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方法論記事

新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

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DOI：

10.3791/62046

⸱

2021年6月9日

 ,  ,  , 
1Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究は、外植物の取り扱い中にレチナル完全性を損なうことを防ぐ新しいヒトの妄想性レチナルカルチャー(HORC)モデルの開発を目的としている。これは、上層の色素および下層の網膜色素上皮-脈絡膜(RPE-脈絡膜)および皮膜で網膜を培養することによって達成される。

要約

以前のヒトの組織性網膜培養(HORC)モデルは、剥離網膜を利用してきました。しかし、網膜色素上皮脈絡(RPE-脈絡膜)および強膜によって与えられる構造的支持能がなければ、脆弱な網膜の完全性が容易に損なわれる可能性がある。本研究の目的は、レチナの外植体を培養する際に、レチナ、RPE-脈絡膜および皮膜を含む新しいHORCモデルを開発することであった。

虹彩とレンズを取り除くために四肢に沿って周方向に切断した後、4つの深い切開部がアイカップを平らにするために作られた。以前のHORCプロトコルとは対照的に、トレフィンは、レチナだけでなく、RPE-脈絡膜およびスクレラを切断するために使用されました。得られた三重層化外植物を72時間培養した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)は解剖学的構造を評価するために使用され、さらにアポトーシス、ミュラー細胞の完全性および経常性炎症のための免疫組織化学(IHC)によって特徴づけられた。病気の誘発の可能性を確認するために、外植体を高グルコース(HG)および炎症性サイトカイン(Cyt)に曝露し、糖尿病性網膜症(DR)を模倣した。このルミネックス磁気ビーズアッセイは、培養培地中に放出されたDR関連サイトカインを測定するために使用された。

H&E染色は、基礎となるRPE-脈絡膜および強膜を有するレチナル外植体における明確なレチナルラメラおよびコンパクト核を明らかにしたが、基礎構造を有しないレチナは厚さの減少と重度の核喪失を示した。IHCの結果は、アポトーシスおよび再発性炎症の欠如ならびに保存されたミュラー細胞の完全性を示した。Luminexアッセイは、HG+Cytに曝露されたレチナル外植体におけるDR関連の炎症促進サイトカインの分泌が24時間のベースラインレベルに対して有意に増加することを示した。

我々は、アポトーシスやレチナル炎症を伴わずにレチナル完全性を維持する新しいHORCプロトコルの開発と特徴付けに成功した。さらに、HG+Cytにレチナル外植物質を曝露する際のDR関連プロ炎症バイオマーカーの誘導分泌は、このモデルが臨床的に翻訳可能な疾患研究に使用できることを示唆している。

概要

レチナは、入ってくる光エネルギーを電気信号に変換する高度に特殊化された眼構造であり、その後、視覚のために脳によって処理されます。ヒトのレティナは、細胞型のダイナミックレンジを含んでおり、シナプス2層と3つの核層1からなる独特な層構造で高度に組織化されている(図1)。レチナル恒常性は、神経レチナル細胞、血管、神経、結合組織およびRPE1との間の複雑な接続によって支えられています。高度な腎解剖学と生理学のために、多くの疾患のメカニズムはまだ十分に理解されていない2,3,4,5.より良い疾患を研究するために、HORCモデルは6、7、8、9を開発しました。動物実験やインビトロ培養と比較して、HORCモデルは、動的な細胞環境と複雑な神経血管相互作用をその場で保持し、臨床翻訳のための良いモデルを提供するため有利です。

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図1:人間の眼の後眼構造後部に対する前部、眼窩層は、神経線維層(NFL)、神経節細胞層(GCL)、内神経叢層(IPL)、内核層(INL)、外プレキシフォーム層(OPL)、外核層(ONL)、感光体内層(IS)、および感光体外層(OS)である。この細胞内の細胞には、神経節細胞(青)、アマクライン細胞(黄)、双極細胞(赤)、水平細胞(紫)、ロッド感光体(ピンク)および円錐感光体(緑色)が含まれる。このビトレウスは、レチナの前に位置しています。RPE、ブルッフの膜、脈絡膜および強膜は、後部に位置する。なお、画像は、retinaの概略表現であり、各層内の細胞/レチナル接続性の比率は、in vivo設定を示すものではないかもしれない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

