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方法論記事

腹部マウス心臓移植モデルにおける血液回路再建

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DOI:

10.3791/62007

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2021年6月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric and Adolescent Medicine, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Department of Pediatric Surgery, Chengdu Women's and Children's Central Hospital, 3The Key Laboratory of Hainan Trauma and Disaster Rescue, The first affiliated Hospital of Hainan Medical University, 4Department of Infectious Diseases, West German Centre of Infectious Diseases, Universitätsmedizin Essen, University Duisburg-Essen, 5Department of Nephrology, Hannover Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

異重症性腹部マウス心臓移植モデルにおける血液回路再建の新しい技術が実証されている。

要約

マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は、移植免疫学の研究のための標準的なモデルである。ここでは、異所性腹部心臓移植モデルにおける修飾血液回路再構成のための確立された技術が提示される。この方法では、レシピエントの下の大静脈に対する吻鼻的なドナー心臓の肺動脈の代わりに胸部内の下静脈(IIVC)を使用する。これは、マウスの腹部心臓移植の成功率を促進し、改善しています.

概要

マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は、移植免疫学1、2、3の研究のための標準的なモデルを表す。しかし、実行することは非常に困難であり、これはこのモデル4、5の広範な使用に対する制限を意味します。

従来のマウス心臓移植(THTx)では、ドナー大動脈およびレシピエント腹部大動脈は、肺動脈がレシピエントの下の静脈6、7、8に吻眼されている間に吻眼される。

この改変マウス心臓移植技術において、ドナー大動脈はレシピエント腹部大動脈に吻合され、ドナーIIVCは、レシピエントの下のカバに吻合される(図2および図3)。

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プロトコル

すべての動物実験は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する欧州議会の指令2010/63/EUのガイドラインに従って行われました(倫理委員会承認、#G1071/09)。

注: 予備準備、麻酔、術後のケアおよびモニタリング作業は、従来の外科方法1、2、4で行われるのと同じです。BALB/cマウスは心臓ドナーとして、C57BL/6Jは移植レシピエントとして働いた。マウスは8〜12週齢、移植時の体重は30g〜および標準的な条件下で収容された。

1. 準備手順

  1. 麻酔の場合、マウスに吸入イオブルラン(2%)眠りに落ちるまで、ケタミン(100mg/kg)+キシラジン(10mg/kg)+アセプロマジン(2mg/kg)の腹腔内注射が続く。術後鎮痛の場合は、メタミゾール(200mg/kg)p.o.およびカルプロフェン(5mg/kg)s.cを適用します。
    注:抗生物質の適用は、これらの物質が免疫学的応答に影響を与える可能性があるため、意図的に棄権した。
  2. 手術には、マイクロシザー、マイクロ鉗子、針ホルダー、マイクロ止血クランプなどの顕微鏡器具を使用してください。電気外科用ペンも必要です。7/0er、10/0er、4/0erナイロンタイプを使用して縫合を行います。
  3. イオブルラン吸入用のボックスにマウスを置く(2%)40〜60秒間。ピンセットで足を絞って麻酔の深さを決定します。この刺激に対する応答が完全に不足している場合は、次のステップに進みます。
  4. マウスが眠りに落ちたら、マウスの重量を量る。
  5. 麻酔薬にケタミン(100mg/kg)+キシラジン(10mg/kg)+アセプロマジン(2mg/kg)の腹腔内注射を適用します。
  6. 腹部の毛皮をクリップし、操作テーブルの上にマウスを置きます。ポビドネヨウ化物を使用して3回消毒を行い、フェネレートされた外科タオルを使用してマウスを適切にドレープする。

2. ドナーの操作手順

  1. はさみを使って首から下腹部まで皮膚を切り取り、両腋窩の中線まで皮膚の完全な層を剥がします。
  2. はさみを使って腹壁の筋肉を切り、内臓を左にそっと動かします(オペレーターの視界から)。内臓を生理食前のインビドガーゼで包み込み、下の大静脈を安全に露出させます。
  3. 1 mL の注射器を使用して、0.4 mL のヘパリン溶液 (500 U ヘパリンを含む) を下の大静脈にゆっくりと注入し、針を引き抜く前に 1 分間待ちます。
  4. 針を引き出し、マイクロハサミを使用して、下の大動脈と腹部大動脈の両方を切断して排泄を促進します。
  5. はさみを使用して、U字型のカットを行うことによって胸腔を開きます。完全に心臓、肺とすべての胸の血管を露出します。
    1. 胸部大動脈を露出し、内腔の1/2を切断し、その後、灌漑と排水を容易にするために肺静脈を切断します。
    2. 乾性大動脈の開口部に灌漑チューブを挿入し、肺静脈流出が完全にクリアされ、心臓の鼓動が完全に停止するまで、4°C冷たいヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸心プレジア溶液(Custodiol HTK溶液)9 の少なくとも2 mLを注入する。
  6. 灌漑チューブを引き出し、胸骨を取り外します。
  7. 胸腺を取り除き、大動脈弓の周りの脂肪をわずかに取り除くためにマイクロハサミを使用してください。
  8. 直線および湾曲した鉗子を使用して、10/0縫合糸で動脈プルモナリス(大動脈弓の右側)の幹を露出させ、リゲートします。
  9. IIVCに取り付けられた脂肪と結合組織を分離するためにマイクロ鉗子を使用し、7/0縫合糸で優れた静脈(大動脈アーチの左側)を露出させ、ライゲーションの背後でカットするためにマイクロハサミを使用します。
  10. 大動脈弓、IIVC、および両方の耳の下の心臓の基部の周りに7/0縫合を作ります。次に、肺動脈の枝と静脈肺の血管をリゲートします。
  11. マイクロハサミを使用して大動脈弓を可能な限り遠位に、合字の下の肺血管と横隔膜近くのIIVCをトランセクトします。胸から心臓を取り出します。
  12. 4 °Cの冷たいHTK心筋プレギア溶液に植えられたドナーの心臓を置き、一時的に保存します。

