方法論記事

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

DOI：

10.3791/62093

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2021年2月11日

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

調節不整合な腸上皮バリア機能および免疫応答は、生理学的モデルの欠如のために十分に調査されていない炎症性腸疾患の特徴である。ここでは、生体内での粘膜透過性および白血球の採用を研究するために、十分に血管化され、外装された腸セグメントを採用したマウス腸管ループモデルについて述べている。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腸粘膜は、単一の上皮細胞層が並び、光細菌や外因性物質の通過を防ぎながら、栄養素や水の超細胞輸送を可能にする動的バリアを形成する。この層の違反は、発光内容物への透過性の増加と免疫細胞の募集をもたらし、どちらも炎症性腸疾患(IBD)を含む腸内の病理学的状態の特徴である。

多形核好中球(PMN)の上皮バリア機能と経上皮移行(TEpM)を調節するメカニズムは、定量的分析を可能にするインビボ法の実験不足のために不完全に理解されている。ここでは、腸管または近位結腸の外形化された腸管セグメントを採用した堅牢なマウス実験モデルについて説明する。外装された腸ループ(iLoop)は完全に血管化され、上皮細胞単層間の透過性およびPMNの移動を研究するために一般的に使用されるex vivoチャンバーベースのアプローチよりも生理学的な利点を提供する。

我々は、このモデルの2つの用途を詳細に示す:(1)内環注入後の血清中の蛍光標識デックストランスの検出による腸透過性の定量測定、(2)化学誘引剤の侵入導入後に腸上皮を越えて腸内腔に移行したPMNの定量的評価。我々は、このモデルの実現可能性を実証し、コントロールと比較して上皮タイト接合関連タンパク質JAM-Aを欠くマウスにおけるiLoopを利用した結果を提供する。JAM-Aは、炎症反応中に上皮バリア機能とPMN TEpMを調節することが示されている。iLoopを用いた我々の結果は、これまでの研究を裏付け、恒常性および疾患の間に腸透過性およびPMN TEpM in vivoの調節におけるJAM-Aの重要性を強調する。

iLoopモデルは、腸内恒常性および炎症の研究において再現性の高い標準化された方法を提供し、IBDなどの疾患における腸バリア機能および粘膜炎症の理解を著しく高める。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腸粘膜は、単層の柱状腸上皮細胞(IEC)、下層の層の層の下層の下層のプロプリア免疫細胞および筋性粘膜を包含する。栄養素の吸収におけるその役割に加えて、腸上皮は、発光コメンサル細菌、病原体、および食事抗原から身体内部を保護する物理的な障壁である。また、IECとラミネラプロプリア免疫細胞は、コンテキストおよび刺激に応じて耐性または応答のいずれかを誘導する免疫応答を調整します。上皮バリアの破壊は、病的粘膜炎症の発症に先行し、潰瘍性大腸炎およびクローン病1、2、3、4、5、6、7の両方を包含する炎症性腸疾患(IBD)に寄与することが報告されている。潰瘍性大腸炎を有する個体は、多形核好中球(PMN)の過剰な経上皮移行(TEpM)を形成し、陰窩膿瘍を形成し、疾患8、9の重症度に関連していた知見である。侵害された上皮バリア機能と過剰な免疫応答はIBDの特徴であるが、腸粘膜への腸透過性および免疫細胞の配置の定量的評価を行う実験的インビボアッセイが不足している。

腸上皮透過性およびPMN TEpMを研究するために用いられる最も一般的な方法は、半透過性多孔膜挿入物10、11、12に培養されたIEC単層を用いたex vivoチャンバーベースのアプローチを採用する。上皮バリア完全性は、エピテリア電気抵抗(TEER)またはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識デキストランの経上皮電気抵抗(TEER)の測定値のいずれかによって監視される。同様に、PMN TEpMは、典型的には、下のチャンバ16に添加される化学誘引剤に応答して研究される。PMNは上部チャンバに置かれ、インキュベーション期間の後、基底コンパートメントに移行したPMNが収集され、定量化される。これらの方法は便利で、実行しやすく、非常に再現性がありますが、明らかに還元的なアプローチであり、必ずしもin vivo条件の正確な反映を表すものではありません。

