制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

サマリー

量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、非標識タンパク質を用いた制限エンドヌクレアーゼの反応機構を調べることができます。この単一分子技術により、個々のタンパク質-DNA相互作用の大規模な多重化観察が可能になり、データをプールして、十分に蓄積された滞留時間分布を生成できます。

要約

この新しい全反射蛍光顕微鏡ベースのアッセイは、1回の実験で数百の個々の制限エンドヌクレアーゼ(REase)分子の触媒サイクルの長さを同時に測定することを容易にします。このアッセイはタンパク質の標識を必要とせず、単一のイメージングチャネルで実施できます。さらに、複数の個別の実験の結果をプールして、十分に入力された滞留時間分布を生成できます。その結果得られた滞留時間分布を解析することで、直接観察できない速度論的ステップの存在を明らかにすることで、DNA切断メカニズムの解明に役立てることができます。このアッセイとよく研究されているREaseを用いて収集されたデータの例、EcoRV(回文配列GAT↓ATC(↓は切断部位)を切断する二量体IIP型制限エンドヌクレアーゼ)は、先行研究と一致しています。これらの結果は、EcoRVがDNAに結合した後にマグネシウムを導入することによって開始されるDNA切断への経路には少なくとも3つのステップがあり、各ステップで平均0.17 ^s-1 の割合があることを示唆しています。

概要

制限エンドヌクレアーゼ(REase)は、DNAの配列特異的な二本鎖切断に影響を与える酵素です。1970年代のREasesの発見は、組換えDNA技術の開発につながり、現在では遺伝子組換えや遺伝子操作に欠かせない実験ツールとなっています¹。II型REaseは、認識配列内または認識配列付近の固定位置でDNAを切断するため、このクラスで最も広く使用されている酵素です。しかし、タイプIIのREasesには大きなバリエーションがあり、進化的関係によって分類されるのではなく、特定の酵素特性に基づいていくつかのサブタイプに分類されます。各サブタイプの中には、分類スキームに例外が頻繁にあり、多くの酵素は複数のサブタイプ²に属しています。何千ものType II REaseが同定されており、そのうちの数百が市販されています。

しかし、Type II REasesの多様性にもかかわらず、詳細に研究されたREaseはほとんどありません。1975年にリチャード・ロバーツ卿によって設立された制限酵素データベースであるREBASE^{によると、これらの}酵素のうち公開された動態データは20未満しか入手できません。さらに、一部のREaseは、その認識配列4,5,6,7に遭遇して結合する前にDNAに沿って拡散しながら、単一分子レベルで直接観察されていますが、その切断反応速度に関する単一分子の研究はほとんどありません。既存の研究は、単一の切断事象が発生する時間の変化を詳細に分析するための適切な統計を報告していないか^8,9,10、または切断時間¹¹の完全な分布を捕捉することができない。この種の解析により、比較的長寿命の運動学的中間体の存在が明らかになり、REaseを介したDNA切断のメカニズムの理解を深めることができる可能性があります。

単一分子レベルでは、生化学的プロセスは確率的であり、プロセスの単一のインスタンスが発生するまでの待ち時間τは変動します。ただし、τの多くの測定値は、発生しているプロセスの種類を示す確率分布p(τ)に従うことが期待できます。たとえば、酵素から生成物分子を放出するなどのシングルステッププロセスはポアソン統計に従い、p(τ)は負の指数分布の形を取ります。

ここで、 β は平均待ち時間です。プロセスの速度 k は、平均待機時間の逆数である 1/β に等しくなることに注意してください。複数のステップを必要とするプロセスの場合、 p(τ) は、個々のステップごとに 1 つの指数分布の畳み込みになります。平均待ち時間が同一の N 個の単一指数関数減衰関数の畳み込み ( β) の一般的な解は、ガンマ確率分布です。

ここで、Γ(N) はガンマ関数で、N-1 の階乗と N の非整数値への補間を表します。この一般的な解は、個々のステップの平均待ち時間が類似している場合の近似値として使用できますが、比較的速いステップの存在は、待ち時間が大幅に長いステップによって隠されることを理解する必要があります。つまり、N の値はステップ¹² の数の下限を表します。待機時間測定の数が適切であれば、イベントをビン化してガンマ分布を結果のヒストグラムに適合させるか、最尤推定アプローチを使用して、パラメーター β と N を推定できます。したがって、このタイプの分析は、アンサンブルアッセイでは容易に解決できず、パラメータを正確に推定するために多数の観察を必要とする速度論的ステップの存在を明らかにすることができる^12,13。

