単一の卵母細胞レポーターアッセイを用いたインビトロ成熟時の母体母体翻訳プログラムの定義

サマリー

このプロトコルは、 インビトロ 成熟時の単一卵母細胞におけるmRNA翻訳の調節を研究するためのレポーターアッセイを記述する。

要約

卵母細胞核成熟に関連する事象がよく記載されている。しかし、トティポテンシーの受精と獲得に備えて細胞質に起こる分子経路やプロセスについては、あまり知られていない。卵母細胞成熟の間、遺伝子発現の変化は、転写ではなく母体メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳と分解のみに依存する。従って、翻訳プログラムの実行は、胚の発達を維持するための卵母細胞の発達能力を確立する上で重要な役割を果たす。この論文は、meiotic成熟時および卵母細胞間遷移時に行われる母体母体翻訳のプログラムの定義に焦点を当てる。本方法論文では、 インビトロ 卵母細胞成熟中の標的mRNAの翻訳の調節を研究する戦略を提示する。ここでは、Ypetレポーターが目的の遺伝子の3'未翻訳領域(UTR)に融合し、注入された体積を制御するためにmCherryのためにポリアデニル化mRNAコードと共に卵母細胞にマイクロインジェクターを注入する。タイムラプス顕微鏡を使用してレポーターの蓄積を測定することにより、卵母細胞系精密成熟中の異なる遷移で翻訳速度が計算されます。ここでは、卵母細胞の単離および注入、タイムラプス記録、およびデータ分析のためのプロトコルについて、Ypet/interleukin-7(IL-7)-3'UTRレポーターを例として用いて説明した。

概要

完全に成長した哺乳類の卵母細胞は、受精およびトティポテンシーの獲得に備えて急速な変化を起す。これらの変化は、受精後の胚発生を維持するために不可欠である。核成熟に関連する事象は比較的よく記述されているが、卵母細胞質における分子プロセスおよび経路についてはあまり知られていない。卵母細胞成熟の最終段階では、卵母細胞は転写的に静かであり、遺伝子発現はmRNA翻訳と分解^1,2に完全に依存する。したがって、発達能力に重要なタンパク質の合成は、卵母細胞の成長^1,3の間に先に合成された長命mRNAの時限翻訳のプログラムに依存する。このプログラムの定義に焦点を当てたのは、meiotic成熟中および卵母細胞間遷移中に実行される母体母体翻訳のこのプログラムの定義に焦点を当て、この論文は、インビトロのmeiotic成熟の間に単一の卵母細胞における標的母性母体の翻訳の活性化と抑制を研究する戦略を提示する。

この方法では、YPetオープンリーディングフレームは、対象のトランスクリプトの3'UTRの上流にクローン化される。次に、このレポーターをコードするmRNAは、注入された体積を制御するためにmCherryをコードするポリアデニル化mRNAと共に卵母細胞にマイクロインジェクションされる。レポーター蓄積は、タイムラプス顕微鏡を用いた インビトロ 卵母細胞の精密成熟の間に測定される。黄色蛍光タンパク質(YFP)とmCherryの蓄積は、個々の卵母細胞に記録され、YFP信号は、共注入されたmCherryの高原レベルによって補正されます。データ取得後、カーブフィッティングにより得られた曲線の傾きを計算することにより、 インビトロ 卵母細胞の滑間成熟時に異なる時間間隔で翻訳速度を計算します。

このアプローチは、選択された内因性mRNAの翻訳の変化を実験的に確認するためのツールを提供します。また、この方法は、3'UTRの標的mRNA4,5,6のシス調節要素を操作することにより、卵母細胞の微細成熟時に翻訳を制御する調節要素の特性評価を容易に^する。ポリ(A)尾長の操作はまた卵母細胞のアデニラーゼ/デアデニラーゼ活性への洞察を可能に^{する 5}.シス作用要素またはRNA免疫沈降の変異生成は、同結合RNA結合タンパク質^6,7との相互作用を研究するために使用することができる。さらに、この方法は、oocyteの品質^が低下したモデルでターゲット3'UTR翻訳を測定することによって、卵子発達能力に不可欠な翻訳プログラムの必須成分を同定するために使用することができる^{8、9、10。}この方法論文は、21日齢のC57/BL6マウスの裸卵母細胞がIL-7の3'UTRに融合したイペット記者とマイクロ注入された代表的な実験を提示する。卵母細胞注入、タイムラプス記録、およびデータ分析のためのセットアップおよびプロトコルについて説明した。

