. アッセイの日に、培地を吸引し、アッセイ培地に交換する。非_CO2制御インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートし、製造業者の指示に従ってアッセイを行います。

結果

プロトコルのセクション1は、標準的な光顕微鏡の下で見える細胞の異種懸濁液をもたらす。細胞ストレーナー(セクション2)で消化された組織をフィルタリングすると、未消化組織が除去されます。しかし、いくつかの細胞の破片、血液細胞、および成熟したアディポサイトが通過する(図1C)。めっき後1時間の穏やかな開封は、前細孔細胞がウェルの底部に急速に付着するので、関連しない細胞を除去する(図1C)。セクション3では、実験計画に必要な細胞数を得るために、アディポサイト前駆体が展開される。新生児から分離された白色および褐色の前向き細胞はいずれも高い増殖能力を有するが、白色の前置細胞の収率は一般的に、デポ当たり褐色の前置細胞の2倍である(図2A)。したがって、同期培養が望ましい場合、白色の前置細胞の開始密度をそれに応じて計算しなければならない。セクション4は完全に成熟したアディポサイトを得るためのガイドラインを提供し...

ディスカッション

脂肪組織は、全身インスリン感受性およびグルコース恒常性²⁰に対して重要である。肥満に関連する椎細胞機能不全は、2型糖尿病の発症と密接に関連している。したがって、脂肪組織の基礎生物学と生理学の理解が深まり、代謝障害に対する新しい治療法の設計が可能になる可能性があります。脂肪デポ^21,22から分離された成熟脂肪細胞の直接的な機能および転写分析を補うものとして^、培養された原発脂肪細胞は、脂肪組織病態生理学の多くの側面を再現することが示^{されている。}以前のプロトコルは、成体マウス^11、12からのアディポサイト前駆体の分離を説明しているが^、このプロトコルは、新生児から細胞を効率的に単離...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX)	Sigma-Aldrich	I7018
6 ウェルプレート	コーニング	353046
アディポレッド (ナイルレッド)	ロンザ	PT-7009
アンチマイシン A	シグマ-アルドリッチ	A8674
ベンチマーク ウシ胎児血清	ジェミニバイオプロダクツ LLC	100-106
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
細胞ストレーナー	Fisher Scientific	22363549
Collagenase, Type 1	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション	LS004196
ddH2O	Sigma-Aldrich	6442
デキサメタゾン	Sigma-Aldrich	D4902
DMEM	Sigma-Aldrich	D5030	生体エネルギー研究用
DMEM、高グルコース、グルタマックス	Gibco	10569010
DPBS、カルシウム、マグネシウム	なしGibco	14190144
脂肪酸フリー BSA	Sigma-Aldrich	A8806
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920
ゼラチン	Sigma-Aldrich	G1890
グルコース	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
インスリン	Sigma-Aldrich	I6634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
ノルエピネフリン	ケイマン ケミカル	16673
オリゴマイシン	Sigma-Aldrich	75351
ペン/連鎖球菌	Gibco	15140122
ロシグリタゾン	Sigma-Aldrich	R2408
ロテノン	Sigma-Aldrich	557368
タツノオトシゴ XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	生体エネルギー研究
用 外科用鉗子	ROBOZ Surgical Instrument Co	RS-5158
Surgical Scissors	ROBOZ Surgical Instrument Co	RS-5880
サーモミキサー	エッペンドルフ	T1317
トリヨードチロニン (T3)	Sigma-Aldrich	642511