ここでは、その蛍光におけるRNA蛍光をその蛍光(RNA-FISH)と免疫蛍光と組み合わせて、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化する簡単な方法を説明する。このプロトコルは、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2 RNA-宿主相互作用の分子特性の理解を深める可能性がある。
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この記事について
サマリー
要約
この原稿は、ヒト気道上皮の細胞株および三次元(3D)培養における重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化するために、免疫蛍光と組み合わせたその場ハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)のプロトコルを提供する。この方法は、プローブの局在化によって開始されたHCRに依存することにより、ウイルスRNAの非常に特異的で敏感な視覚化を可能にする。スプリットイニシエータプローブは、蛍光標識増幅器によって信号を増幅するのに役立ち、共焦点顕微鏡ではごくわずかなバックグラウンド蛍光を生み出します。異なる蛍光色素を用いたラベリングアンプは、様々なターゲットの同時認識を促進します。これにより、組織における感染のマッピングが、単細胞レベルでのウイルス病因および複製をよりよく理解することを可能にする。この方法を免疫蛍光と結合すると、宿主エピゲノムの交わりや免疫応答経路を含む宿主とウイルスの相互作用についての理解を深めることができます。このプロトコルは、敏感で特定のHCR技術により、診断ツールとしても使用できます。また、この技術は、将来出現する可能性のある非コードRNAおよびRNAウイルスを含む任意のRNAの検出を可能にするために容易に改変される可能性があることを覚えておくことも重要です。
概要
SARS-CoV-2は、2019年末に出現した新しいヒトベタコロナウイルスであり、数ヶ月後に前例のないパンデミックを引き起こしました。ウイルスは科学に新しいため、その生物学の多くとその宿主細胞への影響は不明のままである。したがって、感染時のウイルス細胞および-組織トロピズムのマッピングは、その基本的な生物学的特徴および宿主への影響が理解されるべきである場合に重要である。生化学的、生物学的、物理的なアッセイを含むウイルス宿主相互作用を調べるためにいくつかの技術が使用されています。このときハイブリダイゼーションは、細胞または組織内の特定のDNAまたはRNA配列に局部的に局部化する、標識された相補DNA、RNA、または修飾核酸プローブを採用する一般的な方法である。
HCR1を介してシグナル対ノイズ比を増幅することで感度を高める改変を組み込んだ新しいRNA蛍光化法(RNA-FISH)が開発されました。HCRは単一細胞レベルでのRNAの局在の研究を可能にする。この方法は、特異性、感度、解像度が高いため、基礎科学研究だけでなく、診断などの応用プロジェクトにも有用です。最近、この方法の実現可能性は、完全に分化されたヒト気道上皮(HAE)培養2内の毛状細胞に局在するSARS-CoV-2 RNAを検出するための実証された。HAE培養は、「自然感染」微小環境
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プロトコル
1. バッファ準備
- 2x PHEMバッファーの500 mLの場合、 18.14 gのピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)、6.5 gの4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、エチレングリコールテトラ酢酸(EGTA)、0.9gの硫酸(EGTA)を組み合わせます。蒸留水(dH2O)で体積を約400mLまで作り、攪拌し、10Mの水酸化カリウム(KOH)または水酸化ナトリウム(NaOH)を使用してpHを7.0に調整します。最終容積を500 mLまで作り、それから50 mLアリコートに分ける。必要になるまで-20°Cで保管してください。
メモ:pHが7.0に達するまでバッファはクリアされません。 - 37%w/vパラホルムアルデヒド(PFA)のストック溶液を調製します。50 mL の場合、ガラス瓶に PFA 18.5 g と dH2 Oの 35 mL を混ぜます。ボトルを加熱して磁気攪拌機の上に置きます。1 M KOH または NaOH の 900 μL を加え、溶液が明らかになるまでかき混ぜます。冷却し、50 mL円錐遠心分離管に転送することができます。dH2O で最大 50 mL を上にします。溶液は必要になるまで-20°Cで貯えることができる。
注意:ホルムアルデヒドは、保護手袋とラボコートを着用しながら、ヒュームフードで....