この論文では、量子ドット標識DNAと全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用して、REaseを介した数百の個々のDNA切断イベントを並行して観察する方法について説明します。このアッセイの設計により、複数の実験結果をプールすることが可能になり、数千のイベントを含む滞留時間分布を作成することができます。量子ドットの高い光安定性と輝度により、実験開始から数分後でも発生する切断イベントを観察する能力を犠牲にすることなく、10Hzの時間分解能が可能になります。優れた時間分解能と広いダイナミックレンジ、および大規模なデータセットを収集する能力を組み合わせることで、滞留時間分布の正確な特性評価が可能になり、ターンオーバー率が1分^-1 の範囲にあるREaseの切断経路に複数の運動学的ステップが存在することが明らかになります。EcoRVの場合、3つの速度論的ステップを解決でき、そのすべてが他の手段によって特定されており、アッセイがそのようなステップの存在に対して敏感であることが確認されています。

目的の認識配列を含む二本鎖DNA基質は、ビオチン化オリゴヌクレオチドを、共有結合した単一の半導体ナノ結晶量子ドットで標識された相補鎖にアニーリングすることによって生成されます。これらの基板は、ガラスカバーガラスの上に構築された流路に導入され、その表面に高分子量ポリエチレングリコール(PEG)分子が共有結合して芝生に付着しています。DNA基質は、ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して、自由末端にビオチンを持つPEG分子の一部によって捕捉されます。TIRF顕微鏡では、ガラスと液体の界面からの距離とともに指数関数的に減衰するエバネッセント波が照明を提供します。透過深度は、使用する光の波長のオーダーです。これらの条件下では、機能化されたガラス表面に捕捉されたDNA分子によって表面につながれた量子ドットのみが励起されます。溶液中で遊離している量子ドットは、照らされた領域内に制約されないため、発光しません。量子ドットを表面につなぎとめているDNAが切断されると、その量子ドットは表面から自由に拡散し、蛍光画像から消えます。

多くのII型REaseはマグネシウムの非存在下でDNAに結合することが知られているが¹⁴、すべてのREaseはDNA切断を媒介するためにマグネシウムを必要とする¹⁵。これらのREaseは、マグネシウムの非存在下で表面に固定化されたDNAに結合することができます。マグネシウム含有バッファーをDNAにプレバインディングしたREaseのチャネルに流すと、量子ドットの消失が示すように、すぐに切断が始まります。REase分子を事前に結合し、マグネシウムを導入してDNA切断を開始することで同期化を達成することで、実験で観察された酵素集団の各分子について、DNA切断が完了するまでのタイムラグを独立して測定することができます。フルオレセインは、マグネシウムが視野に到着することを示すために、マグネシウム含有緩衝液にトレーサー色素として含まれています。マグネシウム含有バッファーには酵素が含まれていないため、マグネシウム含有バッファーの到着から各量子ドットが消失するまでのタイムラグは、DNAにすでに結合しているREaseがDNAを切断し、ガラス表面から量子ドットを放出するのにかかる時間を示しています。量子ドットの消失は迅速に起こり、強度の軌跡が急激に減少するため、特定のDNA分子が切断される時間を明確に示します。イベント時間の決定は、強度軌道の数学的分析によって行われ、一般的な実験では、何百もの識別可能な切断イベントが得られます。複数の実験の結果をプールして、非線形最小二乗分析または最尤分析によってパラメーター N と β を推定できる適切な統計を提供できます。

プロトコル

1. 一般情報

1. オリゴヌクレオチド設計
   注:60塩基対(bp)長のDNA基質は、100 mM NaCl中の二相融解温度が75°Cの相補的オリゴヌクレオチドのペアから形成されます。
   1. 1つのオリゴヌクレオチドを単一の5'ビオチン修飾で合成し、もう1つを5'チオール修飾(6炭素スペーサー)で合成します。認識サイトを二重化領域の中央に配置します。
      注:EcoRVで使用するオリゴヌクレオチド配列を以下に示します(太字は認識部位)。
      5' ビオチン - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' チオール - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. すべてのステップで18MΩの抵抗率を持つ超純水を使用してください。
3. 量子ドットを含むすべての溶液を光から保護し、光退色を防ぎます。
4. 圧縮空気源を使用して、このプロトコルを完了します。

