生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

サマリー

このプロトコルは、強力な3Dイメージング技術であるシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)を使用するための日常的な方法を概説しています。SBF-SEMヒンジの適用に成功し、適切な固定および組織染色技術に加え、イメージング設定を慎重に検討します。このプロトコルには、このプロセス全体に対する実用的な考慮事項が含まれています。

要約

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)は、数百から数千の連続登録された超構造画像の収集を可能にし、組織微小解剖学の前例のない3次元ビューを提供します。SBF-SEMは近年、使用が急激に増加していますが、このイメージングモダリティの成功には、適切な組織調製やイメージングパラメータなどの技術的側面が最も重要です。このイメージングシステムは、デバイスの自動化された性質から恩恵を受け、イメージングプロセス中に顕微鏡を放置することができ、1日で何百もの画像を自動収集することができます。しかし、適切な組織製剤がなければ、細胞の超構造は、誤った結論や誤解を招く結論が導かれるような方法で変更することができます。さらに、画像は、樹脂組み込み生物学的サンプルのブロック面をスキャンすることによって生成され、これはしばしば対処しなければならない課題と考慮事項を提示します。「組織充電」と呼ばれるイメージング中のブロック内の電子の蓄積は、コントラストの喪失と細胞構造を理解できないことにつながる可能性があります。さらに、電子ビームの強度/電圧を上げたり、ビームスキャン速度を下げたりすると画像解像度が向上しますが、これはまた、樹脂ブロックを損傷し、イメージングシリーズの後続の画像を歪めるという不幸な副作用を持つことができます。ここでは、細胞の超構造を維持し、組織の充電を減少させる生体組織サンプルの調製のためのルーチンプロトコルを提示する。また、組織ブロックへのダメージを最小限に抑えた高品質のシリアル画像の迅速な取得に関する画像化に関する考慮事項も提供しています。

概要

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)は、1981年にレイトンによって最初に説明され、樹脂に埋め込まれた組織の薄い部分を切断して画像化できる内蔵のミクロトームで増強された走査型電子顕微鏡を作りました。残念ながら、技術的な制限は、生体組織などの非導電性サンプルが許容できないレベルの充電(組織サンプル内の電子^蓄積)を蓄積したように、その使用を導電性試料に制限した。蒸発した炭素減らされたティッシュの充満で切り傷の間のブロック面をコーティングする間、この画像取得時間およびイメージ貯蔵は、当時のコンピュータ技術が装置によって作成された大きなファイルサイズを管理するのに不十分であったため、問題が残った。この方法論は、可変圧室²を搭載したSBF-SEMを用いて、2004年にデンクとホルストマンによって再検討された。これにより、サンプル内の充電を低減するイメージングチャンバに水蒸気を導入することができ、非導電性サンプルのイメージングは、画像解像度の損失とはいえ実行可能になります。組織調製法およびイメージング法のさらなる改善により、高真空を用いたイメージングが可能となり、SBF-SEMイメージングは、もはや、充電^{3、4、5、6、7、8、9}を放散するために水蒸気に依存しなくなりました。SBF-SEMは近年、使用が急激に増加していますが、このイメージングモダリティの成功には、適切な組織調製やイメージングパラメータなどの技術的側面が最も重要です。

SBF-SEMは、3-5 nm^10、11の小さな平面解像度で、何千もの連続登録電子顕微鏡画像の自動収集を可能にします。重金属を含浸させ、樹脂に埋め込まれた組織は、ダイヤモンドナイフを取り付けた超ミクロトームを含む走査型電子顕微鏡(SEM)内に配置される。平らな表面をダイヤモンドナイフで切断し、ナイフを引き込み、ブロックの表面を電子ビームでラスターパターンでスキャンして組織の超構造の画像を作成します。次に、ブロックは「z ステップ」と呼ばれる z 軸で指定された量 (例えば 100 nm) を上げ、プロセスが繰り返される前に新しいサーフェスがカットされます。このようにして、組織が切り取られると、画像の3次元(3D)ブロックが生成されます。このイメージングシステムは、デバイスの自動化された性質からさらに恩恵を受け、イメージングプロセス中に顕微鏡を放置することができ、1日で何百もの画像を自動収集することができます。