マウスにおいて、腸内細胞透過性を研究する一般的なアッセイは、FITC-デキストランの経口ギャバジおよびその後の血清中のFITC-デキストランの外観の測定による、13、17である。このアッセイの欠点は、地域の腸管の寄与ではなく、消化管の全体的なバリア完全性の評価を表していることである。また、エバンブルーは、生体内18における血管漏れを評価するために一般的に使用され、また、マウスおよびラット19、20、21における腸粘膜透過性を評価するために採用されている。腸粘膜におけるエバンスブルーの定量化は、一晩ホルムアミドでインキュベーションを採用する組織からの抽出を必要とする。したがって、同じ組織を使用して腸内皮透過性および好中球浸潤を研究することはできない。

ここでは、生体内での大腸粘膜透過性および白血球経上皮移動に関する再現性データを収集するために必要な動物の数を減らす簡単なプロトコルを強調する。したがって、さらなる分析のために収穫できる腸ループの完全性を損なうことなく、血清中で容易に検出できるFITC-dextransの使用をお勧めします。なお、腸連結ループは、細菌感染(サルモネラ菌、リステリア単球遺伝子および大腸菌など)を研究するために様々な種(マウス、ラット、ウサギ、子牛を含む)で使用されてきた22、23、24、25、腸透過性26;しかし、我々の知る限りでは、IBDに一般的に関与する腸内の特定の領域(イリウムや結腸など)におけるPMN TEpMのメカニズムを調査する研究は行っていません。

ここでは、イラミウムまたは近位結腸の良好な血管化および外形化された腸セグメントを採用した堅牢で信頼性の高いマイクロサージカルin vivo法であるマウス腸管ループ(iLoop)モデルについて説明する。iLoopモデルは生理学的に関連しており、麻酔下で生きているマウスの腸バリア完全性およびPMN TEpMの評価を可能にする。2つの用途を実証する:1)iLoop2におけるイントラミン投与後の4kDa FITC-dextranの血清レベルの定量化)強力な基調剤ロイコトリエンB4(LTB4)27の内環注入後のiLoopルーメン中のトランスマイグレーションPMNの定量化。さらに、ILoopモデルを利用して、JAM-a-nullマウスまたはIEC上でJAM-Aの選択的損失を有するマウス(Villin-cre;Jam-a fl/fl)は、コントロールマウスと比較して、腸透過性および好中球の転化15、28、29、30、31に対する緊密な接合関連タンパク質JAM-Aに対する主要な寄与を報告した以前の研究を裏付けることができる。

iLoopモデルは、体外アッセイを裏付ける高機能・生理学的方法です。さらに、これは、ケモカイン、サイトカイン、細菌病原体、毒素、抗体および治療薬を含むループ内腔に注入することができる様々な試薬の研究を可能にする多目的な実験モデルである。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインと方針に従って行われ、ミシガン大学の施設動物ケア&ユース委員会によって承認されました。

1. 術前準備

注:この方法は、8〜12週齢のC57BL/6遺伝的背景から成体マウスを使用して生成された。すべてのマウスは、通常のチャウと水へのアドリビタムアクセスを伴う厳格な特定の病原体の自由条件下で保たれた。結果は、C57BL/6、ジャム-a -ヌルマウス(Jam-a---)またはIEC上のJAM-Aの選択的損失を持つマウス(Villin-cre;)ジャム・ア・フル/fl)とリッターメイトのジャム・ア・フルは、前述の30を制御します。