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結果
この原稿に記載された免疫RNA-FISHプロトコルは、2つの細胞系を用いて行った:Vero細胞株と3D HAE培養。両方のセルラー モデルの主要な手順を 表 2に示します。HAE培養におけるSARS-CoV-2の可視化のためのRNA-FISHプロトコルには、組織サンプルに典型的なステップ、すなわち、100%MeOHによる透過性およびMeOH-PBSおよび0.1%のトゥイーン溶液の段階的なシリーズによる水分補給が含まれています。免疫蛍光は、RNA-FISHが完了した後に行った。Zstack 画像は取得され、処理されました。
図1 は、SARS-CoV-2に感染したMock-接種対照ベロ細胞または細胞における免疫RNA FISHを示す。 図2 は、SARS-CoV-2に感染したMOCK-接種対照HAE培養.......
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ディスカッション
免疫RNA-FISHはRNAおよび細胞タンパク質の二重染色のための信頼できる方法である。ここでは、細胞株およびHAE培養におけるSARS-CoV-2 RNAおよび細胞タンパク質の検出を可能にする修飾免疫RNA-FISHプロトコルが記載されている。このプロトコルは、細胞単層または特定の組織を含む異なる細胞モデルでの使用に適応することができる。この方法は、適切なプローブローカリゼーションによって開始されるHCRの概念に依存しています。次に、スプリットイニシエータプローブを用いて蛍光標識増幅器によるシグナルの増幅を開始すると、共焦点顕微鏡を用いて観察した場合、蛍光を最小から全く背景にすることが可能になります。アンプは、異なる蛍光色素で標識することができ、さまざまなターゲットを認識するように設計された異なるプローブと互換性があります。したがって、同時に使用することができます。このプロトコルで説明する手順は簡単ですが、時間がかかります(3~4日)。それにもかかわらず、結果は、直接標識された蛍光プローブを使用する他のプロトコルとは異なり、低ノイズ対信号比によって特徴付けられます。
ここでベロ細.......
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開示事項
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
謝辞
この研究は、SARS-CoV-2に関する研究のための科学高等教育省と国立科学センターからの助成金(K.P.とUMO-2018/30/E/NZ1/00874にUMO2017/27/B/NZ6/02488を付与)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 機器 | |||
| 共焦点顕微鏡 LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini ロッカー - シェーカー | フィッシャー サイエンティフィ | 12965501 | |
| インキュベーター Galaxy170R | ニューブランズウィック | CO170R-230-1000 | |
| サーモミキサー コンフォート | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| 材料 | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 カバースリップ | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL チューブ | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12 ウェルプレート | TTP | 92412 | |
| 円錐形遠心分離チューブ | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| パラフィルム | Sigma | P7793-1EA | |
| 血清ピペット | VWR コレクション | 612-5523P, 612-5827P | |
| スライドグラス | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| 試薬 | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-チューブリン | サンタクルス バイオテクノロジー | sc-134234 | |
| DAPI | サーモサイエンティフィック | D1306 | |
| リン酸二ナトリウム | シグマ | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR 増幅バッファー | モレキュラーインスツルメンツ インク | BAM01522 | バッファーも用意可能 doi:10.1242/dev.165753: 補足情報 |
| HCRアンプ B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| HCRアンプ B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| HCRプローブハイブリダイゼーションバッファー | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can also be prepared doi:10.1242/dev.165753: 補足情報 |
| Sars-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCRプローブ洗浄バッファー | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | バッファーも準備できます doi:10.1242/dev.165753: 補足情報 |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| 硫酸マグネシウム七水和物 | Sigma | 63138-250G | |
| メタノール | Sigma | 32213-1L-M | |
| リン酸一カリウム | Σ | P5655-100G | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| 塩化カリウム | Σ | P5405-250G | |
| Prolong Diamond 退色防止 封入剤 | Invitrogen | P36970 | |
| 塩化ナトリウム | BioShop | SOD001.5 | |
| クエン酸三ナトリウム 2-水和 | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| ソフトウェア | |||
| 蛍光Spectraviewer | スペクトルパラメータのモデリング | ||
| ImageJ フィジー | zスタック画像の取得と処理 |
参考文献
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al.
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再版と許可