以前に特徴付けられるHORCプロトコル6、7、8、9は、外科トレフィンを使用して、基礎となるRPE-脈絡膜および鎖膜からレチナを分離することに関与していた。しかし、これらの基礎構造によって提供されるサポートがなければ、半透明のretinaは薄っぺらになり、取り扱いにくく、鉗子などのツールは容易にその完全性を破壊し得る。さらに、RPEを含まない培養での分離性レチナは、神経節細胞アポトーシスおよび感光体変性10、11、12を引き起こすことが示されている。したがって、retinal完全性の損失を最小限に抑え、in vivo環境をよりよく模倣する代替HORCプロトコルが有用であろう。これは、外植の取り扱い中の身体的傷害が人工物を導入する可能性があるため、疾患のメカニズムを研究する際に特に重要です。そこで本研究の目的は、外植の取り扱いと培養の際のレチナル完全性を保護するために、RPE-脈絡膜と皮膜を含む新しいHORCモデルを開発することであった。

この目的を達成するために、残留性の植物と下層のRPE-脈絡膜と皮膜の間に「挟まれた」植物の再チナリを抽出した。サンドイッチの外植では、網膜剥離と折りたたみを防ぐために網膜の重さを量るのに対し、硬い線維性強膜は構造的支持のための足場と鉗子の接触点の両方として機能する。また、動物モデルは、培養中にRPEを保持することで、残存性の変性やグリア増殖を防ぐことができる、低酸素および炎症10、11、12などの危険信号に対するミュラー細胞の応答を示している。

モデルを特徴付けるために、サンドイッチの残膜外植体をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色し、解剖学的構造を評価し、免疫組織化学(IHC)を実施し、 末端デオキシヌクレオチジルトランスファーーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL、アポトーシス細胞マーカー)、グリア性フィブリリン酸タンパク質(GFAP、眼炎およびミュラー細胞活性化マーカー)、およびミュラー細胞完全性のマーカーであるビメンチンを用いた外植体を標識する。このモデルが分子疾患の徴候を発症するように誘導できるかどうかを判断するために、外植体は、炎症促進性サイトカイン(Cyt)、インターロイキン-1β(IL-1β)および腫瘍壊死因子α(TNF-α)を有する高グルコース(HG)に曝露された。ルミネックスアッセイは、培養培地中に放出されたサイトカインを測定するためにDRモデルで使用された。

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プロトコル

ヒトドナーアイカップは、移植のための角膜切除後、および北B健康障害倫理委員会(NTX/06/19/CPD/AM07)によって承認された後、ニュージーランド国立眼銀行から入手されました。

注:培養は、滅菌組織培養条件を確保するためにクラスIIバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。組織は、有意なレチング完全性の損失を避けるために、死後24時間以内に培養されなければならない。