3. 受信者の操作手順

注:最初の操作手順は、麻酔や消毒を含むドナーマウスに対して以前に示されたものと同様です。

  1. 腹部の皮膚を横方向に切り取り、生理液を用いて濡れたガーゼで腹部の器官を覆う。
  2. 微小鉗子を使用して、下の大静脈と腹部大動脈を露出させ、周囲の脂肪組織からそれらを解放する。
  3. マイクロ鉗子を使用して、腎血管の下(側面または静脈/大負の下)側枝血管をリゲートまたはエレクトロカテーズします。
  4. クリップアプリケーター鉗子を使用して、右から来る静脈/大動脈の腹部に2つのマイクロ止血クランプを配置し、両方の大動脈/静脈の距離を1cm以上残し、その間に吻合の構築のためのスペースを確保します。
  5. マイクロハサミを使用して、大オータへの切開を上部クランプよりも低いクランプに少し近くします。あるいは、30Gの針を使って小さな穴を開け、マイクロハサミで開きます。
  6. 大介が反対側の静脈を持つオペレータに向かるように、受取人のマウスを置きます。その後、腹腔に心臓を配置し、小さなぬれたガーゼパッドでそれをカバーします。
  7. 10/0縫合糸を使用して、ドナー大仏を受け知り受取人大オルタに適応させ、縫い合わせ、結び目を作り、切開の上部(約4〜5針)に縫合を進めます。次に、(被写体の視界から)心臓を右にひっくり返し、もう一度カバーし、尾端に達するまで左側の縫合糸を続けて結び付けます。
  8. 灌漑チューブを使用して、少なくとも0.5 mLの4°C HTK心プレギア溶液を注入し、ドナーのIIVCを洗い流します。
  9. マイクロハサミを使用して、ドナーIIVCルーメンの同じサイズを持つはずのレシピエントの腹部下の大静脈に丸い穴を切断します。切開は大動脈性解剖学的開口部の上に配置する必要があります。静脈切開を大動脈切開よりも大きくする。
  10. 10/0縫合糸を使用して、ドナーIIVCをレシピエント・カバに縫い付けます。結び目を結び、切開の上部に達するまで縫合を実行します。5針を使用し、左側の縫合糸を続けます。最後に、尾角で結び目を結び、慎重に締めます(引っ張りすぎないように注意してください)。
  11. 血帯性スポンジの小さな部分を静脈と大動脈性の大動脈の周りに置きます。
  12. クリップアプリケーター鉗子を使用して、最初に下部を取り除き、次に上部のマイクロヘモースタティッククランプを取り除き、38.0°Cの焼戻し0.9%塩化ナトリウムで腹腔をすすきます。
  13. マイクロ鉗子を使用して、止血スポンジを取り除く。
  14. 移植された心臓の鼓動を観察する。
  15. 鉗子を使用して腸を腹腔に戻し、2層縫合(腹筋に続いて皮膚)を使用して腹部の創傷を4/0縫合で閉じます。
  16. マウスを酸素および温度制御ワークステーションチャンバー(例えば、INVIVO2-400)に入れて、移植されたマウスが回復するための温かい酸素リッチな環境を提供し、マウスが目を覚ますのを待つ。
  17. 術後鎮痛の場合は、術後に直接Metamizolを与える 200 mg/kg / os あたり.手術後4時間と16時間は、metamizolに200mg / kgのos+ Carprofen(5mg/kg)s.cを与える。さらにフォローアップでは、手術後3日間連続して24時間ごとに移植されたマウスにカルプロフェン(5mg/kg.c)を与える。