SBF-SEMイメージングは主にブロック面の画像を形成するために後方散乱電子を使用するが、二次電子は、撮像プロセス¹²の間に生成される。二次電子は、ブロックから逃げない後方散乱型電子や一次ビーム電子と並んで蓄積し、ブロック面に局在する静電場につながる「組織充電」を生み出す。この電子蓄積は、画像を歪めたり、ブロックから放出される電子を発生させ、後方散乱検出器によって集められた信号に寄与し、信号対雑音比¹³を減少させる。組織の帯電のレベルは、電子線の電圧または強度を低減させることによって減少させることができるが、またはビームのドウェル時間を短縮するが、これは減少する信号対雑音比¹⁴をもたらす。低電圧または強度の電子ビームを使用する場合、またはビームが各ピクセル空間内に短期間だけ収まる場合、組織から放出される後方散乱電子が少なく、より弱い信号をもたらす電子検出器によって捕捉される。デンクとホルストマンは、チャンバーに水蒸気を導入することによってこの問題に対処し、それによって画像解像度を犠牲にしてチャンバーとブロック面の電荷を低減した。チャンバー圧力が10-100 Paの場合、電子ビームの一部が散乱して画像ノイズや分解能の損失を起こしますが、試料室ではイオンが生成され、サンプルブロック²内の電荷が中和します。サンプルブロック内の電荷を中和する方法は、撮像中にブロック面上に窒素の焦点ガス注入を使用する、またはプローブビーム集荷エネルギーを減少させ^{、6、7、15を集めた}信号を増加させるためにSBF-SEM段階に負の電圧を導入する。ステージバイアスを導入するのではなく、チャンバー圧力や局在窒素注入をブロック表面への電荷蓄積を低減させ、より積極的な撮像設定¹⁶を可能にする樹脂ミックスにカーボンを導入することにより樹脂の導電率を高めることも可能である。以下の一般的なプロトコルは、2010年に発表されたDeerinckら.プロトコルの適応であり、高分解能画像取得^{3、17、18、19}を維持しながら組織の充電を最小限に抑えるために有用であるとわかった組織準備およびイメージング方法論の変更をカバーしている。前述のプロトコルは組織処理と重金属含浸に焦点を当てていますが、このプロトコルはSBF-SEM研究に固有のイメージング、データ分析、および再構築ワークフローに関する洞察を提供します。当研究室では、このプロトコルは、角膜や前部構造を含む多種多様な組織にうまく、再現的に適用されています。 まぶた、涙液および硬直腺、失明および視神経、心臓、肺および気道、腎臓、肝臓、クレマスター筋肉、および大脳皮質/髄質、およびマウス、ラット、ウサギ、モルモット、魚、単層および層状細胞培養、豚、非ヒト霊長類、ヒト20、22、23小さな変更は特定の組織やアプリケーションにとって価値があるかもしれませんが、この一般的なプロトコルは、当社のコアイメージング機能のコンテキストで非常に再現性と有用性が証明されています。

プロトコル

すべての動物は、視力および眼科研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究の研究声明およびヒューストン大学検眼動物取り扱いガイドラインに記載されているガイドラインに従って取り扱われました。すべての動物の手順は、彼らが取り扱われた機関によって承認されました:マウス、ラット、ウサギ、モルモット、および非ヒト霊長類の手順はヒューストン大学動物ケアと使用委員会によって承認され、ゼブラフィッシュの手順はDePauuu大学動物ケアと使用委員会によって承認され、豚の手順はベイラー医科大学動物ケアと使用委員会によって承認されました。ヒト組織に関する研究に関する全てのヒト組織はヘルシンキ宣言に従って取り扱われ、適切な機関審査委員会の承認が得られた。

