方法論記事

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

DOI：

10.3791/62109

⸱

2021年7月6日

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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光応答性哺乳動物細胞を確実に制御するには、光遺伝学的方法の標準化が必要です。この目標に向けて、本研究では、ネガティブフィードバック光遺伝学遺伝子回路を用いた光誘導遺伝子発現の研究を標準化するための遺伝子回路構築、細胞工学、光遺伝学的装置操作、検証アッセイのパイプラインをケーススタディとして概説する。

要約

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哺乳動物細胞における信頼性の高い遺伝子発現制御には、使用される方法に関係なく、高いフォールド変化、低ノイズ、および決定された入力-出力伝達関数を備えたツールが必要です。この目標に向けて、哺乳類細胞におけるタンパク質レベルの時空間制御のために、光遺伝学的遺伝子発現系が過去10年間に多くの注目を集めてきた。しかし、光誘導遺伝子発現を制御する既存の回路のほとんどは、構造が異なり、プラスミドから発現され、可変光遺伝学的装置を利用するため、安定した細胞株における光遺伝学的構成要素の特性評価および標準化を検討する必要性が生じている。ここで、本研究は、事例例としてネガティブフィードバック光遺伝学回路を使用して、哺乳動物細胞における光誘導性遺伝子発現を制御するための信頼性の高い遺伝子回路構築、統合、および特性評価の実験パイプラインを提供する。また、これらのプロトコルは、光遺伝学的装置と光レジームを標準化することで、遺伝子発現ノイズやタンパク質発現の大きさなどの遺伝子回路の特徴を確実に明らかにする方法も示しています。最後に、この論文は、光遺伝学に不慣れな研究室で、そのような技術を採用したいと考えている人にとっては役に立つかもしれません。ここで説明するパイプラインは、哺乳動物細胞における他の光遺伝学的回路に適用され、哺乳動物細胞における転写、プロテオミクス、そして最終的には表現型レベルでの遺伝子発現のより信頼性が高く、詳細な特徴付けおよび制御を可能にするべきである。

概要

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他の工学分野と同様に、合成生物学はプロトコルを標準化し、再現性の高い機能を持つツールを生物学的システムに関連する質問の探求に利用できるようにすることを目指しています1,2。多くの制御システムが構築されてきた合成生物学の1つの領域は、遺伝子発現調節の領域です3,4。遺伝子発現制御は、生理学的および病理学的細胞状態におけるそれらの役割のために重要な細胞特性であるタンパク質レベルおよび変動性(ノイズまたは変動係数、CV = σ/μ、平均に対する標準偏差として測定)の両方を標的とすることができる5,6,7,8。タンパク質レベルとノイズを制御できる多くの合成システム4,9,10,11,12が設計されており、ツール間でプロトコルを標準化する機会を生み出しています。....

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プロトコル

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1. 遺伝子回路設計

  1. 単一の遺伝子回路/プラスミドに結合する遺伝的構成要素(例えば、哺乳動物DNA組み込み配列モチーフ32、光応答性エレメント33、または機能遺伝子34)を選択する。
  2. 遺伝子工学および/または分子クローニングソフトウェアを使用して、後で使用するためにDNA配列を保存し、参照し、各配列に注釈を付け、必要なすべての特徴(例えば、STARTコドン、調節、または翻訳配列)を調べる35。
  3. 全体的な遺伝子回路設計に従って部品を開発または採用する36。一例として、LITers11のような光遺伝学的リプレッサーの場合、リプレッサー遺伝子(例えばTetR)4に隣接し、かつフレーム内に、光誘導性分解37、38またはリプレッサーのDNA結合能39の不活性化が可能なドメインをコードする遺伝子配列を融合させる。
    1. 光遺伝学的アクチベーターの場合、光誘導DNA結合時に遺伝子発現....

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結果

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この記事内の遺伝子回路アセンブリおよび安定な細胞株生成は、転写活性で単一の安定FRT部位を含む市販の改変HEK-293細胞に基づいていた(図1)。遺伝子回路は、プラスミド内にFRT部位を有するベクターに構築され、HEK−293細胞ゲノムへのFlp−FRTの統合を可能にした。このアプローチはFlp-In細胞に限定されず、FRT部位はCRISPR/Cas950などのDNA編集技術を使用してゲノム内の任意の目的の細胞株に添加することができる。

適切な細胞株が構築され、正しい挿入について検証されると、LPAおよびIRISソフトウェアを、遺伝子発現の光誘導のための標準化されたプロトコルとして選択した31、51。LPAシステムにより、光強度、パルス持続時間、デューティサイクルに応じて、複数の実験条件で哺乳動物細胞を誘導するように24ウェルをプログラムすることができます(<.......