2. 量子ドット標識DNA基質材料の作製

注:上記のオリゴヌクレオチドの他に、他の材料については 材料の表 を、量子ドット標識DNA基質の調製に必要なバッファーについては 表1 を参照してください。

1. 量子ドットに結合するオリゴヌクレオチド上の5'チオール基を還元します。
   1. 各チオール化オリゴヌクレオチドを100 μMの濃度で水に再懸濁します。
   2. 各オリゴヌクレオチドサンプルについて、650 μLの水をサイズ排除スピンカラムにピペットで移し、ボルテックスで~15秒間ボルテックスします。カラムを30分間保圧します。
   3. DTTは溶液中で急速に分解するため、毎回使用する直前に新鮮な100 mMジチオスレイトール(DTT)溶液を調製します。7.7 mgのDTTを含む1つのバイアルを慎重に開き、500 μLのリン酸ナトリウム緩衝液をバイアルにピペットで移します。渦を巻き上げてじっくりと混ぜ合わせます。
   4. 再懸濁したオリゴヌクレオチドごとに、新しいチューブを調製し、50 μL のオリゴヌクレオチドと 50 μL の DTT 溶液をチューブに加えます。ピペットで上下に動かして混ぜます。室温で30分間インキュベートして、オリゴヌクレオチドの5'末端の酸化チオール基間のジスルフィド結合を減少させます。
   5. スピンカラムのキャップを取り外し、各カラムをコレクションチューブに入れます。スピンカラムを750 × g で2分間遠心分離し、溶出液を廃棄します。
   6. スピンカラムを新しい遠心分離管に移します。DNA/DTT混合物の1つのサンプルの全容量(100 μL)を、調製した各カラムに静かにピペッティングします。750 × g で2分間遠心分離し、260 nmで溶出液の吸光度を測定して、濃度が約40 μMであることを確認します。
   7. すぐに使用しないサンプルは、チオール基の酸化やジスルフィド結合の形成を防ぐために、-20°Cで保管してください。
2. DNAと量子ドットの結合
   1. 作製するコンストラクトごとに、50 μLの量子ドットストックの1アリコートを透析装置にピペットで移し、ピペットチップでメンブレンに触れないようにします。サンプル量の 1000 倍以上の N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸 (CHES) バッファーに対して、~100 rpm で 15 分間攪拌しながら透析します。
   2. 毎回使用する直前に、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)の新鮮な6 mM溶液をCHESバッファーに調製します。2 mgのsulfo-SMCCを含む1つのバイアルを慎重に開き、800 μLのCHESバッファーをバイアルにピペットで移します。渦を巻き上げてしっかりと混ぜます。
   3. ピペッターを使用して、懸濁した量子ドットを透析装置から慎重に取り出し、等量のスルホ-SMCC溶液を含む新しいチューブに移します。ピペットで上下に動かして混ぜます。1000 rpmで振とうしながら室温で1時間インキュベートし、sulfo-SMCCが量子ドット上の第一級アミンと反応します。
   4. ピペッターを使用して、各サンプルを新しい透析装置に慎重に移します。過剰なスルホSMCCを除去するには、透析装置に含まれる容量の少なくとも1000倍のCHESバッファーに対して、攪拌しながら15分間透析します。バッファーを 2 回交換し、新しい CHES バッファーで合計 3 回透析を行い、各バッファー交換の 15 分後に透析を進行させます。
   5. 2回目の反応に備えて緩衝液を交換するには、透析装置を、装置に含まれる容量の少なくとも1000倍の量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むビーカーに移します。15分間撹拌しながら透析し、バッファーを2回交換し、新鮮なPBSで合計3回透析を行い、各バッファー交換後に15分間透析を進行させます。
   6. ピペッターを使用して、透析装置から量子ドットを含む溶液を慎重に回収し、各サンプルをPBSで希釈した等モル量のチオラ化オリゴヌクレオチドを含む新しいチューブに移します。同量のPBSと、還元精製したオリゴヌクレオチドサンプルの1/10の容量(約40 μM濃度)を組み合わせ、この時点での量子ドット濃度は~4 μMです。室温で2時間インキュベートし、1000 rpmで振とうします。
   7. ウシ血清アルブミン(BSA、10 mg/mL)を各サンプルに添加して、最終BSA濃度0.5 mg/mLを得ます。ピペッターを使用して、各サンプルを新しい透析装置に慎重に移し、透析装置に含まれる容量の少なくとも1000倍の容量の記憶バッファーに対して透析します。バッファーを2回交換し、新たに保存したバッファーを合計3回交換して透析を行い、各バッファー交換後に15分間透析を進めることができます。
   8. ピペッターを使用して、各サンプルを慎重に回収し、新しいチューブに入れて、4°Cで保存します。
      注:-20°Cでは、量子ドットが凍結によって損傷を受けるため、保管しないでください。
3. 量子ドット標識オリゴヌクレオチドのビオチン化オリゴヌクレオチドへのアニーリング
   1. 各ビオチン化オリゴヌクレオチドを100 μMの濃度で保存バッファーに再懸濁し、未使用のサンプルを-20°Cで保存します。
   2. 量子ドット標識オリゴヌクレオチドのサンプルを、10倍モル過剰のビオチン化オリゴヌクレオチドと組み合わせます。クォンタムドット標識サンプル中のDNA濃度は推定2 μMであるため、このサンプル10 μLごとに0.2 μLのビオチン化オリゴヌクレオチドを添加します。
   3. ヒートブロック内の混合物を75°C(相補領域の融解温度)に加熱します。その温度で5分間保持します。ヒートブロックの電源を切り、ゆっくりと冷まします。完成したコンストラクトを4°Cで保存します。凍結しないでください。