1. 組織処理

1. 0.4 Mナトリウムカコチル酸ナトリウム粉末をddH₂Oに混合して、0.4 Mのカコチル酸ナトリウム溶液を調製し、バッファーを十分に混合し、pH溶液を7.3に調整します。このバッファーは固定液(ステップ1.3で後述する組成物)、洗浄バッファー、オスミウムおよびフェロシアン化カリウム溶液を作るために使用される。
   注:灌流固定は、多くの場合、固定が急速に、体全体で発生するので、SBF-SEM研究のための固定の最良の方法です。スタディ設計内で灌流固定が不可能な場合は、ステップ 1.3 に進みます。
2. 動物モデル^24、25、26に適切な生理学的圧力で灌流固定^を行^う。これは、ヘパリン化生理食塩水と固定剤を伴う経心連続灌流を介して行われ、それぞれが生物の上の特定の高さ(例えば、100cm)(例えば、100cm)上に置かれ、固定剤が左心室に流れ込み、右心房で作られた切開部から出て出る。目的の組織は、血液が固定剤に置き換えられるにつれて青白くなり、組織のすべてまたは一部がブランシュしない場合、組織が適切に固定されず、超構造が保存されない可能性があります。
3. カミソリの刃または鋭いメスを使用して、2 mm x 2 mm x 2 mm 以下のブロックに組織サンプルをトリミングします。ステップ1.2がスキップされた場合、組織をできるだけ早く浸漬固定できるように迅速にこれを行います。
   1. あるいは、固定液の下で組織を解剖し、浸漬プロセスを完了するために新鮮な固定剤に移す。固定液の最終組成物は、2.5%グルタルアルデヒドおよび2mM塩化カルシウムを含む0.1Mナトリウムカコジレート緩衝液から構成される。固定は最低2時間室温で、最大4°Cで一晩進みます。 可能であれば、ロッカー/チルトプレートを使用して、固定中にサンプルを静かに攪拌します。
   2. あるいは、インバータマイクロ波が利用可能な場合は、1分間、1分間の4サイクルで150ワットの真空下で前述の固定剤で組織を固定する。マイクロ波固定は、組織を迅速に固定し、組織の超構造²⁷を保存するので、ステップ1.3の好ましい方法である。
      注:このプロトコル中に組織が乾燥することは決して許されるべきではない、注意して、ある溶液から次の溶液に迅速に組織を移す必要があります。
4. 固定組織を2mM塩化カルシウムを含む0.1Mカコチル酸ナトリウム緩衝液中の室温で、それぞれ3分間(合計15分)洗浄します。
5. 以下のオスミウムフェロシアン化物溶液を新鮮なものにし、前の洗浄工程中に好ましい。4%オスミウム四酸化溶液(ddH2 Oで調製)を0.2 Mカコチル酸緩衝液中の3%カリウムフェロシアン化物と4mM塩化カルシウムで等量と組み合わせます。前の洗浄ステップの後、この溶液中の組織を暗闇の中の氷の上に1時間置き、ヒュームフードに入れます。
   注:オスミウム四酸化物質は、アンプルに入って来黄色の結晶性物質です。オスミウム四酸化溶液を作成するには、アンプルを開き、ddH₂Oを追加し、結晶が完全に溶解するまで暗闇の中で3〜4時間超音波処理します。オスミウム四酸化溶液は、透明黄色の溶液であり、溶液が黒である場合オスミウムは減少しており、もはや使用すべきではない。
6. オスミウムフェロシアン化物溶液中で組織がインキュベートされている間に、チオカルボヒドラジド(TCH)溶液の調製を開始する。この溶液を新鮮に調製し、1時間オスミウムフェロシアン化物固定期間の終了時に容易に入手できるようにしてください。チオカルボヒドラジド0.1gをddH₂Oの10 mLと組み合わせ、この溶液を60°Cのオーブンに1時間置きます。溶液が溶解していることを確認するために、10分ごとに静かに旋回する。使用前に、0.22 μmのシリンジフィルターを使用してこの溶液をフィルターします。
7. TCHでインキュベートする前に、室温ddH₂O 5xをそれぞれ3分間(合計15分間)洗浄します。
8. 組織を濾過したTCH溶液に室温で合計20分間入れる(図1A-C)。
9. TCHでインキュベーションした後、室温_ddH2Oで各3分間(合計15分)の組織を5x洗浄する。
