ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera (Hübner)胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体同定のプロトコルを紹介します。変異昆虫は、生体内の異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用のさらなる研究を可能にする。
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方法論記事
CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定
この記事について
サマリー
要約
コットンボールワーム、 ヘリカバーパアルミゲラは、世界で最も破壊的な害虫の1つです。分子遺伝学、生理学、機能ゲノミクス、行動研究の組み合わせにより、 H. armigera は鱗翅目Noctuidaeのモデル種となっています。異なる遺伝子間の相互作用のインビボ機能を研究するために、クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/関連タンパク質9(Cas9)ゲノム編集技術は、機能的ゲノム研究を行うために使用される便利で効果的な方法である。本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いて H. armigera の遺伝子ノックアウトを段階的に体系的に完了させる方法を提供する。ガイドRNA(gRNA)の設計および合成について詳細に説明する。次に、ガイドRNA(gRNA)作成のための遺伝子特異的プライマー設計、胚採取、マイクロインジェクション、昆虫飼育、変異体検出からなるその後の工程をまとめる。最後に、遺伝子編集の効率を向上させるためのトラブルシューティングのアドバイスとメモが提供されています。我々の方法は、 H. armigera および他の鱗翅目の蛾におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集の適用のための参照として役立つであろう。
概要
ゲノム編集技術の応用は、多様な種において標的遺伝子変異体を達成するための効率的なツールを提供する。クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/関連タンパク質9(Cas9)システムの出現は、ゲノムを操作するための新しい方法を提供します1。CRISPR/Cas9システムはガイドRNA(gRNA)とCas9エンドヌクレアーゼ2,3からなり、gRNAはさらに標的相補的なCRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)の2つの部分に分けることができます。gRNAはCas9エンドヌクレアーゼと統合し、リボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。gRNAを用いると、Cas9エンドヌクレアーゼを塩基相補を介してゲノムの特定の部位に導くことができる。Cas9のRuvCドメインとHNHドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の3塩基前にゲノムの標的部位を切断し、二本鎖切断(DSB)を作り出します。DNA切断は、非相同末端結合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)4の2つのメカニズムを介して修復することができる。DSBの修復は、標的遺伝子を不活性化する方法として挿入または欠失を導入し、潜在的に遺伝子機能の完全な喪失を引き起こす。したがって、CRISPR/Cas9システム....
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プロトコル
1. 遺伝子特異的プライマーの設計とsgRNAの作製
- 目的の遺伝子内の保存されたゲノム領域を、PCR 増幅およびシーケンシング解析によって検証します。 H. armigera のゲノムDNAから標的遺伝子を増幅し、エクソンとイントロンを区別する。
注:ガイド部位の配列特異性は、オフターゲット遺伝子編集を避けるために必要です。エクソン中の探索可能なガイド部位は、遺伝子の5'UTRに近い。次に、遺伝子が完全に機能していないことを確認することが重要です。sgRNAの調製のための流路の概要を 図1に例示する。 - sgRNAターゲットを選択します。CRISPRオンラインウェブサイト CRISPOR (Version 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py)を使用して、遺伝子の5' UTRに近いエクソン内の可能なガイドサイトを検索します。テキストボックスにエクソン配列を入力し、 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Harm_1.0)の標的ゲノムを選択します。「20 bp-NGG」のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)オプションを選択し、ウェブサイトのユーザーマニュアルに従ってデフォルトのパラメータに他の設定を残します。
- ソフトウェアから予測されたガイドシーケンスを比較し、予測効率が最も高く、ミスマッチが最も少ないガイドシーケンスを選....
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結果
このプロトコルは、CRISPR/Cas9技術を用いて H. armigera の遺伝子ノックアウト株を取得するための詳細な手順を提供する。このプロトコールによって得られた代表的な結果は、gDNA選択、胚採取および注入、昆虫飼育、および変異体検出について要約される。
本研究では、我々の目的遺伝子の標的部位は、その第2エクソンに位置していた(図2A)。この部位は高度に保存されており、合成したsgRNAの標的バンド断片をアガロースゲル電気泳動を用いて確認した(図2B、C、D)。
雄と雌の蛾は、当初、予定より早く交配するのを防ぎ、可能な限り十分な量の胚を確保するために、別.......
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ディスカッション
CRISPR/Cas9システムの適用は、遺伝子機能や様々な遺伝子間の相互作用の解析に強力な技術サポートを提供してきました。ここで提示する詳細なプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集による H. armigera におけるホモ接合体変異体の生成を実証する。この信頼性の高い手順は、 H. armigeraにおける指向性遺伝子突然変異誘発のための簡単な方法を提供する。
CRISPR標的部位の選択は、突然変異誘発効率に影響を与える可能性がある37。このプロトコルでは、オンラインサイトCRISPORからの複数の結果を比較および分析し、適切なターゲットサイトを取得しました。インシリコでは、gRNA予測はいくつかの利点を提示する。まず、彼らはオフターゲットの影響を最小限に抑えるためにsgRNAを設計する際に H. armigera の全ゲノムを解析した。上記のオンラインリソースとCHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)は、多くの鱗翅目ゲノムで機能し、他の.......
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開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学財団(31725023、GW 31861133019、31171912 CY)の支援を受けた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2kb DNAラダー | TransGen Biotech | BM101 | |
| キャピラリーガラス | ワールド 精密機器 | 504949 | プロトコルで「キャピラリーガラス」と呼ばれる |
| 両面テープ | ミネソタ鉱業製造株式会社 | 665 | |
| エッペンドルフ フェムトジェット 4i マイクロインジェクター | エッペンドルフ コーポレート | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 マイクロマニピュレーター | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| 顕微鏡 スライド | セイル ブランド | 7105 | |
| オリンパス顕微鏡 | オリンパス株式会社 | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | 変異体検出に使用 |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
参考文献
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
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再版と許可