  1. エリア準備
    1. クリーンな場所で手術を行います。しかし、腸ループモデルは、無菌/無菌技術を必要としない非生存手術である。獣医衛生の実践を観察し、洗浄された外科器具(すなわち、石鹸で洗い流し、水で洗い流し、その後70%エタノールを使用する)を使用してください。
    2. 温度管理された外科用ボード(または加熱パッド)と調整された光源をオンにして、麻酔や手術中に動物を低体温症から守ります。
    3. 非吸収性4-0シルク外科縫合糸の6cmセグメントを切断することによって合字を準備する。
    4. 楕円体の形状に続いて中央にカットされた綿のガーゼ(5cm x 5cm)を用意します。これらは、正中線の腹腔切多をカバーし、外装されたiLoopと動物の毛皮との間の直接接触を防ぐために使用されます。カットガーゼを温かいハンクスのバランスドソルト溶液(HBSS)にペトリ皿容器に浸します。
    5. 臓器や外装されたiLoopを扱うために使用される暖かいHBSSに浸した湿った綿棒を準備してください。
    6. 暖かいHBSSで満たされた10 mLのシリンジを準備し、黄色の供給管に取り付けます。この注射器は、手術中に露出した組織を保湿し、便の内容のiLoopを穏やかに洗い流すために使用されます。
  2. 動物の準備
    1. 承認された動物の議定書に従って動物を麻酔する。このプロトコルでは、イオブルランと酸素の混合は麻酔気化器を介して投与される。メーカーの指示に従って、酸素の流量を1 L/minに調整してください。気化器を5%に設定し、誘導チャンバをプリチャージします。5分後、イオブルラン気化器を2%~2.5%に減らします。
    2. 3分間から5分間誘導室に動物を入れ、加熱手術板に動物を移し、麻酔の切断プラグを接続します。粘着テープを使用して四肢で動物を上肢の位置に拘束します。
      注:麻酔の代替として、ケタミン(80mg / kg - 100 mg/kg)とキシラジン(5mg/kg - 10 mg/kg)の混合物を生理食塩水(0.9%NaCl)で希釈し、腹腔内注射によって管理することができます。麻酔は、麻酔深さを確保するために、ケタミン/キシラジン(初期用量の0.1〜0.25回)の筋肉内投与によって手術中に維持されるべきである。可能であれば、イオフルラン麻酔気化器は、より良い再現性、生存性を保証し、動物の痛みを防ぐために強くお勧めします。
    3. 角膜乾燥を防ぐために、両眼に眼科軟膏を塗布する。
    4. 心拍数(約500拍/分)とリズム、粘膜色(ピンク)、毛細血管補充時間(<2 s)、呼吸数(40〜60呼吸/分未満)、および温度(36.5°C)32を含む身体検査を行う。
    5. 次のステップに進む前に、ペダルの引き出し反射によって麻酔深さを評価します。つま先やつま先パッドの間の皮膚の痛みを伴う刺激(ピンチ)を採用する。マウスは足を収縮して取り外すことで反応します。このペダル反射は動物が深く麻酔されると消えます。
      注:麻酔中のバイタルとペダル反射のモニタリングは、麻酔を通じて少なくとも15分ごとに推奨されます。血の灌流または呼吸困難の減少を示すとして、通常と淡いまたは青としてピンク色;(b)呼吸パターンを規則的な呼吸対不規則呼吸として評価する。直腸温度プローブ、げっ歯類のオキシメーター、心拍数モニターをそれぞれ体温、心拍数、呼吸数の評価に使用できます。