10. 2%オスミウム四酸化(フェロシアン化カリウムで還元しないオスミウム)を室温で30分間含む_ddH2Oに組織を入れる。これは、ヒュームフードで、オスミウムが光によって減少することができるように暗闇の中で行われるべきです(例えば、アルミニウム箔の下で) (図1D-F)。
11. 四酸化オスミウムインキュベーションに続き、室温_ddH2Oでそれぞれ3分間(合計15分)の組織を5倍洗浄する。
12. 組織を1%酢酸尿素水溶液(ウラニル酢酸粉末_ddH2O中に混合)を冷蔵庫に一晩4°Cで入れる。
13. 冷蔵庫からティッシュを取り出す直前に、新鮮なウォルトンの鉛アスパラギンス溶液を準備します。0.03 Mアスパラギン酸溶液(蒸留水10mLで0.04 gアスパラギン酸)の10mLに0.066gの硝酸鉛を溶解し、1N KOH(蒸留水10mLで0.5611g)でpHを5.5に調整します。
    注意: pHを調整するときに沈殿物が形成される可能性があります。これは受け入れられません。
    1. 攪拌バーを使用して、pHを監視しながら1 N KOHをゆっくりと滴下します。完成した透明な鉛アスパラギンス溶液を60°Cのオーブンで30分間予熱します。沈殿物が形成された場合、溶液は使用できず、別の溶液を準備する必要があります。
14. 冷蔵庫から組織を取り出し、室温_ddH2Oでそれぞれ3分間(合計15分)5倍洗浄する。
15. 洗浄後、温めたウォルトンの鉛アスパラギンス溶液に組織を30分間入れ、温度を60°Cに保ちます。
16. ウォルトンの鉛アスパラギンスでインキュベーションした後、組織を室温_ddH2Oでそれぞれ3分間(合計15分)洗浄する(図1G-I)。
17. 氷冷アセトンシリーズ(30%、50%、70%、95%、95%、100%、100%、および100%アセトン(該当する場合はddH2O)を介して組織を脱水し、シリーズの各ステップごとに10分を許容する。
18. 氷冷脱水系列に続いて、室温アセトンに組織を10分間入れる。
    1. この間、埋め込み812 ACM樹脂を配合する。それはビーム損傷に対してより耐性であるように「ハードミックス」のレシピを使用してください。樹脂を十分に混合し、4時間埋め込み812:アセトン(1:3ミックス)に組織を入れ、続いて812:アセトン(1:1ミックス)を8時間または一晩埋め込み、最後に埋め込み812:アセトン(3:1ミックス)を一晩で埋め込みます。これらの樹脂浸透工程を室温で行います。
19. 翌日、組織を100%Embed 812に入れ、次に新鮮な100%Embed 812で一晩、最後に新鮮な100%埋め込み812に4時間置く。これらの樹脂浸透工程を室温で行います。
    1. 埋め込む直前に、少量の樹脂を混合容器に入れ、樹脂が粉末で飽和するが、まだ液体で粒状にならないまで、カーボンブラックパウダーにゆっくりと混ぜる(木製スティックを攪拌することができます)。それは厚いインクに似ていて、目に見える塊なしで木製の棒からゆっくりと滴り落ちることができるはずです。
20. シリコーンゴム型の組織サンプルを向け、樹脂ブロック内のサンプルの向きが記録され、参照できるように写真を撮ります。シリコンモールドの先端にカーボンブラック飽和樹脂でサンプルを覆い、65°Cで約1時間オーブンに金型を入れます。
    1. 材料を傾斜に置き、組織サンプルを覆う金型の先端に樹脂を含みます。実験/組織サンプル識別子を持つラベルを、樹脂の反対側の端にある金型に配置します(図2A)。
21. オーブンからシリコーンモールドを取り出し、透明な樹脂(カーボンブラックなし)で金型の残りの部分を充填して、ラベルが見える状態を保つようにします。透明樹脂と容易に混ぜないほどカーボンブラックを注入した樹脂を硬化する。
    1. ティッシュを含まない型の中に余分な井戸を準備する。余分な井戸から始まり、透明な樹脂で金型の残りの部分を埋めます。
    2. カーボンブラック注入樹脂が透明樹脂にブリードし始めた場合は、シリコーンモールドをオーブンに戻して追加時間(例えば、15分)置きます。
    3. すべての組織サンプルに透明な樹脂がトッピングされたら、シリコーンモールドをオーブンに戻し(平らで、傾斜なし)65°Cで48時間硬化プロセスを完了します。