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図2:サンドイッチの残りの外植体を収集する手順を示す画像。外植の準備のために、切開中の組織の損傷を減らすために、1つの鋭い先端と1つの鈍い端を持つ解剖用はさみを使用し、鈍い端が地球の内側に向けて使用します。また、取り扱い中に眼内組織を傷つけないように、鈍い端を持つ鉗子を使用してください。外科的なはさみを使用して、鈍い端が内側を向いて、虹彩とレンズ(A-C)を取り除くために手足に沿って切る。ONHは、開いた眼球(D)をまっすぐに見ると見つけることができます。鈍い先端を持つ鉗子を使用して、強い強い球を保持して地球を安定させる(E)。ONHに向かって2つの深い切開を行うことによって、地球を垂直に2つの半分に分割しますが、ONHを切断しないでください。水平子午線(G)に沿ってこれを繰り返します。強い強い場所に鈍い鉗子を適用し、クローバーの形に穏やかに地球を開く(H-K)。鉗子を使用して、折り畳まれたレティナを滑らかにするために慎重に石膜を操作します, 女性の手引きとして, しかし、直接、retinaに触れないでください(I).網膜剥離や折りたたみを引き起こしている場合は、その除去します(透明な渦が写真にうまく写っていないため、図2には示されていません)。レティナが平坦な領域を見つけ、外科トレフィン(L)を使用してレチンの外植を抽出する。強膜に鉗子を適用し、プリ調製された培養培地(M,N)に慎重にレチナル外植を移す。サンドイッチの外植全体は、その重量のために井戸の底に沈む必要がありますので、各外植は培地(O)に沈む。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1. 接合部からのサンドイッチの伸び物の抽出

  1. 虹彩とレンズを取り外します。
    1. アイリスとレンズを上向きにし、視神経ヘッド(ONH)がペトリ皿に接触して、ペトリ皿の中にアイカップを置きます(図2A)。
    2. 鉗子を使って、眼球をしっかりと持ち続けます(図2B)。
    3. 手足の外縁に沿って周方向に小さな切り傷を作って虹彩とレンズを外します(図2A)。
    4. 虹彩とレンズを注意深く取り外します。操作中にレティナを邪魔しないようにします(図2C)。
      注:レンズは、ゾヌル繊維を介して毛様体に取り付けられているので、アイカップに落ちることはありません。
  2. アイカップを平らにします。
    1. アイカップを直立したまま、ONHを特定します。これは、明るい白色の光源(図2D)で簡単です。
    2. ONH に向かって 4 つの象限を切り込む (図 2E)。ペトリ皿は容易な処理のために回すことができる。ONHをカット しないでください 。
    3. アイカップを慎重に広げて平らにする(図2E)。
    4. レチナの代わりに強膜に鉗子を適用して、レチナルの完全性を乱さないようにします。
      注:周辺網膜剥離と折りたたみは、あふれる渦の重量が網膜を引っ張るように避けられません。これらの領域では、さらにレチンの折り畳みを防ぐために、ビトレウスを除去します。残存の亜塩素を残して、RPE-脈絡膜および皮膜の上にレチナを安定化させる。
  3. サンドイッチの植物を収集します。
    1. レチンの折り目のない領域のレティナに外科的トレフィンを置く(図2F)。
    2. 強く押して強い強音を貫通し、クラッキング音を発生させる必要があります。
    3. トレフィンを180°ずつねじって、強膜が完全に貫通し、残りの組織から外植が分離されるようにします。
    4. 強膜で鉗子を塗布し、サンドイッチの残りの外植物を培養培地に移す(図2G-I)。
    5. 各象限の末梢性レチナから2-3サンドイッチの残りの外植を得る。
      注:サンドイッチのレチン外植は時々トレフィンの開口部に閉じ込められることがあります。鉗子を使用して、強気部の基部の小さな部分をそっといじめます。これは、ブレードが鈍く、失いが生じる場合に発生することがよくあります(図3A-C)。
    6. ブレードが鈍くなるので、1-2のレチナル外植を切り取った後に新しいトレフィンを使用します(図3Cfigure-protocol-2
      図3: トラブルシューティング抽出プロセス中に、レチン外植は、外科的トレフィンの開口部に閉じ込められる可能性があります(A)。レチナ(B)に触れることなく、スクレラの基部から組織を優しくいじめる。これは、外科トレフィンが2つ以上のレチナル外植植物を抽出するために使用される場合、より頻繁に起こり得る。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
  4. 植物の植物を培養する。
    1. Dulbeccoの修飾イーグル培地栄養混合物F-12(DMEM-F12)と1x抗生物質と抗ミコティック混合物(AA、100x株)を含む培地を調製します。
    2. 外植抽出の前に、培地500μLを24ウェルプレートのウェルに入れ、インキュベーターで平衡化します。これは、後で培地を添加すると、レティナを取り除くことができるので重要です。
    3. サンドイッチのレチナル外植を37°Cで最大72時間、ステップ1.4.2で調製した培地で加湿した5%CO2インキュベーターで培養する。
    4. DR様変化を誘発するために、シト、TNF-α(10 ng/mL)およびIL-1β(10ng/mL)と32.5mM HGを組み合わせたDMEM-F12を含む培地中の培養レチン性外植体。