3. カバースリップの表面機能化

注:このプロセスは、他のJoVEビデオプロトコル^16,17で以前に説明されています。このプロトコルは、小さなスライドガラスに対応するために小さな変更を加えた手順の適応バージョンを説明しています。カバースリップの表面機能化に必要なその他の材料については、材料表を参照してください。

1. 各カバースリップホルダーに5枚のカバースリップを置きます。カバースリップの各ペアの間に1つのスペースをスキップして、カバースリップが互いにくっつかないようにしてください。ホルダーに入れたカバーガラスをカバー付きの瓶に入れ、カバーガラスが覆われるまで瓶にエタノールを加え、上部をしっかりとねじ込みます。瓶全体をバスソニケーターの水に入れ、完全に沈めずに、30分間超音波処理します。
2. きれいなビーカーまたは瓶に超純水を入れます。金属製のピンセットを使用して、ホルダーのカバーガラスをエタノールから取り外し、水に浸してすすぎます。次に、カバースリップとホルダーを1 M水酸化カリウム(KOH)溶液が入った瓶に移します。上部をしっかりとねじ込み、瓶をソニケーターバスに入れ、30分間ソニケートします。
   注意: KOH溶液は腐食性があり、刺激性があるため、取り扱いには注意してください。
3. エタノールとKOH溶液で超音波処理を繰り返し、各ステップの間に上記のようにカバーガラスを水ですすいでください。
4. ホルダーのカバースリップを純粋なアセトンで満たされたきれいな瓶に移します。上記のように瓶を30分間超音波処理してクリーニングを終了します。このステップの後、水ですすがないでください。
5. 金属製のピンセットを使用して、ホルダーのカバーガラスを、80 mLの新鮮なアセトンとマイクロスケールの攪拌子が入ったきれいな100 mLビーカーに移します。ビーカーを少なくとも1,000rpmに設定された磁気攪拌板に置きます。アセトンを激しく攪拌しながら、1.6 mLの3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)をビーカーにピペットで移し、2% v/v溶液を調製します。
   注意:APTESは腐食性があるため、ピペッティングするときは注意してください。
6. カバーガラスを溶液中で2分間インキュベートした後、金属製のピンセットを使用してホルダー内のカバーガラスを水のビーカーに移し、反応を急冷します。カバースリップをさらに2回すすぎ、ビーカーの水を交換します。
7. シラン処理ガラスをオーブンで120°Cで75分間硬化させます。すぐに次のステップに進まない場合は、カバースリップを最大数日間真空下で保管してください。
8. N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル誘導体化ポリエチレングリコール(PEG)を100 mM重炭酸ナトリウム(pH 8.2)に溶解します。メトキシ末端PEGとビオチン末端PEGの比率が10:1で、メトキシ末端PEGは~100 mg/mLです。
9. 100 μLのPEG溶液を乾燥シラン処理カバースリップの半分にピペットで移し、それぞれを2枚目のカバースリップで覆います。各コーナーに配置されたパラフィルムの小片をスペーサーとして使用し、カバーガラスが互いにくっつかないようにします。
10. カバースリップを湿度の高い環境で3.5時間インキュベートします。カバースリップサンドイッチを分離します。噴出ボトルを使用して、各カバースリップを大量の水で洗い、圧縮空気で乾かします。
11. 機能化されたカバースリップは真空下で保管してください。PEG処理面は、反対側がDNA基質を捕捉しないため、必ず上向きにしてください。