2. ブロックの準備

注: この方法は、サンプルがブロック内でどのように向き付けされているか、および断面がどのように行われるかによって異なります。しかし、最も一般的な組織の配向は、樹脂ブロックの先端に中心となる組織を見つけ、樹脂ブロックの長い端に垂直である。

1. ほとんどの場合、まず、ブロックの端部をトリムして、標本ブロックをミクロトームチャックに入れ、テーパーエンドをチャックから約5〜6mm突き出して組織を見つけます。セットネジで所定の位置にロックし、ヒートランプの下に置きます。
2. 数分後にブロックは可鍛性があり、簡単にトリムできます。分型顕微鏡ホルダーにチャックを置き、ティッシュが見えるまで薄いセクションをブロック面と平行にするために新しい二重刃のカミソリの刃を使用する。これは、ブロック面を横切って光を釣ることによって最もよく見られ、組織サンプルは、組織を欠いている樹脂のそれらの部分に比べて、より少ない反射および粒状になります。カーボンブラック飽和樹脂の導入前に採取した組織サンプルの写真を参考に、組織の位置と場所を知る。
3. トリミング目的で1本の検体ピンホルダーを脇に置きます。このピンホルダーは、SEMチャンバに配置されることはありませんので、手袋なしで処理することができ、これはトリミングピンホルダーと呼ばれます。 画像の部屋に置かれる運命の標本のホールダーは手袋なしで触れられてはならない。これは顕微鏡の部屋にグリースおよびオイルを導入することを避ける。
4. トリムピンホルダーにアルミニウム製のピンを入れ、ピンホルダーの上に3~4mm保持したピンの面(平らな面)でセットねじを少し締めます。
5. ピンの面にいくつかの深い十字架の傷を作り、標本を所定の位置に保持するために使用される接着剤のためのより大きな表面積を提供します。アルミニウム製ピンを使用する場合は、このステップに小さなスチール製のフラットヘッドドライバーをお勧めします(図2B)。
6. ティッシュサンプルを含むチャックをヒートランプの下に戻し、樹脂が柔らかく可鍛性になるまで置き、それを実体顕微鏡下のチャック容器に入れます。
7. 両刃のカミソリ刃を用いて、組織試料を含む樹脂ブロックの部分から余分な樹脂を切り取る。最終的にピンに取り付けられた組織ブロックのサイズは直径約3mm、高さ2〜3mmになります。
   1. 約1〜2mmの樹脂ブロックに慎重にカミソリをまっすぐに押し込み、前のカットに等しい深さでレシンブロックに慎重に横方向に押し込みます。組織サンプルを含むブロックの部分を損傷または切り取ることができるので、ゆっくりと細心の注意を払ってこれを行います。2つのカットが合うと、余分な樹脂がブロックから分離します。3 mm x 3 mm の上がった領域が残るまで、樹脂の取り外しを続けます。
8. この最初のトリミングの後、数分間、ヒートランプの下にブロック(チャック内に残る)を置きます。
9. 樹脂が柔らかく可鍛性になったら、ブロックを実体顕微鏡の下に戻します。新しいダブルエッジカミソリブレードを使用して、樹脂ブロックの上部を切り落とし、トリミングされた部分の約1mm下に、単一の滑らかなカットで切断します。これは、試料のピンに接着されますので、平らな表面が好ましいです。このステップでは、ブロックの除去された部分に転送され、飛び去ることができるいくつかの力が必要となるため、サンプルが失われないように注意してください。カットとトリミングしたサンプルは脇に置きます。
10. 切断したアルミニウムピンを含むトリミングピンホルダーを立体型レセプタクルに入れる。シアノアクリル酸接着剤の薄い層をピン面に塗布し、目に見える半月板を形成することなくピンを完全に覆います。鉗子でティッシュブロックのトリミングされた部分を拾い、ピンの面に置きます。組織サンプルを検体ピンの上に中央に置きます。押し下げて数秒間押し続けます。接着剤を数分間設定します。
