制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

制限エンドヌクレアーゼ(REase)は、DNAの配列特異的な二本鎖切断に影響を与える酵素です。1970年代のREasesの発見は、組換えDNA技術の開発につながり、現在では遺伝子組換えや遺伝子操作に欠かせない実験ツールとなっています¹。II型REaseは、認識配列内または認識配列付近の固定位置でDNAを切断するため、このクラスで最も広く使用されている酵素です。しかし、タイプIIのREasesには大きなバリエーションがあり、進化的関係によって分類されるのではなく、特定の酵素特性に基づいていくつかのサブタイプに分類されます。各サブタイプの中には、分類スキームに例外が頻繁にあり、多くの酵素は複数のサブタイプ²に属しています。何千ものType II REaseが同定されており、そのうちの数百が市販されています。

しかし、Type II REasesの多様性にもかかわらず、詳細に研究されたREaseはほとんどありません。1975年にリチャード・ロバーツ卿によって設立された制限酵素データベースであるREBASE^{によると、これらの}酵素のうち公開された動態データは20未満しか入手できません。さらに、一部のREaseは、その認識配列4,5,6,7に遭遇して結合する前にDNAに沿って拡散しながら、単一分子レベルで直接観察されていますが、その切断反応速度に関する単一分子の研究はほとんどありません。既存の研究は、単一の切断事象が発生する時間の変化を詳細に分析するための適切な統計を報告していないか^8,9,10、または切断時間¹¹の完全な分布を捕捉することができない。この種の解析により、比較的長寿命の運動学的中間体の存在が明らかになり、REaseを介したDNA切断のメカニズムの理解を深めることができる可能性があります。

単一分子レベルでは、生化学的プロセスは確率的であり、プロセスの単一のインスタンスが発生するまでの待ち時間τは変動します。ただし、τの多くの測定値は、発生しているプロセスの種類を示す確率分布p(τ)に従うことが期待できます。たとえば、酵素から生成物分子を放出するなどのシングルステッププロセスはポアソン統計に従い、p(τ)は負の指数分布の形を取ります。

ここで、 β は平均待ち時間です。プロセスの速度 k は、平均待機時間の逆数である 1/β に等しくなることに注意してください。複数のステップを必要とするプロセスの場合、 p(τ) は、個々のステップごとに 1 つの指数分布の畳み込みになります。平均待ち時間が同一の N 個の単一指数関数減衰関数の畳み込み ( β) の一般的な解は、ガンマ確率分布です。

ここで、Γ(N) はガンマ関数で、N-1 の階乗と N の非整数値への補間を表します。この一般的な解は、個々のステップの平均待ち時間が類似している場合の近似値として使用できますが、比較的速いステップの存在は、待ち時間が大幅に長いステップによって隠されることを理解する必要があります。つまり、N の値はステップ¹² の数の下限を表します。待機時間測定の数が適切であれば、イベントをビン化してガンマ分布を結果のヒストグラムに適合させるか、最尤推定アプローチを使用して、パラメーター β と N を推定できます。したがって、このタイプの分析は、アンサンブルアッセイでは容易に解決できず、パラメータを正確に推定するために多数の観察を必要とする速度論的ステップの存在を明らかにすることができる^12,13。

この論文では、量子ドット標識DNAと全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用して、REaseを介した数百の個々のDNA切断イベントを並行して観察する方法について説明します。このアッセイの設計により、複数の実験結果をプールすることが可能になり、数千のイベントを含む滞留時間分布を作成することができます。量子ドットの高い光安定性と輝度により、実験開始から数分後でも発生する切断イベントを観察する能力を犠牲にすることなく、10Hzの時間分解能が可能になります。優れた時間分解能と広いダイナミックレンジ、および大規模なデータセットを収集する能力を組み合わせることで、滞留時間分布の正確な特性評価が可能になり、ターンオーバー率が1分^-1 の範囲にあるREaseの切断経路に複数の運動学的ステップが存在することが明らかになります。EcoRVの場合、3つの速度論的ステップを解決でき、そのすべてが他の手段によって特定されており、アッセイがそのようなステップの存在に対して敏感であることが確認されています。