4. マイクロ流体デバイスの構築

注意: マイクロ流体デバイスの構築に必要なその他の材料については、 材料の表 を参照してください。

1. テーパーダイヤモンドポイントホイールビットを取り付けたハンドヘルドロータリーマルチツールを使用して、クォーツスライドの反対側のコーナーに2つの穴を開けて、入口と出口として機能します。スライドを所定の位置に固定し、ビットに注油し、穴を開けながら常に水でスライドしてください。各実験の後、使用済みのデバイスをアセトンに浸して接着剤とエポキシを溶解することにより、準備した石英スライドを再利用のために回収します。残りのコンポーネントは破棄します。
   注:穴あけは手で行うことができますが、マルチツールにプレススタイルのホルダーを使用すると、プロセスが容易になります。
2. 25 μLのストレプトアビジン溶液を80 μLのPBSおよび20 μLのブロッキングバッファーと組み合わせます。PEG処理したカバースリップにこの混合物をコーティングし、湿度の高い環境で30分間インキュベートします。
3. カバースリップのインキュベーション中に、イメージングスペーサーを準備して流路を作成します。1インチ四方のイメージングスペーサー材料をカットし、クォーツスライドに開けられた穴の端に位置合わせされた幅2mmのチャネルに印を付けます(図2)。メスでスペーサー素材からチャネルを切り取ります。
4. イメージスペーサーの裏地の片側をはがし、入口と出口の穴を覆わないように注意しながら、クォーツスライドに慎重に置きます。クォーツスライドをアセトンで完全に洗浄し、以前の実験で残った接着剤を取り除いてください。
5. カバーガラスを水で洗い、圧縮空気で乾かします。イメージングスペーサーから裏地の反対側を取り外し、クォーツスライドと機能化されたストレプトアビジンコーティングされたカバースリップの間に挟み込み、プラスチックピンセットを使用してアセンブリを一緒に押し付け、接着剤から気泡を取り除きます。
6. 長さ30cmのポリエチレンチューブを1本、石英スライドの各穴に挿入します。溶液が自由に流れるように、チューブの端を斜めに切断してください。チューブラックまたはその他のサポートを使用してチューブを所定の位置に保持し、チューブを所定の位置にシールし、組み立てたデバイスの端をエポキシでシールします。
   注:パラフィルムの上にデバイスを構築するとうまく機能し、エポキシが固まったときに底から簡単に剥がすことができます。
7. エポキシ樹脂が固まったら、空のシリンジの鈍い針をデバイスの出口チューブに挿入し、入口チューブの端をブロッキングバッファーで満たされた容器に浸します。シリンジプランジャーを引き戻して、デバイスにブロッキングバッファーを充填します。使用前に、デバイスを少なくとも30分間インキュベートしておきます。

5. 量子ドット標識DNA基質の表面テザリング

注:上記のマイクロ流体デバイス、DNA基質、およびブロッキングバッファーの他に、他の材料については Table of Materials を、量子ドット標識DNA基質の表面テザリングに必要なバッファーについては Table 1 を参照してください。