11. 接着剤が完全に乾燥したら、トリミングピンホルダーを実体顕微鏡の下に戻します。細かいファイルを使用して、余分な樹脂をファイルし、ピンに樹脂が張り出さないようにします。樹脂の形状は、円形のピンヘッドに似ているはずです。
12. あなたの樹脂ブロックの上げられた部分のティッシュを見つける、斜めの照明はこのために有用である。二重エッジカミソリを使用して、組織サンプルを含む樹脂の隆起部分を^1mm2以下の領域にトリミングする必要があります。可能であれば、ブロック面はさらに小さくトリミングすることができ、これはダイヤモンドナイフのストレスを軽減し、その長寿を改善します。
    1. できるだけ多くの余分な樹脂を取り除き、ブロックを1次元に少し長く残します。これは、あまりにも多くの力が加えられる場合に組織サンプルを含む樹脂が分解することが可能であるため、ゆっくりと注意して行われます。カミソリを推奨しますが、このステップには細かい金属ファイルを使用できます。
13. 過剰な樹脂を細かい金属ファイルの角度で、組織試料を含む上げ部の外側の領域において、ピンの端に向かって下降する(図2C)。
14. 銀色の塗料を塗布する前に、準備したサンプルから樹脂の粒子とほこりを取り除き、金スパッタリングを施します。銀とアセトンを混ぜて、マニキュアに似た液体(ただし、アプリケーターから滴り落ちるほど薄くない)になるようにし、サンプルブロック表面全体に薄いコートを塗ります。アセトンは急速に蒸発するので、銀色の塗料が増え始めると、アセトンを追加する必要があるかもしれません。
    1. 顕微鏡に積み込む前に、銀色の塗料を一晩乾燥させます。
       注:この銀の層は、1 mm x 1 mm を超えてブロック面を拡大しないように薄くする必要があり、銀色の塗料がダイヤモンドナイフを損傷したことがないが、ダイヤモンドナイフの寿命を維持するために、より小さなブロック面を引き続き推奨します。銀と混合したアセトンは、光学器にアセトン蒸気を導入しないように、金スパッタリングまたはサンプルを顕微鏡にロードする前に完全に蒸発する必要があります。
    2. 銀色の塗料の適用に続いて、サンプルブロックに金の薄い層を適用します。標準の金箔ターゲットを装備した標準的な真空スパッタリング装置を使用して、200ミリトール(アルゴンガス)と2分間実行する40ミリアンペアのチャンバー圧力は、20 nmの厚い金のコーティングになります。
15. コーティング後、取り付けられたトリミングされたブロックを適切な実験ラベルを取り付けたチューブに入れてください。使い捨て可能な移動ピペットを使用してカスタムチューブを作成します。
    1. 転写ピペットを球根のすぐ下に切り、転写ピペットチューブの短い部分を球根端の下に取り付けたままにします。切り取った管状部分を短くし、ピペットチップを十分に切り戻して、アルミニウム製の標本ピンを内側にぴったりと押し込むことができます。
    2. アルミニウム製の試料ピンを含む端部を、変性転写ピペットの球根端に入れる。
16. 準備されたティッシュブロックをロードする前に、ブロック面の表面から余分な銀色のペンキを慎重に切り取る。

3. ブロック面をイメージングするための SEM 設定

注: 以下の画像設定は、著者が使用するデバイスで作成されたもので、提供されている 資料表 に記載されています。この装置は可変的な圧力のイメージ投射が可能である間、最もよい結果は高真空の下で捕獲された。