目的の認識配列を含む二本鎖DNA基質は、ビオチン化オリゴヌクレオチドを、共有結合した単一の半導体ナノ結晶量子ドットで標識された相補鎖にアニーリングすることによって生成されます。これらの基板は、ガラスカバーガラスの上に構築された流路に導入され、その表面に高分子量ポリエチレングリコール(PEG)分子が共有結合して芝生に付着しています。DNA基質は、ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して、自由末端にビオチンを持つPEG分子の一部によって捕捉されます。TIRF顕微鏡では、ガラスと液体の界面からの距離とともに指数関数的に減衰するエバネッセント波が照明を提供します。透過深度は、使用する光の波長のオーダーです。これらの条件下では、機能化されたガラス表面に捕捉されたDNA分子によって表面につながれた量子ドットのみが励起されます。溶液中で遊離している量子ドットは、照らされた領域内に制約されないため、発光しません。量子ドットを表面につなぎとめているDNAが切断されると、その量子ドットは表面から自由に拡散し、蛍光画像から消えます。

多くのII型REaseはマグネシウムの非存在下でDNAに結合することが知られているが¹⁴、すべてのREaseはDNA切断を媒介するためにマグネシウムを必要とする¹⁵。これらのREaseは、マグネシウムの非存在下で表面に固定化されたDNAに結合することができます。マグネシウム含有バッファーをDNAにプレバインディングしたREaseのチャネルに流すと、量子ドットの消失が示すように、すぐに切断が始まります。REase分子を事前に結合し、マグネシウムを導入してDNA切断を開始することで同期化を達成することで、実験で観察された酵素集団の各分子について、DNA切断が完了するまでのタイムラグを独立して測定することができます。フルオレセインは、マグネシウムが視野に到着することを示すために、マグネシウム含有緩衝液にトレーサー色素として含まれています。マグネシウム含有バッファーには酵素が含まれていないため、マグネシウム含有バッファーの到着から各量子ドットが消失するまでのタイムラグは、DNAにすでに結合しているREaseがDNAを切断し、ガラス表面から量子ドットを放出するのにかかる時間を示しています。量子ドットの消失は迅速に起こり、強度の軌跡が急激に減少するため、特定のDNA分子が切断される時間を明確に示します。イベント時間の決定は、強度軌道の数学的分析によって行われ、一般的な実験では、何百もの識別可能な切断イベントが得られます。複数の実験の結果をプールして、非線形最小二乗分析または最尤分析によってパラメーター N と β を推定できる適切な統計を提供できます。

1. 一般情報

1. オリゴヌクレオチド設計
   注:60塩基対(bp)長のDNA基質は、100 mM NaCl中の二相融解温度が75°Cの相補的オリゴヌクレオチドのペアから形成されます。
   1. 1つのオリゴヌクレオチドを単一の5'ビオチン修飾で合成し、もう1つを5'チオール修飾(6炭素スペーサー)で合成します。認識サイトを二重化領域の中央に配置します。
      注:EcoRVで使用するオリゴヌクレオチド配列を以下に示します(太字は認識部位)。
      5' ビオチン - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' チオール - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. すべてのステップで18MΩの抵抗率を持つ超純水を使用してください。
3. 量子ドットを含むすべての溶液を光から保護し、光退色を防ぎます。
4. 圧縮空気源を使用して、このプロトコルを完了します。