1. マイクロ流体デバイスを顕微鏡ステージプレートにテープで取り付け、対物レンズをデバイスの底部に接触させ、視野がマイクロ流体チャネル内に来るように対物レンズを配置します。
2. アウトレットチューブをシリンジポンプに接続した後、シリンジプランジャーを引き戻して、マイクロ流体チャネルを新しいブロッキングバッファーで洗い流します。チューブやチャネルに気泡が溜まっていないことを確認してください。
   注意: この時点から、気泡がデバイスに導入されないように、インレットチューブが液体になっていることを確認してください。
3. 調製したDNA基質1 μLをブロッキングバッファー1 mLに希釈します。インレットチューブを希釈したDNA基質に入れ、800μLの基質溶液をチャネルに200μL/minの速度で流します。DNA溶液を、流れが止まってから15分間、邪魔されずにチャネル内でインキュベートします。
4. 少なくとも800 μLのブロッキングバッファーを200 μL/minの速度でチャネルに流し、結合していないDNAをチャネルから洗い流します。
5. レーザー出力、顕微鏡の焦点、TIRF角度を調整して、表面につながれた量子ドットがはっきりと見えるようにします。
   注:量子ドットはすぐには漂白しませんが、まばたきを最小限に抑えるために、パワーをできるだけ低く保つことが最善です。

6. REaseを介したDNA切断

注:材料については 「材料の表 」を、REaseを介したDNA切断に必要なバッファーについては 「表1 」を参照してください。

1. カメラが最適な動作温度に冷却され、露光時間が0.10秒の高速ストリーミングに設定されていることを確認してください。~4分間のデータ収集を覚悟してください。
2. マイクロ流体デバイスをマグネシウムを含まない800μLの実験用バッファーで200μL/minの流速でフラッシュします。
3. マグネシウムを含まない実験バッファーのアリコート(1 mL)にREaseを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。100,000ユニット/mLのストックを4μL使用してください(これはEcoRVの400ユニット/mLに相当します)。希釈した酵素800μLを200μL/minの流速でチャネルに流します。
4. マグネシウムとフルオレセインを含む実験用バッファーを200 μL/minの流速で流すことから実験を開始します。シリンジポンプを始動した直後にデータのキャプチャを開始します。800μLのバッファーを流した後、データ取得を停止します。

7. データ分析

注:このプロトコルに使用されているデータ解析ソフトウェアの 資料表 を参照し、別の解析プラットフォームを使用している場合は調整してください。

1. ゼロ時点の決定
   1. Image Processing Toolbox に組み込まれている形態学的トップハット フィルタリング関数である imtophat 関数を使用して、実験映画の各フレームから背景蛍光を差し引きます。半径が 3 ピクセルのディスクを構造化要素として選択します。元の画像からフィルタリングされた画像を差し引いて、背景の強度を取得します。
      注:フィルターは、背景よりも明るく、構造化要素よりも小さい画像の特徴のみを保持します。
   2. 各ムービーフレームで減算された背景を平均化します。この値の軌跡を使用して、実験のゼロ時点を決定します(図3A)。デッドボリュームフロー中の変化率の標準偏差の3倍を超える増加率の最初のフレームを見つけて、開始時間を決定します。
      注:各ムービーフレームについて減算された背景の平均値の変化率の急激な増加は、トレーサー色素を含む最終的な実験バッファーがフローセルに入った時間を示します(図3B)。
2. 量子ドット強度軌道計算・解析
   1. トレーサー色素が到着する前に記録された背景補正されたムービーフレームのセットの最大強度投影を計算します。この投影画像では、 pkfnd などのピーク検出関数を使用して、量子ドットの位置を 1 ピクセルの精度で決定します。
   2. ピーク検出関数によって返された位置を囲む辺あたり 3 ピクセルの正方形領域の各ムービー フレームの平均強度を計算することにより、個々の量子ドットの強度軌跡を生成します。
      注:上記の背景補正により、トレーサー染料によって導入されたアーティファクトが除去されます。結果として得られる強度の軌跡は比較的平坦であるべきですが、それでも自然に発生する強度の変動が含まれています(図4)。
   3. 強度軌跡の統計解析により、量子ドットの消失事象を特定します。各量子ドット強度の軌跡について、軌跡で観測されたノイズに応じて、その軌跡の最大値と最小値の差の適切な割合で最小値を上回るしきい値強度を計算します。
      注:量子ドットの強度変動は、通常、バックグラウンド変動よりもはるかに大きくなります。適切な値は、これらの値を比較することによって決定できます:選択される閾値は、最も高いバックグラウンド値よりも高くなければなりませんが、理想的には量子ドット蛍光の最も低い値よりも低くなければなりません。提示されたデータでは、使用されたしきい値は、各軌跡の最小値に、その軌跡の最大値と最小値の差の 3 分の 1 を加えた値を超えるように計算されました。量子ドットは、その位置で観測された強度がこの閾値を超えた最後の時点で消失したと見なすことができます。
   4. 推定される失踪イベントを確認します。観測された強度が、消失前の映画フレームの半分以上で軌道の最小強度値と最大強度値の中間点を超えており、イベント後に強度軌跡の標準偏差が減少した場合にのみ、最終解析にイベントを含めます。
      注:有効な失踪イベントのみが記録されるように、他の統計的検定を採用する場合があります。