1. ドウェルタイム: シリアル断面の際は12μs/pxを使用してください。対象領域が特定されると、32 μs/pxで高解像度の画像を取得できます。
2. 真空設定: 9e-008 Paの銃圧力、1.1e-004 Paの柱圧力、および9.5e-002 Paのチャンバー圧力を使用してください。
3. キャプチャ時間: 上記の設定では、イメージあたり 50 秒のレートで 2048x2048 px のイメージ スタックをキャプチャします。対象領域の高解像度画像は、画像あたり 9 分弱で 4096x4096 px でキャプチャできます。
4. 断面の厚さ: 100-200 nm を使用します。少ないは可能ですが、低いビーム電圧、強度、またはドウェル時間を必要とする場合があります。
5. 高電圧(HV):7-12 kVを使用してください。電圧を大きくするとスポットサイズが小さくなり、解像度が高くなりますが、ビーム損傷の可能性が高まります。高いkVは細部の損失をもたらすビームの浸透を増加させる。しかし、kVを下げると、信号対雑音比(図3)14が低下する。
6. ビーム強度(BI): 著者のSBF-SEM装置は1から20までの範囲のビームの強度のスケールを提供する。このスケールでは、5-7の値は、過度の充電やビーム損傷なしで品質の画像を与えます。ただし、BI の解像度が高いほど、充電やビームダメージ¹⁴が発生する可能性が高くなります。
7. スポットサイズと画像倍率: ビーム強度と電圧レベルでスポットサイズを決定します。スポット サイズは、使用するピクセル サイズよりも大きくならないのが理想的です。ピクセル サイズは、視野 (FOV) をピクセル数で割ることによって決まります。たとえば、25 μm の FOV の画像サイズが 2048x2048 ピクセルの場合、ピクセルあたり 12.2 nm になります。したがって、スポット サイズは 12.2 nm 以下にする必要があります。 図4 は、HV、BI、スポットサイズがどのように関連しているかを示しています。
8. 作動距離(WD) - ブロック面イメージングでは、作業距離は調整できません。それは単に焦点の要因です。これは、イメージ化されたすべてのブロックでほぼ同一になります。作動距離は調整できませんが、キャプチャした画像の解像度において重要な役割を果たします。作業距離が短くなるほど、キャプチャした画像の解像度制限が大きくなります。場合によっては、イメージングチャンバー内で変更を行うことで作業距離を短くすることができる場合もありますが、これらの変更はユーザーの裁量で行う必要があります。作業距離を短くして画像解像度を高めるために、ドアマウントミクロトームネジを緩め、ネジを締め直した後、ビーム検出器に約2mm近く置くようにミクロトームを再配置しました。
9. 解像度 - 上記の設定を使用して、3.8 nmの高いxとyの解像度が可能です。解像度は、ビームスポットサイズと画像キャプチャのピクセル解像度によって制限されることに注意することが重要です(例えば、2048x2048ピクセル画像で撮影された20μmの視野は、3.8nmのスポットサイズを使用した場合でも、ピクセル解像度は9.8nmです)。z平面における画像解像度は断面厚さに依存しており、100-200 nmはこのプロトコルでうまく機能することがわかります。

結果

マウスコルネア
このプロトコルは、マウス角膜に広く適用されています。SBF-SEMイメージングを用いて、エラスチンフリーマイクロフィブリル束(EFMB)のネットワークが成体マウス角膜内に存在することが示された。以前は、このネットワークは胚性および出生後早期の発達中にのみ存在すると考えられていました。SBF-SEMは角膜全体に広範なEFMBネットワークを明らかにし、断面で測定すると個々の繊維の直径は100〜200nmであることが判明した。また、このEFMBネットワークは、角膜細胞と密接に関連する繊維を持ち、角質細胞表面上の浅い内層に横たわっている異なる層に編成されていたことも明らかになった(図5)。成体角膜におけるEFMB繊維の発見は、免疫金標識透過電子顕微鏡(TEM)に至り、このネットワーク²³の性質をさらに理解するための蛍光および共焦点研究である。

このプロトコルのさらなる応用は、間質上皮境界で基底上皮細胞と融合する、これまで知られて...