2. 量子ドット標識DNA基質材料の作製

注:上記のオリゴヌクレオチドの他に、他の材料については 材料の表 を、量子ドット標識DNA基質の調製に必要なバッファーについては 表1 を参照してください。

1. 量子ドットに結合するオリゴヌクレオチド上の5'チオール基を還元します。
   1. 各チオール化オリゴヌクレオチドを100 μMの濃度で水に再懸濁します。
   2. 各オリゴヌクレオチドサンプルについて、650 μLの水をサイズ排除スピンカラムにピペットで移し、ボルテックスで~15秒間ボルテックスします。カラムを30分間保圧します。
   3. DTTは溶液中で急速に分解するため、毎回使用する直前に新鮮な100 mMジチオスレイトール(DTT)溶液を調製します。7.7 mgのDTTを含む1つのバイアルを慎重に開き、500 μLのリン酸ナトリウム緩衝液をバイアルにピペットで移します。渦を巻き上げてじっくりと混ぜ合わせます。
   4. 再懸濁したオリゴヌクレオチドごとに、新しいチューブを調製し、50 μL のオリゴヌクレオチドと 50 μL の DTT 溶液をチューブに加えます。ピペットで上下に動かして混ぜます。室温で30分間インキュベートして、オリゴヌクレオチドの5'末端の酸化チオール基間のジスルフィド結合を減少させます。
   5. スピンカラムのキャップを取り外し、各カラムをコレクションチューブに入れます。スピンカラムを750 × g で2分間遠心分離し、溶出液を廃棄します。
   6. スピンカラムを新しい遠心分離管に移します。DNA/DTT混合物の1つのサンプルの全容量(100 μL)を、調製した各カラムに静かにピペッティングします。750 × g で2分間遠心分離し、260 nmで溶出液の吸光度を測定して、濃度が約40 μMであることを確認します。
   7. すぐに使用しないサンプルは、チオール基の酸化やジスルフィド結合の形成を防ぐために、-20°Cで保管してください。
2. DNAと量子ドットの結合
   1. 作製するコンストラクトごとに、50 μLの量子ドットストックの1アリコートを透析装置にピペットで移し、ピペットチップでメンブレンに触れないようにします。サンプル量の 1000 倍以上の N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸 (CHES) バッファーに対して、~100 rpm で 15 分間攪拌しながら透析します。
   2. 毎回使用する直前に、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)の新鮮な6 mM溶液をCHESバッファーに調製します。2 mgのsulfo-SMCCを含む1つのバイアルを慎重に開き、800 μLのCHESバッファーをバイアルにピペットで移します。渦を巻き上げてしっかりと混ぜます。
   3. ピペッターを使用して、懸濁した量子ドットを透析装置から慎重に取り出し、等量のスルホ-SMCC溶液を含む新しいチューブに移します。ピペットで上下に動かして混ぜます。1000 rpmで振とうしながら室温で1時間インキュベートし、sulfo-SMCCが量子ドット上の第一級アミンと反応します。
   4. ピペッターを使用して、各サンプルを新しい透析装置に慎重に移します。過剰なスルホSMCCを除去するには、透析装置に含まれる容量の少なくとも1000倍のCHESバッファーに対して、攪拌しながら15分間透析します。バッファーを 2 回交換し、新しい CHES バッファーで合計 3 回透析を行い、各バッファー交換の 15 分後に透析を進行させます。
   5. 2回目の反応に備えて緩衝液を交換するには、透析装置を、装置に含まれる容量の少なくとも1000倍の量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むビーカーに移します。15分間撹拌しながら透析し、バッファーを2回交換し、新鮮なPBSで合計3回透析を行い、各バッファー交換後に15分間透析を進行させます。
   6. ピペッターを使用して、透析装置から量子ドットを含む溶液を慎重に回収し、各サンプルをPBSで希釈した等モル量のチオラ化オリゴヌクレオチドを含む新しいチューブに移します。同量のPBSと、還元精製したオリゴヌクレオチドサンプルの1/10の容量(約40 μM濃度)を組み合わせ、この時点での量子ドット濃度は~4 μMです。室温で2時間インキュベートし、1000 rpmで振とうします。
   7. ウシ血清アルブミン(BSA、10 mg/mL)を各サンプルに添加して、最終BSA濃度0.5 mg/mLを得ます。ピペッターを使用して、各サンプルを新しい透析装置に慎重に移し、透析装置に含まれる容量の少なくとも1000倍の容量の記憶バッファーに対して透析します。バッファーを2回交換し、新たに保存したバッファーを合計3回交換して透析を行い、各バッファー交換後に15分間透析を進めることができます。
   8. ピペッターを使用して、各サンプルを慎重に回収し、新しいチューブに入れて、4°Cで保存します。
      注:-20°Cでは、量子ドットが凍結によって損傷を受けるため、保管しないでください。
3. 量子ドット標識オリゴヌクレオチドのビオチン化オリゴヌクレオチドへのアニーリング
   1. 各ビオチン化オリゴヌクレオチドを100 μMの濃度で保存バッファーに再懸濁し、未使用のサンプルを-20°Cで保存します。
   2. 量子ドット標識オリゴヌクレオチドのサンプルを、10倍モル過剰のビオチン化オリゴヌクレオチドと組み合わせます。クォンタムドット標識サンプル中のDNA濃度は推定2 μMであるため、このサンプル10 μLごとに0.2 μLのビオチン化オリゴヌクレオチドを添加します。
   3. ヒートブロック内の混合物を75°C(相補領域の融解温度)に加熱します。その温度で5分間保持します。ヒートブロックの電源を切り、ゆっくりと冷まします。完成したコンストラクトを4°Cで保存します。凍結しないでください。