2. 回腸ループの生成

  1. 皮膚の準備:70%エタノールを浸したアルコール綿棒またはガーゼスポンジで腹部中線の毛皮をスクラブ。低体温症を防ぐために、アルコールで毛皮の広い範囲を濡らないでください。
  2. はさみを使用して、中線の腹腔切多を行います。腹部の真ん中(長さ約2cm)に垂直切開を行い、腹腔を露出させる。腹腔内の臓器を傷つけないように注意してください。
  3. 露出した腹腔の上にプレカットウェットコットンガーゼを置きます。
  4. 濡れた綿棒を使用して、カエカムを動員し、外装します。湿った綿のガーゼに慎重にケオカムを置きます。
    注:Caecumは、動物の性別とは無関係に大多数のマウスの腹腔の左尾口象限に局在する。
  5. 湿った綿棒を使用して、端末部(遠位端)がカエカムに取り付けられている回腸を動員し、穏やかに外装する(図1B)。
  6. 腸間膜血管と血液供給の中断なしに湿った綿ガーゼに少なくとも6cmの末端の回腸を展開する。出血がなく、組織がピンク色を維持している場合、血液供給が維持される(図1B)。
    注:黄色の送り管に取り付けられた10 mLの注射器を使用して、常に組織を保ち、暖かいHBSS(2〜3分ごと)で組織を湿らせた状態に保ち、露出した組織の乾燥を避けてください(ステップ1.1.6)。
  7. ケカムの近くで、腸間膜の回腸を供給する主要な動脈を特定する。次に、重要な血管のない腸間腸内の2つのライゲーション部位を見つけます。
  8. 鈍い組織鉗子を使用して、末端の回腸(caecumに最も近い)をしっかりとつかみ、細かい先端鉗子を使用して、血管を避ける腸間腸をフェンレストする。穿穿片を横切ってシルク縫合糸を配置し、外科結び目を結んで最初の結紮(ループの遠位端)を作成します。
  9. ルーラーを使用して、第 1 合字から 4 cm 離れた位置を測定し、ステップ 2.8 (図 1C)で説明したように、第 2 合字 (ループの近位の端) を作成します。
  10. 細かいはさみで慎重に4cmの回腸ループを分離するために各ライゲーションの隣にカットし、無傷の血液供給および腸間膜を保つ。
    注:iLoopの外装されたセグメントの両端を切断し、照明内容物(便体)との干渉を防ぐ必要なステップとして穏やかに洗い流し、分離されたセグメントの全長にわたってFITC-dextransまたは化学戦術刺激の分散を促進し、流量細胞量による白血球のより正確な定量化を可能にする。この手順はまた、試薬の指定された量の注入後の粘膜の均一な縮裂および動物間のより良い再現性を可能にする。
  11. 10 mLシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の給紙チューブを使用して、イレラルループセグメントの内容をウォームHBSSで静かに洗い流します(ステップ1.1.6を参照)。
  12. シルク縫合糸を使用して、フラッシュされたIlealループの2つのカットエンドをリゲートします。
  13. 30G針の1mLシリンジを使用して、FITC-デックストランス(ステップ4.2)またはケモカイン(ステップ5.3)などの試薬を腸内腔にゆっくりと250μL注入します。回腸ループが膨張し、粘膜の適度な膨張を引き起こす(図1D)。
    注:腸間膜動脈の反対側のループルーメンに試薬を注入します。血管を引き裂いて出血を誘発しないように注射しながら、動物から回腸を引き出さないように注意してください。
  14. 湿った綿棒を使用して、穏やかに回腸ループ、近位回腸およびカエカムを戻す。
  15. 針ホルダー、解剖学的鉗子、3.0非吸収性シルク縫合糸を逆切断針で使用して、腹壁を閉じます。
  16. インキュベーション期間の温度調節麻酔室に動物を置きます。