プロトコル

動物を含む実験的手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設動物管理および使用委員会(プロトコルAN182026)によって承認されました。

1. メディアの準備

1. 表1に記載されているとおり、すべての成分を追加して、基本的な卵母細胞収集媒体および卵母細胞成熟培地を作る。基本的な収集媒体の場合は、pHを 7.4 に設定します。回収および成熟培地の場合、使用日に3mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)と1 μMのクロスタミドを加えます。

2. Ypet-3' UTR および mCherry 用 mRNA エンコーディングの調製

1. 目的のmRNAの3′UTR配列を取得します。
   注:この研究では、配列は以前マウス卵母細胞cDNAから得られました。
2. Ypetコード配列、V5-エピトープタグ、およびT7プロモーターを含む、卵子cDNAおよびpcDNA3.1ベクターの一部から標的3'ユートルを増幅するプライマーを設計する。
3. 高忠実度のDNAポリメラーゼキットを使用して増幅します。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)製品をゲル上で実行し、フラグメントのサイズが正しいかどうかを確認し、バンドを切り取り、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してゲルからDNAを抽出します。
4. PCR クローニング キットを使用して PCR フラグメントをベクターに融合します。
   注: PCR フラグメントを氷上で 4 時間インキュベートし、より効率的な組み換えプロセスを促進します。これは、わずか45分のインキュベーション時間を推奨するメーカーの指示に反しています。
5. PCR断片を有能な 5 α大腸菌 にトランスフェクトする。
   1. ミックスとプラスミドを細菌に加え、氷の上で30分間インキュベートします。
   2. 45sの水浴に混合物を置くことによって混合物とプラスミドを熱ショックし、すぐに3分間氷の上で冷却します。
   3. カタボライト抑制(SOC)培地で500μLの超最適ブロスを加え、37°Cで1時間インキュベートします。
   4. 7000×gで2分間スピンダウンし、上清のほとんどを取り除く。適切な選択抗生物質とルリアブロス(LB)寒天プレートに再中断し、プレート。
      注:カルベニシリンは、この研究で使用されました。
   5. 37°Cで一晩インキュベートする。 コロニーの1つにピペットチップを軽く押し、100μg/mLのカルベニシリンでLB培地の3mLに入れることでコロニーを分離します。37°Cで12〜24時間インキュベートする。
   6. メーカーの指示に従ってプラスミドDNA分離キットを使用してプラスミドのDNAを抽出し、DNAシーケンシングを介して配列を確認します。
6. イペット/3' UTRの場合:
   1. インビトロ転写のための線形PCRテンプレートを作成します。Ypet配列の前方プライマー上流と20個の追加チミン残基を含むリバースプライマーを使用してください。Ypet/IL-7 3' UTR の配列およびフォワードおよびリバースプライマーのシーケンスについては、表 2を参照してください。
      注:これらの追加のチミン残基は、 インビトロ転写後にリニアmRNAにオリゴ(A)を追加します。
   2. In vitro は、メーカーの指示に従って T7 転写キットを使用して PCR 製品を転写します。
   3. 製造者の指示に従って転写クリーンアップキットを使用して、得られた相補RNA(cRNA)を精製します。
   4. 精製したcRNAをRNAAseフリー水に溶け込み、濃度を測定し、アガロース電気泳動による完全性を評価します。-80°Cで保管する。
7. mCherryの場合:
   1. 高忠実度制限酵素を使用して 、インビトロ 転写用のリニア PCR テンプレートを作成します。この例を複製する場合は、制限酵素 mfEI-HF を使用してください。消化バッファーで一晩 37 °Cで消化します。
   2. ゲルを実行してサンプルを精製し、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してリニアDNAを抽出します。
   3. In vitro は、メーカーの指示に従って T7 転写キットを使用して PCR 製品を転写します。
   4. 製造者の指示に従って、ポリ(A)テーリングキットを使用してcRNA(150-200ヌクレオチド)をポリアデニル化します。
   5. 製造者の指示に従って、転写クリーンアップキットを使用して得られたcRNAを精製します。
   6. 精製したcRNAをRNAAseフリー水に溶け込み、mRNA濃度を測定し、ゲル電気泳動によりメッセージの完全性を評価します。-80°Cで保管する。