3. カバースリップの表面機能化

注:このプロセスは、他のJoVEビデオプロトコル^16,17で以前に説明されています。このプロトコルは、小さなスライドガラスに対応するために小さな変更を加えた手順の適応バージョンを説明しています。カバースリップの表面機能化に必要なその他の材料については、材料表を参照してください。

1. 各カバースリップホルダーに5枚のカバースリップを置きます。カバースリップの各ペアの間に1つのスペースをスキップして、カバースリップが互いにくっつかないようにしてください。ホルダーに入れたカバーガラスをカバー付きの瓶に入れ、カバーガラスが覆われるまで瓶にエタノールを加え、上部をしっかりとねじ込みます。瓶全体をバスソニケーターの水に入れ、完全に沈めずに、30分間超音波処理します。
2. きれいなビーカーまたは瓶に超純水を入れます。金属製のピンセットを使用して、ホルダーのカバーガラスをエタノールから取り外し、水に浸してすすぎます。次に、カバースリップとホルダーを1 M水酸化カリウム(KOH)溶液が入った瓶に移します。上部をしっかりとねじ込み、瓶をソニケーターバスに入れ、30分間ソニケートします。
   注意: KOH溶液は腐食性があり、刺激性があるため、取り扱いには注意してください。
3. エタノールとKOH溶液で超音波処理を繰り返し、各ステップの間に上記のようにカバーガラスを水ですすいでください。
4. ホルダーのカバースリップを純粋なアセトンで満たされたきれいな瓶に移します。上記のように瓶を30分間超音波処理してクリーニングを終了します。このステップの後、水ですすがないでください。
5. 金属製のピンセットを使用して、ホルダーのカバーガラスを、80 mLの新鮮なアセトンとマイクロスケールの攪拌子が入ったきれいな100 mLビーカーに移します。ビーカーを少なくとも1,000rpmに設定された磁気攪拌板に置きます。アセトンを激しく攪拌しながら、1.6 mLの3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)をビーカーにピペットで移し、2% v/v溶液を調製します。
   注意:APTESは腐食性があるため、ピペッティングするときは注意してください。
6. カバーガラスを溶液中で2分間インキュベートした後、金属製のピンセットを使用してホルダー内のカバーガラスを水のビーカーに移し、反応を急冷します。カバースリップをさらに2回すすぎ、ビーカーの水を交換します。
7. シラン処理ガラスをオーブンで120°Cで75分間硬化させます。すぐに次のステップに進まない場合は、カバースリップを最大数日間真空下で保管してください。
8. N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル誘導体化ポリエチレングリコール(PEG)を100 mM重炭酸ナトリウム(pH 8.2)に溶解します。メトキシ末端PEGとビオチン末端PEGの比率が10:1で、メトキシ末端PEGは~100 mg/mLです。
9. 100 μLのPEG溶液を乾燥シラン処理カバースリップの半分にピペットで移し、それぞれを2枚目のカバースリップで覆います。各コーナーに配置されたパラフィルムの小片をスペーサーとして使用し、カバーガラスが互いにくっつかないようにします。
10. カバースリップを湿度の高い環境で3.5時間インキュベートします。カバースリップサンドイッチを分離します。噴出ボトルを使用して、各カバースリップを大量の水で洗い、圧縮空気で乾かします。
11. 機能化されたカバースリップは真空下で保管してください。PEG処理面は、反対側がDNA基質を捕捉しないため、必ず上向きにしてください。