3. 近位コロンループ(pcLoop)の生成

注: pcLoop の生成に使用されたマウスの詳細については、プロトコルの冒頭で提供されている情報を参照してください。

  1. 手順 2.1 を実行します。- 2.4.イレラルループについては、前述のように。
  2. 湿った綿棒を使用して、回腸全体を外装し、湿った綿のガーゼの上に置きます。近位結腸とメソコロンに位置する血液供給を特定します。近位結腸を動員し、細かい先端鉗子を使用して、カエカムから約0.5cm遠位の中コロンの血管のない領域に最初の合字を作成する(図2B)。
  3. 第1合字から2cmを測定し、メソコロンの血液供給のない領域で第2の合字を作成する(図2C)。
  4. 細かいはさみを使用して慎重に2cm長いpcLoopを分離するために、各ライゲーションの隣にカット。
    注:ステップ2.10の下のノートで述べたように、両端を切断して、発光内容を静かに洗浄するpcLoopを分離することが重要です。小さな血管が腸内腔に出血するのを防ぐために、大腸組織とメソコロンを慎重に切断する。必要に応じて、熱焼灼を使用して、切開部位の出血を制限します。
  5. pcLoopを温かいHBSSで静かに洗い流し、10 mLシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の給餌管を使用して便を取り除きます(ステップ1.1.6を参照)。
  6. シルク縫合糸を使用して、フラッシュされたpcLoopの2つのカットエンドをリゲートします。
  7. 30G針の1mLシリンジを使用して、FITC-デックストランス(ステップ4.2)またはケモカイン(ステップ5.3)などの試薬を腸内腔にゆっくりと200 μL注入します。pcLoopは、粘膜の適度な膨張を引き起こす膨張する(図2D)。
    注:腸間膜動脈の反対側にあるpcLoopルーメンに試薬を注入してください。動物間の一貫性を確保し、粘膜の等しい崩壊を確実にするために2cm長いpcLoopを作成します。
  8. 湿った綿棒を利用して、結紮されたpcLoop、ileum、およびcaecumを腹腔に静かに戻します。
  9. 針ホルダー、解剖学的鉗子、3.0非吸収性シルク縫合糸を逆切断針で使用して、腹壁を閉じます。
  10. インキュベーション期間の温度調節麻酔室に動物を置きます。

4. 腸透過性の定量的評価:4kDa FITC-dextranアッセイ

  1. イレラルループまたはpcLoopを実行します(上記の通りです)。
  2. 30 G針を用いた1 mLシリンジを使用して、腸管腔に250 μL(イリウム - ステップ2.13)または200 μL(コロン - ステップ3.7)の4 kDa FITCデキストラン溶液(HBSSで1mg / mL)を注入します。未使用のFITC-デキストラン溶液を光から保護し、血清採取後に標準曲線を調製します。
  3. ileal ループの場合、pcLoop ステップ 3.8 ~ 3.10 の手順 2.14 ~ 2.16 に従います。簡単に言えば、臓器とiLoopを腹腔に戻し、腹壁を閉じる。
  4. 加熱麻酔室に動物を120分間置きます。
  5. インキュベーション期間が腹壁を開いた後、心臓へのアクセスを得て、血液を収集するために25G針で1mL注射器を使用して心臓穿刺を行う。血液を1.3mLの血清凝固活性化管に移し、穏やかに混ぜ、氷の上で光から保護します。マウス1個につき少なくとも500μLの血液を採取する。
    注:動物は、切断や頸椎脱臼などの物理的方法を使用して麻酔下にあるときに安楽死させられ、承認された動物プロトコルに従って安楽死させます。
  6. 遠心分離機血清凝固活性化管は、メーカーの推奨に従って室温で10,000 x g で5分間の冷却凝固管。血清(上清)を収集し、1.7 mL遠心分離チューブに移します。氷の上にチューブを保ち、光から保護します。
  7. 血清中蛍光の定量
    1. コントロールマウスの血清中にFITC-デキストラン4 kDaの標準曲線を調製します(生理液またはHBSSは有効な代替手段です)。開始濃度が 1 mg/mL FITC デキストランで 2 倍の連続希釈を作成します。測定されるFITC-dextran 4 kDaの濃度は0.25 mg/mLおよび2 μg/mLの間の範囲である。
    2. サンプルと標準の等容積を黒い96ウェルプレート(平底)に移し、蛍光プレートリーダー(励起490 nm、放出520nm)でFITCを測定し、製造業者の指示および公表されたプロトコル33に従う。実験制御群に正規化したフォールド変化として、標準曲線または存在透過率値に基づいてFITC濃度を計算する。

5. ケモカインによる内腔刺激後の腸管腔への移行PMNの定量的評価

注:PMNはベースラインレベルで腸粘膜に存在する非常に少数です。炎症を起こすサイトカインを有する動物の前処理は、血流から腸粘膜へのPMNの採用を促進する炎症性環境をもたらす。