ディスカッション

この方法論文の目的は、当社の研究室が高解像度のシリアル電子顕微鏡画像を確実にキャプチャすることを可能にした組織調製法とイメージング方法論を強調し、この結果につながる重要なステップと、SBF-SEMイメージングを行う際に起こり得る潜在的な落とし穴を指摘することです。このプロトコルを使用して成功するには、組織の適切な固定、サンプルへの重金属の含浸、充填樹脂の改質による充電の低減、画像収集に使用される顕微鏡およびイメージング設定の理解が必要です。「品質、品質アウト」は、SBF-SEMイメージングに適した公理です。SBF-SEMの目標は、多くの場合、超構造詳細の評価または定量化であるため、組織の歪みが発生しないように、固定戦略に特別な注意を払う必要があります。サンプルの調製の任意の時点で組織が歪んだ場合(すなわち、細胞形態の腫脹、縮小、または破壊を受ける)、組織の再構成および量子化は正確なデータを得ない。さらに、誤ったイメージング設定を使用すると、SBF-SEMイメージングが破壊プロセスであるために再キャプチャできないデータの損失につながる可能性があります。また、繊細なダイヤモンドナイフは急いでまたは誤ったサンプル調製によって損傷を受ける可能性...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1/16 x 3/8 アルミ リベット	工業用リベット &ファスナー(株)	6N37RFLAP/1100	試料ピンとして使用します。
2.5mmマイナスドライバーWiha	品質ツール	27225
アセトン	電子顕微鏡科学	RT10000	銀塗料を希釈するために使用されます。
アスパラギン酸	Sigma-Aldrich	A8949
塩化カルシウム	FisherScientific	C79-500
導電性シルバーペイント	テッド・ペラ	16062
デントン デスク - II 真空スパッタリング装置 標準金箔ターゲットを装備	デントン真空	N/A	これは、著者が使用する金スパッタリング装置であり、代替は許容されます。
両刃のカミソ	フィッシャーサイエンティフィック	50-949-411
812	電子顕微鏡科学	14120
Gatan 3View2 テスキャン Mira3 電界放出型 SEM	Gatan &Tescan	N/A	これは著者が使用するSBF-SEMデバイスであり、代替は許容されます。
ガラスシェルバイアル、0.5 DRAM (1.8 ml)	電子顕微鏡科学	72630-05
グルトアルデヒド	電子顕微鏡科学	16320
ゴリラ瞬間接着剤 - インパクトタフ	NA	NA	本文ではシアノアクリレート接着剤と呼ばれています。
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	本文ではカーボンブラックと表記されています。
KOH	フィッシャーサイエンティフィック	18-605-593
硝酸鉛	フィッシャーサイエンティフィック	L62-100
マイクロ波	ペルコ	バイオウェーブプロ	これは著者が使用するマイクロ波であり、代替は許容されます。
四酸化オスミウム	Sigma-Aldrich	201030
フェロシアン化カリウム	Sigma-Aldrich	P9387
シリコーン埋め込み金型	テッドペラ	10504
カコジル酸ナトリウム三水和物	電子顕微鏡 科学	12300
Samco Transfer ピペット	サーモフィッシャー サイエンティフィック	202	試料ピンの製造に使用保存チューブ。
スイスパターンニードルファイル	電子顕微鏡科学	62115
チオカルボヒドラジド	Sigma-Aldrich	223220
ウラニルアセテート	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	図5-7および図9にある再構成を作成するために使用しました。
フィジー(フィジーは単なるImageJです)	ImageJ.net	N / A	TrakEM2をフィジーに追加して、手動セグメンテーションをアシストできます。
顕微鏡画像ブラウザ(MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source &ノッティンガム大学	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	バーチャルリアリティでの再構成とヒストグラムベースの再構成方法が可能です。