結果

フローセルは、レーザー照明を備えた倒立顕微鏡の高開口油浸倍率60倍対物レンズに直接結合され、対物レンズTIRFイメージングを実現します(図5A)。DNA基質を導入し、余分なDNAと量子ドットを洗い流した後、通常、視野内には数千の個々の量子ドットがあります(図5B)。これらの量子ドットはガラス表面に安定して付着しており、実験の時間スケールで目立った減光や大幅な漂白を受けることはありません。しかし、マグネシウムと適切なREaseの両方を含むバッファーを流路に流すと、通常の4分間の観察時間の終わりには、実験開始時に存在していた量子ドットの少なくとも30%が視野から消えていることになります。マグネシウムの必要量を確認すると、マグネシウムが存在しない状態でREaseをチャネルに流すと、実験開始時に存在していた量子ドットの少なくとも95%が観察期間の終了時にも確認できる(図5C)。しかし、マグネシウム非存在下でREaseが表面結合DNAに結合した直後にマグネシウム含有バッ...

ディスカッション

このアッセイのDNA基質は、sulfo-SMCCを用いた2段階の反応スキームを用いて量子ドットで標識されています。この二官能性架橋剤は、第一級アミンと反応できるNHSエステル部分と、スルフヒドリル基と反応できるマレイミド部分で構成されています²⁰。基質の調製に使用されるチオール化オリゴヌクレオチドは、酸化された形で出荷されます。カップリング手順を進める前に、説明したようにそれらを還元および精製することが重要であり、さもなければカップリング反応の効率が低下するであろう。使用直前に新鮮なDTTおよびスルホ-SMCC溶液を調製することが重要です。これらの分子は水溶液中で急速に加水分解します。透析装置に溶液を出し入れするときは注意してください-ピペットの先端がメンブレンに触れると破裂し、サンプルが失われます。サンプルの損失を避けるために、セクション2のすべてのステップを中断することなく完了することが理想的です。