3. 実験手順

注: 卵母細胞マイクロインジェクションとその後のタイムラプス顕微鏡の概略図を 図 1に示します。

1. 1日目
   1. 腹腔内に21日齢マウスを妊娠した雌の血清性ゴナドトロピンの5 IUを注入し、卵胞成長を促進する。
2. 3日目
   1. 卵母細胞コレクション
      1. マウスを44〜48時間後に屠殺して卵巣を採取し、基本的な卵母細胞採取培地を備えたプラスチックペトリ皿に入れる。
      2. 26G針で卵胞壁に小さな切り傷を入れ、角包を慎重に開けます。口操作ガラスピペットを使用して、cumulus細胞のいくつかの層で無傷の積雲閉卵母細胞(COC)を分離します。
      3. 小さなピペット(卵母細胞の直径よりわずかに大きい)を使用し、繰り返しピペット処理を行うことによってCOCを機械的に脱裸にする。
         注: または、無傷の COC にマイクロインジェクションを実行します。
      4. より大きなピペットを使用して、裸卵母細胞を吸引し、1μMのホスホジエステラーゼ阻害剤、シロスタミドを添加した成熟培地を含むペトリ皿に入れ、meiotic成熟¹²の再開を防止する。卵母細胞が卵胞から卵母細胞を単離して引き起こしたストレスから回復できるように、皿を2時間インキュベーターに入れます。
   2. 卵母細胞マイクロインジェクション
      1. 長さ10cmのホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブをメカニカルプーラーに入れ、注射針を準備します。最適な注入のために、加熱されたフィラメントを使用して針先を45°の角度で曲げ。
      2. 基本的な卵母細胞の収集媒体の20 μLの液滴でポリスチレン皿を準備し、軽いミネラルオイルで液滴をカバーする。
      3. 12.5 μg/μL Ypet-3' UTR と 12.5 μg/μL mCherry を追加して、レポーターミックスを準備します。より大きなボリュームを準備し、同様のレポーター濃度を確保するために、将来の実験のためのアリコートを作ります。これらのアリコートは-80°Cで保管してください。 解凍すると、最初に20,000 x gで2分間アリコートを遠心し、新しいマイクロ遠心チューブに移します。
         注:この遠心分離は、注射針がレポーターミックスの潜在的な凝集体によって詰まるのを防ぎます。
      4. 約0.5μLのレポーターミックスで毛細血管で注射針をロードします。
      5. 保持ピペットと装填された注射針をホルダーに入れ、卵母細胞採取培地の液滴に位置します。培地の一部を保持ピペットに吸引する。
      6. 注入針を、保持ピペットにそっと叩いて開きます。
      7. 卵母細胞を基本採取培地の液滴に入れ、レポーターミックスの5〜10pLを注入する。
      8. 1μMシロサミドを16時間分の成熟培地にインキュベートし、mCherry信号を高原にします。
      9. 注入されたレポーターごとに少なくとも2つの20 μL滴の成熟培地でタイムラプス顕微鏡に使用されるペトリ皿を準備します:1 μMシロスターミドを持つ1滴の切り出しは、I逮捕卵細胞を制御し、1滴は卵細胞を成熟させるクロスタミドなしで準備します。軽いミネラルオイルで液滴を覆い、インキュベーターに入れます。
   3. タイムラプス顕微鏡
      1. インキュベーション後、注入した卵母細胞をインキュベーターから取り出し、シロスターミドを使わずに成熟培地で4回洗浄します。1 μMシロスターミドを含む成熟培地の中に、I逮捕卵母細胞対照群としていくつかの卵母細胞を保管します。
      2. 注入された卵母細胞を、以前に調製したタイムラプス顕微鏡皿のそれぞれの液滴に移す。閉じたガラスピペットを使用して卵母細胞をクラスター化します(閉じたピペットは、数秒間炎の中で先端を保持することによって準備することができます)。
         注: 卵母細胞をクラスタリングすると、記録中の移動を防ぐことができます。
      3. 37°Cと_5%CO2で維持された環境室を備えた発光ダイオード照明システムとモーター式ステージを備えた顕微鏡の下に皿を置きます。この調査を複製するには、次のパラメータを使用します: フィルタセット: 二色ミラー YFP/CFP/mCherry 69008BS;YFPチャネル(励起(Ex):S500/20 ×49057;エミッション(EM):D535/30 m 47281)、mCherryチャンネル(Ex:580/25 ×49829;エム:632/60メートル)。