  1. 30G針を用いた1mLシリンジを用いて、200μLのリン酸緩衝塩水(PBS)において、100ngの腫瘍壊死因子-α(TNFα)および100ngのインターフェロンγ(INFγ)の無菌溶液の腹腔内注射(即ち)を行う。
  2. 4〜24時間の前処理を炎症性サイトカインで行った後、イレラルループまたはpcLoop(上記のとおり)を行う。
  3. 30 G針の1 mLシリンジを使用して、HBSSで250 μL(イリウム - ステップ2.13)または200 μL(コロン - ステップ3.7)の化学誘引性溶液の腸管腔に注入します。
    注意:ロイコトリエンB4(LTB4)はPMNのための強力な化学誘引剤としてこのプロトコルで使用されています。N-フォルミルメチオニル-ロイシルフェニルアラニン(fMLF)またはケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド1(CXCL1/KC)などの他の化学誘引物質も、大腸腔30へのPMNの有意な動員を誘導するために使用することができる。
  4. イレラルループの場合、手順2.14~2.16を実行します。pcLoop の場合は、手順 3.8 ~ 3.10 に従います。簡単に言えば、臓器とiLoopを腹腔に戻し、腹壁を閉じる。
  5. 加熱麻酔室に動物を60分間置きます。
  6. 腸ループの内容のコレクション
    1. 溶液を準備し、氷の上に保存する:回腸およびpcLoopのために、カルシウムおよびマグネシウムなしで無菌PBSで2mMエチレンジアミンテアセ酢酸(EDTA)、5 mMジチオスライト(DTT)および2%FBSを含む洗浄バッファーを準備する。
    2. インキュベーション期間後および麻酔の維持下で、腹壁を開き、iLoop(イレラルループまたはpcLoop)を引き出す。麻酔下にある場合は、切断や頸椎脱臼などの物理的方法を使用し、承認された動物プロトコルに従って動物を安楽死させます。
    3. 冷たいPBSでループをすすぎ、残留血液汚染物質を除去し、組織拭き取りで過剰なPBSを吸収する。ループの内容物を1.7 mL遠心管(イレラルループでは約250 μL、pcLoopでは200 μL)に慎重に回収します。500 μL のコールドウォッシュバッファでループを洗い流し、収集直後にチューブを氷の上に置きます。
      注:DTTは粘液を溶解するのに役立ちます。iLoopの発光含有量が非常に粘性である場合(マウスの遺伝的背景に依存して)、DTTを含む洗浄バッファーで1:2または1:3を希釈します。
    4. セルストレーナーキャップ付きの5 mLラウンドボトムチューブを使用して、35 μmナイロンメッシュフィルターを通して、発光含有量溶液を渡します。このステップは、組織断片および細胞凝集体を除去するのに役立ちます。1 mLの洗浄バッファーで細胞ストレーナーを洗い流します。
    5. 遠心管400xgで5°Cで5分間。 上清を捨て、500 μL - 1 mL洗浄バッファーでペレットをすすいで、400 x gで遠心分離機を5分間、4°Cで廃棄します。
    6. カルシウムおよびマグネシウムを含まない滅菌PBSで2%FBSを含む200 μLのフローサイトメトリーバッファー(FCB)でiLoop発光細胞ペレットを再懸濁する。細胞は、チューブに保持したり、フローサイトメトリー染色および分析のために96ウェルラウンドボトムプレートに移すことができます。
  7. フローサイトメトリー染色と分析
    1. 補償コントロール:白血球
      1. 滅菌0.5 M EDTA(pH 8.0)であらかじめ充填された25G針で1mLの注射器を準備します。予想血液量あたり10%EDTA(1mL血液のEDTAの100 μL)。
      2. 心臓穿刺によって麻酔下で血液を収集する。血液を1.7mLチューブに移し、400xgで遠心分離機を10分間、4°Cに移します。
        注:マウスが麻酔下にある間、承認された動物のプロトコル(子宮頸部脱臼など)に従って死亡を確認するために物理的な方法を使用します。
      3. 上清を吸引する。赤血球のリシスのためのアンモニウム-塩化カリウム(ACK)リシスバッファーの1 mLでペレットを再懸濁します。氷の上で3分間-5分間インキュベート。遠心分離機 400 x g 5分間、4 °C ペレットが赤い場合は、ペレットが白くなるまでこのACKのリシスバッファーステップを繰り返します。
      4. ペレットを1 mL FCBに再懸濁し、プレート0.5 x 106~ 1 x 106 の細胞をウェルあたりに再懸濁します。96ウェルの丸底プレートの5つの井戸を準備します。プレートを氷の上に置きます。
        注: ループの明るさの内容を含む同じ 96 ウェル プレートを使用してください(ステップ 5.6.6 を参照)。
    2. フローサイトメトリー染色
      1. 96ウェルプレートを400xg、4°Cで5分間遠心します。 上清を捨てて、50 μLの精製ラットアンチマウスCD16/CD32をFcブロック(FCBの100 μLあたり1μg)としてペレットを再懸濁します。5分間-氷の上で10分のインキュベート。
      2. iLoop発光含有量の免疫染色:フルオロクロム共役抗体(FCBにおける1:50希釈)を含む混合物を調製する:抗CD45-PerCP、抗CD11b-PEおよび抗Ly-6G-アレクサフルオール647。100 μL の最終ボリュームに対して、ウェルごとに 50 μL の組み合わせを追加します。
      3. 補償のための白血球の免疫染色(FCBにおける1:50希釈):FCBの50 μLを単独で使用(未染色サンプル、ウェル1)、各個々のフルオロクロム共役抗体の50 μL(ウェル2-4、全てのフルオロクロム共役抗体の組み合わせの50 μL)100 μLの最終容積。
      4. プレートを光から保護された氷の上で30分間インキュベートします。
      5. 400 x g、4°Cでプレートを5分間遠心します。 上清を捨て、200μLのFCBで洗います。この洗浄手順を2回繰り返します。
      6. 血液サンプルにFCB 150 μL/ウェルを加えます。
      7. iLoopの発光コンテンツサンプルに100 μL/well FCBを加えます。その後、蛍光計数ビーズの50 μL/ウェル。
    3. フローサイトメトリー解析
      1. CD45ポジティブイベントのためのゲートとLy-6G-/Gr-1とCD11b30の表現のための。
      2. 停止条件としてサンプルボリュームの100 μLを使用します。
      3. 蛍光計数ビーズのメーカーから提供された情報に従って、iLoopルーメンに移行したPMNの絶対数を計算します。
        注: データは、(1) ルーメンの PMN の総数30,34,35,(2) 組織のグラムあたりの PMN 数と (3) 円柱の体積に関する式を使用してミリメートルあたりの PMN の数: V= π(pi) r 2 h (体積の場合は V、半径、高さ h) として表示されます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