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ディスカッション

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この記事の読者は、1)遺伝子回路の設計、構築、および検証を含む、光遺伝学的遺伝子回路(および他の遺伝子発現システム)を特徴付けるために不可欠なステップについての洞察を得ることができます。2)遺伝子回路を安定な細胞株に導入するための細胞工学(例えば、Flp-FRT組換え);3)LPAなどの光ベースのプラットフォームによる操作された細胞の誘導;4)蛍光顕微鏡による光誘導アッセイの初期特性評価;5)フローサイトメトリー、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、または免疫蛍光アッセイを含む様々なアッセイによる最終的な遺伝子発現特性評価。

さらに、上記で概説した方法は、関心のある遺伝子を発現する本質的にあらゆる遺伝子回路アーキテクチャに対して高度にモジュール化されており、回路構築ステップおよび実施されるアッセイにおいて、主な潜在的なプロトコル変更を伴う。遺伝子回路構築の場合、分子クローニングの柔軟性により、プライマー設計またはアセンブリプロトコルに若干の変更を加えた蛍光マーカーで目的の遺伝子を交換または共発現させることができます。さらに、ここで概説する手順は、主に正確な(低ノイズの)遺伝.......

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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Balázsi研究室のコメントと提案、最初のLPAの構築を支援してくれたKarl P. Gerhardt博士とJeffrey J. Tabor博士、LOV2-degronプラスミドを共有してくれたWilfried Weber博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所[R35 GM122561およびT32 GM008444]によって支援された。物理的および定量的生物学のためのローファーセンター;国防理工学大学院(NDSEG)フェローシップ。オープンアクセス料金の資金調達:NIH [R35 GM122561]。