      4. タイムラプス実験に適した設定を入力します(この調査で使用するソフトウェアの資料表を参照してください):[アプリ]をクリック| 多次元取得.最初のタブを選択して、タイムラプス、複数のステージ位置、および複数の波長を選択します。
      5. [ 保存] タブを選択して、実験を保存する場所を入力します。
      6. タブ Timelapse を選択して、時間ポイント数、期間、および時間間隔を入力します。
         注:タイムラプス実験の期間は、卵母細胞の微細成熟のタイミングが種によって異なるように、研究された動物種に依存します。マウス卵母細胞を用いたこの実験では、卵母細胞を16時間毎に15分毎に記録した。
      7. タブの [ステージ] を選択します。ブライトフィールドをオンにし、[取得] を選択して新しいウィンドウを開いて、卵母細胞の位置を見 つけます||を取得するライブを表示します。卵母細胞が見つかったら、[ 多次元取得 ]ウィンドウに戻り、+を押して卵母細胞の位置を設定します。
      8. [ 波長]タブを選択し、明視野(露出15ミリ秒)、YFP(Ypet/ IL7 3' UTRの露出150 ms)、およびmCherry(Ypet / IL7 3'UTRの露出75 ms)に3つの異なる波長を設定します。
         注:レポーターの蓄積のレベルと注入されたボリュームに基づいて、Ypet/3' UTRレポータごとに露出を調整します。YFP信号が実験開始時に検出範囲の中心に収まるようにして、翻訳の活性化の場合の過小評価や飽和を防ぎます。mCherryの場合、シグナルがポリアデニル化手順中に追加されたアデニンヌクレオチドの数に依存するので、mCherryの各バッチの暴露を調整します。ポリアデニル化効率のばらつきのため、実験間の比較を改善するために、異なる実験で同じバッチのmCherryを使用します。
      9. [取得] をクリックして、タイムラプス実験を開始します。単一の卵母細胞でのタイムラプス記録の例については、図2と補足ファイルを参照してください。
   4. Ypet-3' UTR翻訳の分析
      1. この分析(本研究で使用するソフトウェア の材料表 を参照)では、卵母細胞自体が 楕円領域 をクリックして、卵母細胞を囲み、卵母細胞に近い小さな領域を囲み、 矩形領域のバックグラウンド減算クリックに使用する2つの領域測定を行います。
         注: タイムラプス記録中に、選択した領域から卵母細胞が移動しないようにします。これは卵母細胞の動きを引き起こし、記録を歪める可能性があるため、極体押出の周りの領域測定の配置に特別な注意を払ってください。
      2. 最初に [ログを開く ] をクリックし、[ ログ データ ] をクリックしてデータ分析ソフトウェアをエクスポートして、地域の測定データをスプレッドシートにエクスポートします。
      3. 個々の卵母細胞と測定された時間ポイントごとに、卵母細胞領域の測定値から背景領域の測定値を差し引きます。YFP と mCherry の波長に対しては、これを別々に行います。
      4. 後で参照するために、胚状の小胞破壊(GVBD)と極体押出(PBE)のタイミングを記録します。
         注: GVBD が 2 時間を超えた場合は、マウスの卵母細胞を除外します。
      5. 各卵母細胞が外れ値をチェックするために YFP と mCherry の表現を時間をかけてプロットします。
         注: 滑らかなカーブでない場合は、録音中に卵母細胞が移動したことを示している可能性があります。
      6. 個々の卵母細胞について、記録の最後の10のタイムポイントの平均mCherry表現を計算します。各タイムポイントについて、YFP 式を平均 mCherry 式で割って、注入されたボリュームを補正し、個々の卵母細胞の各時間ポイントで YFP/mCherry 比を得る。
      7. 線形回帰によって曲線の傾きを合わせて、特定の時間間隔の翻訳速度を計算します。統計的推論を使用して、翻訳率の差を評価します。