2. サンドイッチの残りの外植物のパラフィン埋め込み

  1. サンドイッチの残りの外植を修正します。
    1. サンドイッチのレチンの外植を10%ホルマリンに少なくとも24時間浸漬する。
    2. ホルマリン溶液を取り出し、サンドイッチの脱トナーを組織パッドとカセットにそっと移します。
    3. サンドイッチの残りの外植を70%エタノールに少なくとも24時間浸します。
    4. パラフィン埋め込みレチンの外植物をブロックにする。
    5. ミクロトームを使用して、パラフィン埋め込まれたレチナル組織を5μmの厚いセクションに切り、ガラススライドに取り付けます。イメージングまで室温で保管します。
  2. セクションを分離します。
    1. 70%キシレンに5分間浸します。
    2. セクションを100%キシレンに5分間浸します。
    3. 70%エタノールで5分間水分補給を行います。
    4. 5分間、100%エタノールで切片を水分補給します。
    5. 水道水の下のセクションを10分間洗います。

H&E、IHC、磁気ルミネックスアッセイを用いた特性評価

  1. H&E染色プロトコル
    1. ステップ 2.2 を使用してセクションを分離します。
    2. 水道水で5分間水を入れます。
    3. ギルの2ヘマトキシリン溶液のセクションを5分間染色します。
    4. 余分な汚れを取り除くために水道水を流す下でセクションを十分に洗ってください。
    5. 1%の酸アルコールに2回浸漬して差別化する。
    6. 水道水の下で素早くセクションを洗います。
    7. 1%炭酸リチウム(10mg/mL)に6回浸漬して、切片を青色に染色する。
    8. 余分な青い汚れを取り除くために5分間水道水を流してセクションを十分に洗います。
    9. セクションを1%のエオシンに10回浸します。
    10. 水道水の下で切片を素早く洗い、余分な汚れを取り除きます。
    11. 100%エタノールに10回浸漬して、切片を脱水する。これを2回行います。
    12. 70%キシレン10回に浸します。
    13. 100%キシレン10回にセクションを浸します。
    14. ジブチルフタレートポリスチレン(DPX)実装媒体を使用したカバースリップ付きマウント。
    15. 軽顕微鏡を使用して画像を撮ります。
  2. IHC ラベリング プロトコル'
    1. ステップ 2.2 を使用してセクションを分離します。
    2. スライドを、pH 6.0で0.05%Tween 20の10 mMクエン酸ナトリウムバッファーを含む溶液に入れ、121°Cで自動化された圧力鍋で2分間抗原検索を実行します。
    3. リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で5分間洗浄します。これを3回行います。
    4. 0.1%トリトンX-100と10%の通常のヤギの血清を室温で1時間含有するPBSでセクションをブロックします。
    5. 一次抗体を二次抗体に結合させた一次抗体を用いて、4°Cで一晩の切片をインキュベートする(材料表)。
    6. PBSで5分間セクションを洗います。これを3回行います。
    7. 4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を2分間使用した染色核。
    8. アンチフェード試薬を使用してセクションを洗浄し、マウントします。
    9. マニキュア付きシールカバーリップ。
    10. 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して画像を撮ります。
  3. 磁気ルミネックスアッセイ
    1. 各ウェルから75 μLのメディアを24時間と72時間で96 μ-底プレートに移します。
    2. ルミネックスサイトカインアッセイを用いて、24時間および72時間後にIL-18、IL-6、IL-8および血管内皮成長因子(VEGF)の細胞上清を分析する。アッセイ16を実行するには、メーカーの指示に従ってください。