4. マイクロ流体デバイスの構築

注意: マイクロ流体デバイスの構築に必要なその他の材料については、 材料の表 を参照してください。

1. テーパーダイヤモンドポイントホイールビットを取り付けたハンドヘルドロータリーマルチツールを使用して、クォーツスライドの反対側のコーナーに2つの穴を開けて、入口と出口として機能します。スライドを所定の位置に固定し、ビットに注油し、穴を開けながら常に水でスライドしてください。各実験の後、使用済みのデバイスをアセトンに浸して接着剤とエポキシを溶解することにより、準備した石英スライドを再利用のために回収します。残りのコンポーネントは破棄します。
   注:穴あけは手で行うことができますが、マルチツールにプレススタイルのホルダーを使用すると、プロセスが容易になります。
2. 25 μLのストレプトアビジン溶液を80 μLのPBSおよび20 μLのブロッキングバッファーと組み合わせます。PEG処理したカバースリップにこの混合物をコーティングし、湿度の高い環境で30分間インキュベートします。
3. カバースリップのインキュベーション中に、イメージングスペーサーを準備して流路を作成します。1インチ四方のイメージングスペーサー材料をカットし、クォーツスライドに開けられた穴の端に位置合わせされた幅2mmのチャネルに印を付けます(図2)。メスでスペーサー素材からチャネルを切り取ります。
4. イメージスペーサーの裏地の片側をはがし、入口と出口の穴を覆わないように注意しながら、クォーツスライドに慎重に置きます。クォーツスライドをアセトンで完全に洗浄し、以前の実験で残った接着剤を取り除いてください。
5. カバーガラスを水で洗い、圧縮空気で乾かします。イメージングスペーサーから裏地の反対側を取り外し、クォーツスライドと機能化されたストレプトアビジンコーティングされたカバースリップの間に挟み込み、プラスチックピンセットを使用してアセンブリを一緒に押し付け、接着剤から気泡を取り除きます。
6. 長さ30cmのポリエチレンチューブを1本、石英スライドの各穴に挿入します。溶液が自由に流れるように、チューブの端を斜めに切断してください。チューブラックまたはその他のサポートを使用してチューブを所定の位置に保持し、チューブを所定の位置にシールし、組み立てたデバイスの端をエポキシでシールします。
   注:パラフィルムの上にデバイスを構築するとうまく機能し、エポキシが固まったときに底から簡単に剥がすことができます。
7. エポキシ樹脂が固まったら、空のシリンジの鈍い針をデバイスの出口チューブに挿入し、入口チューブの端をブロッキングバッファーで満たされた容器に浸します。シリンジプランジャーを引き戻して、デバイスにブロッキングバッファーを充填します。使用前に、デバイスを少なくとも30分間インキュベートしておきます。

5. 量子ドット標識DNA基質の表面テザリング

注:上記のマイクロ流体デバイス、DNA基質、およびブロッキングバッファーの他に、他の材料については Table of Materials を、量子ドット標識DNA基質の表面テザリングに必要なバッファーについては Table 1 を参照してください。

1. マイクロ流体デバイスを顕微鏡ステージプレートにテープで取り付け、対物レンズをデバイスの底部に接触させ、視野がマイクロ流体チャネル内に来るように対物レンズを配置します。
2. アウトレットチューブをシリンジポンプに接続した後、シリンジプランジャーを引き戻して、マイクロ流体チャネルを新しいブロッキングバッファーで洗い流します。チューブやチャネルに気泡が溜まっていないことを確認してください。
   注意: この時点から、気泡がデバイスに導入されないように、インレットチューブが液体になっていることを確認してください。
3. 調製したDNA基質1 μLをブロッキングバッファー1 mLに希釈します。インレットチューブを希釈したDNA基質に入れ、800μLの基質溶液をチャネルに200μL/minの速度で流します。DNA溶液を、流れが止まってから15分間、邪魔されずにチャネル内でインキュベートします。
4. 少なくとも800 μLのブロッキングバッファーを200 μL/minの速度でチャネルに流し、結合していないDNAをチャネルから洗い流します。
5. レーザー出力、顕微鏡の焦点、TIRF角度を調整して、表面につながれた量子ドットがはっきりと見えるようにします。
   注:量子ドットはすぐには漂白しませんが、まばたきを最小限に抑えるために、パワーをできるだけ低く保つことが最善です。

6. REaseを介したDNA切断

注:材料については 「材料の表 」を、REaseを介したDNA切断に必要なバッファーについては 「表1 」を参照してください。

1. カメラが最適な動作温度に冷却され、露光時間が0.10秒の高速ストリーミングに設定されていることを確認してください。~4分間のデータ収集を覚悟してください。
2. マイクロ流体デバイスをマグネシウムを含まない800μLの実験用バッファーで200μL/minの流速でフラッシュします。
3. マグネシウムを含まない実験バッファーのアリコート(1 mL)にREaseを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。100,000ユニット/mLのストックを4μL使用してください(これはEcoRVの400ユニット/mLに相当します)。希釈した酵素800μLを200μL/minの流速でチャネルに流します。
4. マグネシウムとフルオレセインを含む実験用バッファーを200 μL/minの流速で流すことから実験を開始します。シリンジポンプを始動した直後にデータのキャプチャを開始します。800μLのバッファーを流した後、データ取得を停止します。