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結果

ここでは、これまで研究室で開発され、過去16年間に有用であることが証明されているマウスにおける異所性腹部心臓移植の改変技術が提示される。以前は、静脈からカバ(V-V群)に対する静脈カバの40例の全体的な40例において、従来の肺動脈からカバ(P-V群)の吻合手順4(表1)に比べて、V-V群では20.8±1.3分を要することが報告されていた。 これはP-V群(27.5±1.3分、p<0.01)よりも有意に短かった。 温かい虚血時間、総レシピエント手術時間、術後心臓繰り返し時間(25.5±1.2分、42.0±1.5分、1.1±0.2分)も、従来のP-V群で観察されたよりも有意に短縮された(<図1)。このモデル10,11では長年の生存率に違いはないが、改変技術はマウスにおける腹部心臓移植を促進し、暖かい虚血と移植された心臓の拍動時間の両方を生...

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ディスカッション

マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は非常に困難であり、これはこのモデルの広範な使用に対する制限を意味する。

従来の技術の欠点の1つは、ドナーの肺動脈(PA)の制限長である。通常は約2mmの長さですが、私たちのモデルで使用されるドナー心臓のIIVCの長さは一般的に約1cmです(図2)。つまり、改変モデルにおいて、IIVC吻合は、手術場座のより明確な視力を提供し、解剖学会の改善された手術を可能にし、あまりにも厳格な縫合糸または血管の損傷の損傷の望ましくない発達を防ぐ(図4)。PAの構造およびIIVCの吻合は経験豊富なオペレータにとっても挑戦的である。PAは非常に繊細で薄い壁であり、IIVCはさらに薄く、潜在的にマウスでより脆弱です。したがって、オペレーターはこの制約を認識する必要があり、IIVC を縫合する際には注意を払う必要があります。しかし、この時点で、IIVC血管壁は非常に薄いが、血管の長さが血管接続への張力と関連付けられていないという大きな利点を有し、...

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謝辞

声優としての彼女の助け、ビデオ編集の助けを借りて建華ペン博士、そしてアニカ・クッカン博士のコメントとサポートに感謝します。この研究は、ドイツ研究財団(DFG)が国際的な協力(HO2581/4-1からAH)、中国国立科学財団(NSFC;FJ #81760291)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
30Gニードルブラウン456300
アセプロマジンCPファーマトランキソルP
BALB / c AnNCrlマウスチャールズリバー。ドイツカタログ番号
なし Bepanthenの目の軟膏ハウス アポテーケPZN 01578675
ボンマイクロ鉗子FST11083-07
断熱材と酸素供給装置用ボックスRUSKINNINVIV
C57BL/6J  マウスチャールズ川.ドイツカタログ番号
カルプロフェンゾエティスリマジル 50 mg/ml
カテーテル-FEP 26Gテルモサーフロー-W
クリップ アプリケーター 鉗子スタイルFST18057-14
湾曲した鉗子WPI14114-G
custodiol/HTKフランツ博士 Köhler Chemieno catalog numer
Cutasept 皮膚消毒VWRBODL980365
電気メスペンBovieCHANGE-A-TIP
ガーゼパッド、綿棒Lohmann-Rauscher13353
ヒーティングマットTHERMO MAT PRO 30WHTP-30
止血スポンジCuraSponJ1276A
ヘパリン溶液ハウス・アポテーケPZN 03029820
アイスボックスPETZカタログ番号なし 吸入
麻酔器GROPPLERBKGM 0616
断熱材および酸素供給装置RUSKINNINVIV
イソフルランCP ファーマイソフルラン CP 1 ml/ml
ケタミンZoetisはカタログ番号
ミゾールWDTカタログ番号なしマイクロ
はさみFST15000-00,15000-10
Serrefine(クランプ)角度付き/ 16 mmFST18055-06
カLEICAMZ6
顕微鏡ライトSCHOTT
生理食塩水解決 (NaCl 0.9%)Haus-ApothekePZN 06178437
はさみPeha Instruments991083/4
小さいペトリ皿Sarstedt833900
まっすぐな鉗子WPI14113-G
外科用テープBSN4120
縫合糸結束鉗子 - 10 cmFST18025-10
縫合糸(10-0)MedtronicN2540
合糸(4-0)ETHILONV4940H
縫合糸(7-0)ETHILON1647H
シリンジ(0.3 mL)BD324826
シリンジ(1 mL)BD320801
キシラジンバイエルロンプン
なしメタマイクロ顕微鏡ライ KL2500LED縫

参考文献

  1. Corry, R., Winn, H., Russell, P. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
  2. Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
  3. Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26, 223-228 (2013).
  4. Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
  5. Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
  6. Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
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  8. Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423(2014).
  9. Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
  10. Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
  11. Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
  12. Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
  13. Türk, T. R., et al. Reduction of chronic graft injury with a new HTK-based preservation solution in a murine heart transplantation model. Cryobiology. 64 (3), 273-278 (2012).

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