著者の貢献:M.T.G.とG.B.がプロジェクトを考案しました。M.T.G.、D.、およびL.G.は、実験を行.Cた。M.T.G.、D.G.、L.G.、およびG..C.は、データを分析し、原稿を準備した.B。G..B.とM.T.G.がプロジェクトを監督した。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 mL PCRチューブEppendorf951010006PCRを実施するための試薬
0.25% トリプシンEDTA 1XサーモフィッシャーサイエンティフィックMT25053CI哺乳類細胞の分裂と収穫のための
0.5-10 μL 容量調整式ピペットエッペンドルフ3123000020ピペッティング反応に使用されるツール
100-1000 μL 容量調整式ピペットエッペンドルフ3123000039ピペッティング反応に使用されるツール
20-200 μL 容量調整式ピペットエッペンドルフ3123000055ピペッティング反応に使用されるツール
2-20 μL 容量調整式ピペットエッペンドルフ3123000039ピペッティング反応に使用するツール
5 mL ポリスチエン丸底チューブ(セルストレーナーキャップ付きコーニングフローサイトメトリー用352235試薬
5702R 遠心分離機、4 x 100ローター、15 mLおよび50 mLアダプター、120 Vッペンドルフ22628113哺乳類培養作業用機器
アガローデンビルサイエンティフィックGR140-500ゲル電気泳動用試薬
96ウェルプレート用アルミホイルVWR®60941-126光誘導実験でプレートを覆うために使用されるツール
AmpicillinSigma AldrichA9518-5G正しいプラスミドを持つ細菌を選択するための試薬
アナログボルテックスミキサーサーモフィッシャーサイエンティフィック02215365PRPCR、形質転換、またはゲル抽出反応を運ぶためのツール
バクト脱水寒天培地ッシャー サイエンティフィック DF0140010試薬成長細菌
BD LSRAriaBD656700遺伝子操作細胞株をモノクローナル集団に選別するためのツール
BD LSRFortessaBD649225遺伝子操作細胞株
BSA、ウシ血清アルブミン政府 科学ソースSIGA4919-1GIFインキュベーションバッファー
用試薬細胞培養プレート 12ウェル、透明、平底、蓋付き、ポリスチレン、非発熱性、標準TCコーニング353043プレート モノクローナル細胞の成長に使用
遠心分離機VWR哺乳類細胞培養用22628113
化学ヒュームフードN/AN/A IF反応を実施するための機器
クリア細胞培養プレート 24ウェル平底、蓋付きBD353047モノクローナル細胞の増殖に使用されるプレート
CytoOne T25 フィルターキャップ TCフラスコUSA ScientificCC7682-4825哺乳類細胞の成長用容器
ジメチルスルホキシド(DMSO)Fischer ScientificBP231-100遺伝子操作された哺乳類細胞の凍結に使用される試薬
臭化エチジウムサーモフィッシャーサイエンティフィックゲル電気泳動
用試薬 15-585-011Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC処理培養マイクロプレート、蓋付き選別モノクローナル細胞の増殖用コーニング353072
FCS ExpressDe Novo ソフトウェア:N/Aフローサイトメトリーデータの特性評価用ソフトウェア
シ胎児血清、レギュラー、USDA 500 mL哺乳類細胞
の増殖用Corning 35-010-CV試薬透明な蓋付きのフィッシャーブランドのペトリ皿 - 隆起した尾根。100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712バクテリア増殖用機器
Gibco DMEM, High GlucoseThermo Fisher Scientific11-965-092reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mLLife Technologies10687-010reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermixバイオ・ラッド ラボラトリ1708890試薬 RNAをcDNAに変換する試薬
ラボラトリーフリーザー -20 °CVWR76210-392試薬を保管するための機器
実験室用冷凍庫-80>CパナソニックMDF-U74VC実験用試薬保管装置
実験用冷蔵庫 +4 >CVWR76359-220実験試薬保存装置
LB Broth (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250Greagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt for transfecting gene circuit into mammalian cells
MATLAB 2019MathWorksN/Asoftware for analyzing experimental data
メタノールAcros Organics413775000免疫蛍光反応用試薬
微量遠心チューブ、ポリプロピレン 1.7 mLVWR20170-333プラスチック製品容器
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
MultiTherm ShakerBenchmark 細菌科学 H5000-HC装置変換
NanoDrop Lite 分光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィックND-NDL-US-CANDNA/RNA濃度測定装置
NEB Q5 ハイフィデリティDNAポリメラーゼ 2x マスターミックスNEBM0492S遺伝子回路断片のPCR用試薬
NEB10-β コンピテント大腸菌 (高効率)ニューイングランドバイオラボ (NEB)C3019H遺伝子回路を増幅するための細菌細胞興味深い
NEBuilder HiFi DNAアセンブリ マスターミックスニューイングランドバイオラボ(NEB)E2621L遺伝子回路の断片を組み合わせる試薬
ニコンエクリプスTi-E倒立顕微鏡とDS-Qi2カメラニコンインスツルメンツ株式会社N/A遺伝子発現定量装置
NIS-Elementsニコンインスツルメンツ株式会社蛍光顕微鏡データの特性評価用N/A
オリゴヌクレオチドIDT 遺伝子回路成分のPCRに用いるN/A
パナソニック MCO-170 AICUVHL-PA cellIQシリーズ CO2 UVおよびH<サブ>2オ<サブ>2インキュベーター コントロールパナソニックMCO-170AICUVHL-PA哺乳類細胞
増殖用機器パラホルムアルデヒド、16% 電子顕微鏡グレードElectron Microscopy Sciences15710-S試薬
PBS、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS) (1x)哺乳類細胞培養用 Invitrogen 14190144試薬、IF インキュベーションバッファー
用 ペニシリン-ストレプトマイシン試薬 (10,000 U/mL)、100xFisher Scientific15140-122哺乳動物細胞
増殖用試薬一次ERK抗体Cell Signaling Technology4370S一次ERK抗体 免疫蛍光
一次KRAS抗体Sigma-AldrichWH0003845M1一次KRAS抗体 免疫蛍光
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704遺伝子回路断片を精製するための試薬キット
QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステムEppendorfA28137qRT-PCR用機器
相対定量アプリサーモフィッシャーサイエンティフィックRNA/cDNAを定量するためのソフトウェア アンプリフィカイトン
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134人工哺乳類細胞のRNAを抽出するための
二次ERK抗体Cell Signaling Technology8889S二次 ERK 抗体 免疫蛍光
二次 KRAS 抗体InvitrogenA11005二次 KRAS 抗体
免疫蛍光 血清学的ピペット 5.0 mLオリンパス プラスチック12-102試薬 さまざまな化学反応のセットアップに使用
SmartView Pro イメージャー システムメジャー サイエンスUVCI-1200正しいPCRバンドをイメージングするためのツール
SnapGene Viewer(無料)またはSnapGeneSnapGeneN/Aソフトウェア DNA配列の設計と解析
ステージトップインキュベーターTokai HitINU-TIZツール PCR、形質転換、またはゲル抽出反応を運ぶためのツール
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) 内因性コントロール (VIC/MGB プローブ)、プライマー限定、2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR プローブ
サーモサイクラーBio-Rad1851148PCR、形質転換、またはゲル抽出反応を運ぶためのツール
VisiPlate-24 ブラック、ブラック 24 ウェル マイクロプレート、クリアボトム、滅菌および組織培養処理済みPerkinElmer1450-605プレート実験
VWR 使い捨てパスツールピペット、ガラス、ホウケイ酸ガラスピペット、ショートチップ、容量=2 mL、全長=14.6 cm哺乳類細胞培養用VWR14673-010
VWR Mini 水平電気泳動システム、Mini10 ゲルシステムVWR89032-290DNAゲル電気泳動用機器
Flp-In 293サーモフィッシャーサイエンティフィックR75007FRT付き人工細胞株敷地
試薬 ) エスフィ装置容器 ウーズ 実験用ソフトウェア試薬キット 光誘導に使用される 試薬

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors....

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