イレラル ループモデルと pcLoop モデルの概略図を図1と図 2にそれぞれ示します。解剖学的写真は、腸管セグメントの外装を含む手順の重要なステップを示す(図1Bおよび図2B)、血液供給の妨害を最小限に抑える結紮の適切な位置の同定(図1Cおよび図2C)、洗浄後に試薬溶液で満たすことができるiLoopの切り口の結紮(図1Dおよび図2D))。重要なことに、iLoopモデルは、重要な血液供給を維持し、F...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IBDなどの病理的条件下での腸バリア機能の調節障害や免疫細胞の形成を担う機構は不完全に理解されている。ここでは、腸管または近位結腸の血管化された外形性腸セグメントを採用し、腸の透過性、好中球移動研究、ならびに他の用途の評価を可能にする、堅牢なin vivoマウスモデルについて詳述する。

iLoopは生きている動物に対して行われる非回復手術である。麻酔は実験の過程で継続的に監視する必要があり、沈下深度の評価は必須です。最も重要なステップは、(1)iLoopの単離、(2)切り端の結紮、(3)試薬溶液のイントラミラル注入によるiLoopのインフレーションを含む。これらの各ステップでは、出血が起こり、iLoopの血液供給が損なわれ、結果の精度に影響を与える。注意すべきは、PMN TEpMアッセイ中のイントラミン性出血のまれな例では、ここで提示されるフローサイトメトリー測定戦略は、血流から直接発生するPMN(非移行PMN)から移行したPMNを区別するのに役立ちます。iLoopルーメンに集められたトランスマイグレートPMNは、循環PMNと比較して高