7. データ分析

注:このプロトコルに使用されているデータ解析ソフトウェアの 資料表 を参照し、別の解析プラットフォームを使用している場合は調整してください。

1. ゼロ時点の決定
   1. Image Processing Toolbox に組み込まれている形態学的トップハット フィルタリング関数である imtophat 関数を使用して、実験映画の各フレームから背景蛍光を差し引きます。半径が 3 ピクセルのディスクを構造化要素として選択します。元の画像からフィルタリングされた画像を差し引いて、背景の強度を取得します。
      注:フィルターは、背景よりも明るく、構造化要素よりも小さい画像の特徴のみを保持します。
   2. 各ムービーフレームで減算された背景を平均化します。この値の軌跡を使用して、実験のゼロ時点を決定します(図3A)。デッドボリュームフロー中の変化率の標準偏差の3倍を超える増加率の最初のフレームを見つけて、開始時間を決定します。
      注:各ムービーフレームについて減算された背景の平均値の変化率の急激な増加は、トレーサー色素を含む最終的な実験バッファーがフローセルに入った時間を示します(図3B)。
2. 量子ドット強度軌道計算・解析
   1. トレーサー色素が到着する前に記録された背景補正されたムービーフレームのセットの最大強度投影を計算します。この投影画像では、 pkfnd などのピーク検出関数を使用して、量子ドットの位置を 1 ピクセルの精度で決定します。
   2. ピーク検出関数によって返された位置を囲む辺あたり 3 ピクセルの正方形領域の各ムービー フレームの平均強度を計算することにより、個々の量子ドットの強度軌跡を生成します。
      注:上記の背景補正により、トレーサー染料によって導入されたアーティファクトが除去されます。結果として得られる強度の軌跡は比較的平坦であるべきですが、それでも自然に発生する強度の変動が含まれています(図4)。
   3. 強度軌跡の統計解析により、量子ドットの消失事象を特定します。各量子ドット強度の軌跡について、軌跡で観測されたノイズに応じて、その軌跡の最大値と最小値の差の適切な割合で最小値を上回るしきい値強度を計算します。
      注:量子ドットの強度変動は、通常、バックグラウンド変動よりもはるかに大きくなります。適切な値は、これらの値を比較することによって決定できます:選択される閾値は、最も高いバックグラウンド値よりも高くなければなりませんが、理想的には量子ドット蛍光の最も低い値よりも低くなければなりません。提示されたデータでは、使用されたしきい値は、各軌跡の最小値に、その軌跡の最大値と最小値の差の 3 分の 1 を加えた値を超えるように計算されました。量子ドットは、その位置で観測された強度がこの閾値を超えた最後の時点で消失したと見なすことができます。
   4. 推定される失踪イベントを確認します。観測された強度が、消失前の映画フレームの半分以上で軌道の最小強度値と最大強度値の中間点を超えており、イベント後に強度軌跡の標準偏差が減少した場合にのみ、最終解析にイベントを含めます。
      注:有効な失踪イベントのみが記録されるように、他の統計的検定を採用する場合があります。

フローセルは、レーザー照明を備えた倒立顕微鏡の高開口油浸倍率60倍対物レンズに直接結合され、対物レンズTIRFイメージングを実現します(図5A)。DNA基質を導入し、余分なDNAと量子ドットを洗い流した後、通常、視野内には数千の個々の量子ドットがあります(図5B)。これらの量子ドットはガラス表面に安定して付着しており、実験の時間スケールで目立った減光や大幅な漂白を受けることはありません。しかし、マグネシウムと適切なREaseの両方を含むバッファーを流路に流すと、通常の4分間の観察時間の終わりには、実験開始時に存在していた量子ドットの少なくとも30%が視野から消えていることになります。マグネシウムの必要量を確認すると、マグネシウムが存在しない状態でREaseをチャネルに流すと、実験開始時に存在していた量子ドットの少なくとも95%が観察期間の終了時にも確認できる(図5C)。しかし、マグネシウム非存在下でREaseが表面結合DNAに結合した直後にマグネシウム含有バッファーを流すと、REaseとマグネシウムを一緒にチャネルに流したときと同様に、観察期間の終わりまでに最大で量子ドットの半分が消失します(図5D)。イベントの正確な収率は、使用した条件下での酵素の効率に依存します。マグネシウム含有バッファーを適切なREaseを流路に導入せずに流した場合、観測期間中に消失する量子ドットは5%未満であり、イベントのヒストグラムに識別可能なピークはありません。この結果は、プレバインディングされたREase分子が、量子ドットをガラス表面につなぎとめるDNAの切断を媒介し、このDNA切断がこれらの実験で観察された量子ドット消失事象の大部分に関与していることを示しています。