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結果

このHORCモデルでは、レチナル完全性が維持されました。レティナルインテグリティは、培養サンドイッチの残膜外植で保存されたが、隣接する構造なしで培養されたレティナで失われた。H&Eは、培養中の72時間後に切除サンドイッチの残りの外植物の構造的完全性を調べるために行われました。サンドイッチの残りの外植は、INLとONLのコンパクトな核を持つGCLからONLまでの保存された完全性と明確なラメラ構造を示した(図4A)。しかし、網膜の完全性が乱れたのは、網膜が基礎となるRPE-脈絡膜および鎖骨から剥離し、網膜の厚さおよびINLの減少および核の断絶を示す同じサンプルの端で発見された(図4B)。

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ディスカッション

HORCは現在、前臨床の臨床前の研究で最も臨床的に翻訳可能なモデルです。in vitro細胞培養モデルと比較して、HORCは、動的なレチナル細胞タイプおよびニューロンとのそれらの接続を保持することによって、ヒトのレチナの解剖学的構造をより良く表すことができる、 血管系および細胞外環境19。動物モデルと比較してHORCは、動物モデル19の陽性結果にもかかわらず、異なる網膜細胞型、異なる感光体密度および割合などの種間変動によるヒト網膜疾患の病態生理学を研究し、設計する上でより有利である。しかし、以前のHORCプロトコルでは、網膜は意図的にRPE-脈絡膜およびスクレラから切り離された。タフな強膜がなければ、薄っぺらなretinaは扱いにくく、鉗子6、7、8、9によって直接処理されれば、レチナの完...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、眼組織の寛大なドナーとニュージーランド国立眼科銀行のチームの支援に感謝したいと考えています。この研究は、モーリス・アンド・フィリス・ペイケル・トラストとオークランド医学研究財団(1117015)からのプロジェクト助成金によって財政的に支援されました。IDRの取締役はブキャナン慈善財団の支援を受けています。CKの奨学金はニュージーランド検眼医教育研究基金(CC36812)によって提供され、HHLの奨学金はブキャナン慈善財団によって提供されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
使い捨て生検パンチ (5 mm)Integra York PA Inc., USA21909-142この記事では外科用トレフィン
と呼ばれ
。ヒト組換えIL-1&β;Peprotech, USA200-01B使用濃度: 10 ng/mL
ヒト組換え体 TNF-aPeprotech、USA300-01A使用濃度:10 ng / mL
DAPI(1 & micro;g/mL)Sigma Aldrich, Germany#D9542核染色.作業希釈率 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA10565018Dulbecco's Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1×抗生物質と抗真菌剤の混合物(AA、100回、在庫)
ファインハサミ-シャープブラントファインサイエンスツール(F.S.T)14028-10チップ:シャープブラント、刃先:27mm、長さ:10cm、合金/材質:ステンレス鋼、鋸歯状:いいえ、先端形状:ストレート
グレーフ鉗子ファインサイエンスツール(F.S.T)11050-10長さ:10cm、先端形状:ストレート、先端:鋸歯状、先端幅:0.8mm、先端寸法:0.8×0.7mm、合金・材質:ステンレス鋼
マウスモノクローナルGFAP-Cy3Sigma Aldrich、ドイツ#C9205Cy3に結合した一次抗体。作業希釈率1:1000。
マウスモノクローナルVimentin-Cy3Sigma Aldrich、ドイツ#C9080Cy3に結合した一次抗体。作業希釈率1:50。
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)Sigma Aldrich, Germany#11684795910Fluorescein-dUTPに結合した一次抗体。酵素緩衝液で1:10の作業希釈。
ています

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