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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著者らは、ヴュルツブルク大学のスヴェン・フレミング博士が、近位大腸ループモデルの確立に貢献した、マウスコロニーの管理にショーン・ワトソン、iLoopモデルの写真の入手を支援してくれたチトラ・K・ムラリードハランに感謝する。この研究は、ドイツ研究財団/DFG(BO 5776/2-1)からKB、R01DK079392、R01DK072564、R01DK061379からC.A.P.に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
機器と材料
BDアルコール綿棒BD326895
BDプレシジョングライドニードル、25G X 5/8 "BD305122
BDプレシジョングライドニードル、30G X 1/2"BD305106
BD 1mlチューベルクリン注射器ニードルなし309659
15ml遠心分離機チューブコーニング14-959-53A
コーニング96ウェルソリッドブラックポリスチレンマイクロプレートフィッシャーサイエンティフィック07-200-592
ニング未処理培養皿、10cmミリポアシグマCLS430588
コットンチップアプリケーター(綿棒)、6インチ、滅菌フィッシャーサイエンティフィック25806 2WC
ダイナレックスコットン充填ガーゼスポンジ、非滅菌、2インチ x 2インチMedex3249-1
EZ-7000 麻酔気化器 (クラシックシステム、加熱ユニットを含む)E-Z システムEZ-7000
ファルコン遠心分離チューブ 50ml VWR21008-940
ッシャーブランドカラーラベリングテープフィッシャーサイエンティフィック15-901-10R
ハルゼーニードルホルダー(ニードルホルダー) FST12001-13
キムワイプ、小 (ティッシュワイプ)FisherScientific06-666
1.7ml 微量遠心チューブ トーマス・サイエンティフィック c2170
マイクロチューブ1.3mlZ(血清凝固活性化チューブ)ザルシュテット 41.1501.105
モリアファインはさみFST14370-22
5mlポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付き(35 & マイクロ;mナイロンメッシュ)ファルコン352235
Puralube獣医軟膏、滅菌眼潤滑剤Dechra12920060
リング鉗子(鈍的組織鉗子)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0シルクブラック編組、100 YDFisherScientificNC9452680
Semken鉗子(解剖学的鉗子)FST1108-13
Sofsilk非吸収性コーティングブラック縫合糸編組シルクサイズ3-0、18 "、針19mm長さ3/8円逆切断 HenryScheinSS694
学生用ファインフォーセプス、角度付きFST91110-10
10mlシリンジPP / PE針なしポアシグマ 
96ウェル細胞培養プレートCorning3799
げっ歯類用黄色の栄養チューブ 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTALonza51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing BufferBioWhittaker10-548E
ハンクス平衡塩溶液Corning21-023-CV
リン酸緩衝生理食塩水 カルシウムおよびマグネシウムなしCorning21-040-CV
strong>Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G 抗体 (1A8)BioLegend127610
CD11b モノクローナル抗体, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright Absolute Counting BeadsInvitrogenC36950
DithiotreitolFisherScientificBP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivatedR&D Systems511550
フルオレセイン イソチオシアネート-デキストラン、平均分子量 4.000Σ60842-46-8
イソフルランハロカーボン12164-002-25
ロイコトリエン B4Millipore Σ71160-24-2
PerCP ラット 抗マウス CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
精製ラット抗マウスCD16/CD32(マウスBD FCブロック)BD Bioscience553142
Recombinant Mouse IFN-γPeprotech315-05
組換えマウス TNF-αペプロテック315-01A
BD コーフィミリZ248029<

参考文献

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