結果

21日齢のC57/BL6マウスのI逮捕卵母細胞を否定したプロフェイズI逮捕卵母細胞は、Il-7の3'UTRとmRNAコードmCherryの3'UTRに融合したイペットレポーターをコードするmRNAを含むレポーターミックスを注射した。YFPとmCherryの発現は39個の卵母細胞に記録され、そのうち30個が成熟し、9人が陰性対照として相Iで逮捕された。3つの成熟卵母細胞は、GVBDが遅れたか(N =2)か、録音中に皿内を移動したため(N=1)ため、分析のために除外された。 図3 は、フェーズIおよび成熟卵子におけるmCherryおよびYFP発現を示す。 図4 は、注入された体積を補正するためにプラトー式mCherry発現(最後の10時点で平均mCherry発現)を補正した成熟卵母細胞のYFP発現を示す。レポーターの翻訳速度は、カーブフィッティング(線形回帰)のYFP/mCherry値をプロフェーズIで、そしてシロスアミド放出後の最初の0〜2時間または8〜10時間の間に卵母細胞を成熟させて測定した(

ディスカッション

提示された方法は、インビトロ卵母細胞のmeiotic成熟中に異なる遷移における標的mRNAの翻訳の活性化および抑制を研究する戦略を記述する。IL-7は、卵母細胞-cumulus細胞通信^8,13に関与し得る卵母細胞によって放出されるサイトカインを、この方法を記述する目的で選択した。IL-7は卵母細胞成熟⁸中にますます翻訳されることが知られており、この方法を用いた翻訳活性化の良好な可視化を可能にする。しかし、実験全体を通して一定の速度で翻訳が行われると、レポーターの蓄積は線形パターンに従い、実験の開始と終了の翻訳速度は類似します。この結論は、全体の記録間隔を通して線形回帰の適合度(R)によって検証することができる。記者の翻訳における抑圧は、YFP信号の高原として自分自身を提示します。

3'UTR翻訳の抑圧の一例は、Luongらの研究で見つけることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<培地>
ウシ血清アルブミン粉末Bioxtra	Sigma-Aldrich	SIAL-A3311
シロスタミド	EMDミリポア	231085
MEM alpha	Gibco	12561-056
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M2645
ペニシリン-ストレプトマイシン 100x 溶液、滅菌フィルター付き	Genesee Scientific Corporation (GenClone)	25-512
重炭酸ナトリウム	JT-Baker	3506-1
ピルビン酸ナトリウム	Gibco	11360-070
超純純蒸留水	Invitrogen	10977-015
YFP/3' UTRおよびmCherry
Agarose	Apex Biomedical	20-102QD
カルベニシリン二ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	C1389-1G
Choo-Choo クローニングキット	McLab	CCK-20
CutSmart バッファー (10x)	New England Biolabs	B7204
DNA ローディング色素 (6x)	Thermo Scientific	R0611
dNTP Solution	New England Biolabs	N0447S
DpnI	New England Biolabs	R0176
GeneRuler 1 kb DNAラダー	Thermo Fisher	SM1333
LB 寒天プレート 100 µg/mL カルベニシリン、テクノバ	Teknova	L1010
LB Medium (Capsules)	MP Biomedicals	3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Life Technologies	AM1908
MfeI-HF 制限酵素	New England Biolabs	R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit	Invitrogen	AM1344
Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ	ニューイングランド バイオラボ	M0530
ポリ(A) テーリング キット	Invitrogen	AM1350
QIAprep スピン ミニプレップ キット	Qiagen	27106
QIAquick ゲル抽出キット	Qiagen	28704
S.O.C. 中型	サーモフィッシャー	15544034
TAE バッファー	エイペックス・バイオメディカル	20-193
超高純度臭化エチジウム溶液	Life Technologies	15585011
卵子コレクション
アスピレーター 校正済みマイクロピペット用チューブアセンブリ	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
校正済みマイクロピペット	Drummond Scientific Company	2-000-025
PMSG-5000	マイバイオソース	MBS142665
プレシジョングライド ニードル 26 G x 1/2	BD	305111
リンジ 1 ml	BD	309659
Oocyte micro-injection
35 mm ディッシュ |No. 0 カバースリップ |ガラス径20 mm |コーティングされていない	MatTek	P35G-0-20-C	タイムラプス顕微鏡用
フィラメント付きホウケイ酸ガラス	サッター機器	BF100-78-10
胚培養用オイル	アーバイン・サイエンティフィック	9305
ペトリ皿	ファルコン	351006	マイクロインジェクション用
組織培養皿	ファルコン	353001	卵子のインキュベーション用
VacuTip Holding Capillary	Eppendorf	5195000036
Software
BioRender	BioRender		1S
MetaMorph, version 7.8.13.0	分子デバイス		タイムラプス顕微鏡では、3' UTR翻訳の解析