量子ドットの消失は迅速に起こり、強度軌道が急激に減少するため、特定のDNA分子が切断される時間を明確に示します(図5E)。イベント時間の決定は、強度の軌跡の数学的分析によって行われます。単一量子ドットは、使用した画像条件下で背景よりも有意に高い分散で強度軌道を生成するため、強度軌道の分散が観測された強度低下後の背景の分散に匹敵するレベルまで減少すると、推定イベントが確認されます。さらに、推定される消失イベントの前に大きなまばたきを含む軌道は、最終分析から除外されます。ただし、一般的な実験では、これらの基準を満たす数百のイベントが生成されるため、複数の実験の結果をプールして、非線形最小二乗曲線近似または最尤パラメーター推定のいずれかによってパラメーター N と β を推定できる適切な統計を提供できます。

提示された代表的なデータは、十分に研究されているType IIP REaseであるEcoRVを用いてこの実験を行うことによって収集されました(ビデオ1)。長さ60bpの二本鎖DNA基質は、二本鎖の一方の鎖の5'末端にビオチン分子を、他方の鎖の5'末端に共有結合した量子ドットで構成されています。DNA基質には、下向き矢印(↓)で示されているように、認識配列であるGAT↓ATCが中央でEcoRVによって切断された単一のコピーが含まれています。マグネシウム非存在下でEcoRVをDNA基質にプレバウンドし、次にマグネシウム含有緩衝液を流してDNA切断を開始した。代表的なデータには、5つの別々の実験のプールされた結果が含まれており、合計3451回の切断イベントが観察されました。ゼロ時点より前または顕著なアクティビティのピーク外で発生したイベントを除外すると、2987 個のイベントが残り、ヒストグラムに 1 秒のビンを入力するのに十分でした。非線形最小二乗曲線近似と最尤パラメータ推定の両方を使用して、 データからN と β の値を抽出しました。2つのパラメータ推定法は一致しており(図6A)、非線形最小二乗適合は N = 3.52(95%信頼区間:3.32-3.71)、 β = 5.78 s(95%信頼区間:5.41-6.15 s)、最尤推定は N = 3.41(95%信頼区間:3.25-3.58)およびβ = 6.06 s(95%信頼区間:5.75-6.39 s)でした。

少なくとも3つの動力学ステップの推定は、EcoRVのメカニズムについて知られていることを考えると合理的です。この酵素は、マグネシウム14の非存在下でDNAに非特異的に結合することが知られています。停止流条件下でのEcoRV中のトリプトファン残基の固有蛍光の変化のバルク溶液相観察は、マグネシウム非存在下でDNAに結合したEcoRVは、マグネシウムが活性部位に入る前に立体配座変化を起こさなければならないことを示唆した18。この観察は、結晶構造データ19によって裏付けられる。トリプトファン蛍光研究の結果は、DNA切断と生成物放出が同様の速度で起こる別々のステップであることも示している18。したがって、この実験におけるEcoRVを介したDNA切断の合理的な反応メカニズムは次のとおりです。

ES → ES* → EP → E+P

このメカニズムでは、マグネシウムの非存在下でEcoRVがDNAに事前に結合すると、最初の酵素-基質複合体であるESが形成されます。マグネシウムがフローセルに入ると、酵素-基質複合体は構造変化を起こし、活性化された酵素-基質複合体であるES*になります。この活性化された複合体はDNAを切断しますが、生成物分子をすぐには放出せず、酵素-生成物複合体(EP)になります。最後に、最終ステップで製品Pがリリースされます。このメカニズムには 3 つの手順が必要ですが、これは提示されたデータと一致しています。各ステップの平均待機時間の推定値は ~6 秒で、各ステップの 0.17 s-1 の割合に相当します。この計算は、これらのプロセスの速度の以前の推定値と概ね一致しており、DNA切断と生成物の放出については0.3-0.4 s-1 、コンフォメーション再配列については~0.5 s-1 のオーダーです。