量子ドット標識オリゴヌクレオチドの生成に使用されるカップリング反応は非効率的です。量子ドット標識オリゴヌクレオチドをビオチン化オリゴ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)	シグマAldrich	440140-100ML	乾燥器ボックス5
分エポキシ	Devcon	20845	のマイクロ流体デバイスのシールのための使用
トン	Pharmco	329000ACS	は、カバースリップ
バス超音波処理器	フィッシャーサイエンティフィック	CPXHモデル2800	カタログ番号15-337-410
をシールするための使用ビーカー、ガラス、100mL
卓上遠心分離機
ビオチン-PEG-吉草酸エスクリンイミジル(MW 5,000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	吉草酸エスクリンイミジルは、炭酸スクシンイミジル
オチン化オリゴヌクレオチド	Integrated DNA Technologies	カスタム - 設計上の考慮事項については、プロトコルを参照してください	リクエスト5 'ビオチン修飾とHPLC精製
ウシ血清アルブミン(BSA)	VWR	0903-5G	は、10 mg / mL溶液(aq)を調製し、95°Cに加熱します。
Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns	Princeton Separations	CS-100 または CS-101	ジスルフィド結合を還元した後にチオール化オリゴヌクレオチドを精製
遠心分離チューブ 1.5. mL
カバースリップ、1 インチ角ガラス
カバースリップホルダー
ダイヤモンドポイントホイール	ドレメル	7134	石英フローセルトッパー
ジチオスレイトール (DTT)	Thermo Scientific	A39255	無重量フォーマット、7.7 mg/バイアル
ドリルプレス回転工具ワークステーションスタンド	ドレメル	220-01	は、石英掘削
を容易にします EcoRV (REase はサンプルデータの生成に使用されます)	ニューイングランドバイオラボ	R0195T または R0195M	100,000単位/ mLのストックを使用して、過剰なグリセロールの追加を避けるため、他のREasesエタノールの供給者のためのREBASEを確認してください
	変		性または95%は許容され、カバースリップのクリーニングに使用
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマアルドリッチ	EDS	BioUltra、無水、乾燥器ボックスに保存
ノミマイクロスピンバー	フィッシャーブランド	14-513-65	カバースリップラックの下に収まる3 mm x 10 mmサイズ
フルオレセイン	Acros Organics	17324	実験バッファーを作るために使用
重力対流オーブン	バインダー	9010-0131
ハンドヘルドロータリーマルチツール	ドレメル	8220	石英フローセルトッパーの穴あけに使用
ImagEM X2 EM-CCD カメラ	浜松	C9100-23B	この実験には空冷が適しており、HCImageソフトウェアなどを使用して、
イメージングスペーサー、両面、接着
ジャー、スクリューキャップ付きガラス、(直径約50mm×高さ50mm)
塩化マグネシウム六水和物	ッシャーバイオ試薬	BP214-500	を使用して、マグネシウム
MATLABソフトウェア		で実験用バッファーを作成します	データ分析
ピンセット	フィッシャーブランド	16-100-110
メトキシ-PEG-吉草酸エスクシンイミジル (MW 5,000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	両方のPEGは、反応速度が一貫しているように同じNHSエステルを持つ必要があります
微量遠心分離	エッペンドルフ	5424
ポジションマグネチックスターラーVWR		12621-022
N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9、
微量遠心チューブ用のCHESバッファーオービタルシェーカーおよびヒーター	Q Instruments	1808-0506	24 x 2.0 mLまたは15 x 0.5 mLチューブ用の1808-1061アダプター付き
フィルム
PE60ポリエチレンチューブ(内径0.76 mm、外径1.22 mm)	Intramedic	6258917	22 Gの鈍い針は、このチューブサイズに適しています
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	1倍の強度で使用
水酸化カリウム	VWRケミカルズ BDH	BDH9262	1M溶液を使用してカバースリップを洗浄します
Qdot 655 ITK アミノ (PEG) 量子ドット	Invitrogen	Q21521MP
クォーツスライド、1インチ四方、厚さ1mm	電子顕微鏡科学	72250-10	は、入口と出口のチューブ挿入強化プラスチックピンセットのコーナーにドリルで開ける必要があります
	Rubis	K35a	は、カバースリップの取り扱いとマイクロ流体デバイスの構築に使用します
SecureSeal接着シート	Grace Biolabs	SA-S-1L	マイクロ流体デバイス用のスペーサーを形成するためにカット
マイクロ流体用シングルチャネルシリンジポンプ	新時代のポンプシステム	NE-1002X-US	50 mL シリンジと 22 G の鈍針
Slide-a-Lyzer MINI 透析装置、10 kDa MWCO、0.1 mL	Thermo Scientific	69570 または 69572	への量子ドット結合時のバッファー交換に使用されます
			。表面官能基化用のバッファーを作製するために使用、100 mM、pH 8
塩化	Macron	7581-12	実験緩衝液リン酸
ナトリウム二塩基性溶液(BioUltra、水中0.5M)	シグマAldrich	94046	は、100 mMリン酸ナトリウム緩衝液
ナトリウム一塩基性溶液(BioUltra、水中5M)	Sigma Aldrich	74092	100 mMリン酸ナトリウム緩衝液
StreptavidinのpHを調整するために使用します<>Streptomyces avidinii	Sigma Aldrich	S4762	1 mg/mL で溶解し、25 mL aliqouts を -20 ?
スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)	Thermo Scientific	A39268	No-Weigh Format、2 mg/バイアル
シリンジ、鈍い 21 G ニードル
シリンジポンプ
チオレートオリゴヌクレオチド	Integrated DNA Technologies	カスタム - 設計上の考慮事項	についてはプロトコルを参照してくださいリクエスト5 'チオール修飾子C6 S-SおよびHPLC精製
TIRFイメージングシステム、488 nmレーザー照明、	さまざまな		カスタムビルド
のTris-HCl	研究製品インターナショナル	T60050	を使用して実験バッファーを作成
Trisベース	JTベイ	カー4101	を使用して実験
	Sigma	P7949	ブロッキングを行いますバッファー
超純水
ボルテックス	ミキサーVWR	10153-842
Wash-N-Dry Coverslip Rack	Electron Microscopy Sciences	70366-16	カバースリップの表面機能化に使用されます