図1:標識されたDNAと酵素の反応模式図。 クォンタムドット標識DNA分子は、ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して官能基化されたガラス表面につながれ、TIRF顕微鏡で観察されます。DNA分子には、目的のREaseの認識部位が含まれています。DNA分子がREaseによって切断されると、量子ドットは表面から離れて照明ゾーンから自由に拡散します。略語:REase =制限エンドヌクレアーゼ;PEG =ポリエチレングリコール;TIRF = 全反射蛍光。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マイクロ流体フローセルデバイス(A)デバイスを作成するために使用された3つの層を示す分解図:底面に機能ガラスカバースリップ、上部に入口と出口の穴があるクォーツスライド、中央にチャネルが切込まれた両面接着イメージングスペーサー。(B)ポリエチレンチューブが所定の位置に密封され、エッジがエポキシでコーティングされた完成したデバイス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ゼロの時点の決定 (A)映画の各フレームで形態学的トップハットフィルタリング機能を使用して決定された平均背景強度。バックグラウンド強度は、フルオレセインを含む実験バッファーが視野に入ると著しく増加します。ここでは、3 つの異なる実験の結果を示します。実験ごとにタイムラグには大きなばらつきがあります。(B)バックグラウンド蛍光強度軌道の変化率の急激な増加により、ゼロ点の正確な決定が容易になります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:背景補正。 マグネシウムの到着を示すフルオレセイントレーサー色素によるバックグラウンド強度の増加は、個々の量子ドットの生の蛍光強度軌道(灰色の軌道)に見ることができます。形態学的トップハットフィルタリング機能を使用して背景を差し引いた後、トレーサー染料によって導入されたアーティファクトは軌道から除去されました(黒色の軌道)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:DNA切断イベントの並列観察のための単一分子TIRF実験。 (A)量子ドット標識DNAを捕捉するように設計された機能化されたガラス表面上に構築されたフローセルは、TIRFイメージング用の高開口60倍油浸顕微鏡対物レンズに直接結合されています。(B)実験開始時の代表的なイメージ。量子ドットで標識されたDNAがフローセルにロードされ、余分な未結合の量子ドットが洗い流されました。DNAにつながれた個々の量子ドットは、互いに分解することができます。(C)DNAテザーを切断する能力を持つREaseを含むバッファーを、マグネシウムの非存在下で4分間流した後、同じ視野。DNAにつながれた量子ドットの大きな損失はありませんでした。(D)実験の終了時の同じ視野。マグネシウム含有バッファーは、マグネシウムフリーバッファーでREaseを流した直後に流路を流れました。この画像は、約 4 分間のバッファー フローの後に取得されました。プレバインディングREaseは、DNAテザーの多くを切断し、表面から量子ドットを放出しています。見やすくするために、各画像には対物レンズ視野の中央の象限のみが表示されています。10フレームの動画フレーム(観測時間の1秒に相当)を平均化することで、量子ドットの点滅の影響を弱めました。明るさとコントラストの設定は、3 つの画像すべてで同じです。(E)実験開始時に量子ドットが存在した画像位置からの代表的な蛍光強度の軌跡。表面から放出されていない量子ドットに対応する画像位置(灰色)から取得された軌跡は、低強度レベルへの短い低下を示す場合がありますが、それらは高強度レベルで始まり、高強度レベルで終わります。画像位置から得られる軌跡は、表面から放出される量子ドット(黒)に対応し、実験の時間分解能(10Hz)に対して瞬間的な低バックグラウンドレベルまで強度が急激に低下することを示しています。放出された量子ドットは、4分間の観測時間内に再び現れることはありません。略語:REase =制限エンドヌクレアーゼ;TIRF = 全反射蛍光。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:EcoRVを介したDNA切断の滞留時間分布分析。 (A)EcoRVを使用した5つのプール実験のセットで、メインアクティビティピーク内で発生する2987切断イベントのヒストグラムと予測エンベロープ。2 つの予測曲線はほぼ同一であり、近似残差 (ヒストグラムの下) は非線形最小二乗近似の系統誤差を示していません。(B)ゼロ時点以降に発生した3393個の切断イベントの全セットのヒストグラム。パラメータの最尤推定によって予測された曲線 (破線なし、MLE 曲線) は、ガンマ確率分布を前提としており、ヒストグラムを囲むことができません。ビンの高さに対するガンマ確率分布の式の非線形最小二乗近似 (破線、NLS 曲線) によって予測される曲線は優れていますが、近似の残差 (ヒストグラムの下) は系統誤差を示します。略語:MLE:最尤推定;NLS = 非線形最小二乗法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: バッファーの表。

ビデオ1:例の単一分子の動画。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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