大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

サマリー

ここでは、遺伝子コード拡張を用いてアセチル化ヒストンタンパク質を発現し、再構成されたヌクレオソームをインビトロで組み立てる方法を紹介する。

要約

アセチル化ヒストンタンパク質は、変異体をコードする大腸菌、N ε-アセチルリジン(AcK)特異的メタノサルシナマジピロリシンtRNA合成酵素(MmAcKRS1)およびその同系tRNA(tRNA^Pyl)を組み立てるために容易に発現することができる。MmAcKRS1 および tRNA^Pylは、大腸菌での翻訳中に選択した mRNA の中で、黄色の変異部位で AcK を送達します。この技術は、H3リジンサイトでAcKを組み込むために広く使用されています.ピロリシル-tRNA合成酵素(PylRS)は、部位特異的なタンパク質修飾または機能化のために他の非カノニカルアミノ酸(ncAAs)を組み込むために容易に進化させることができる。ここでは、MmAcKRS1システムを用いたAcKをヒストンH3に組み込み、アセチル化H3タンパク質を再構成された単核球体に統合する方法を詳述する。アセチル化再構成単核体は、生化学的および結合アッセイ、構造決定、およびよりに使用することができる。新しい相互作用の発見やエピジェネティクスの理解に関連する実験を設計するには、改変単核体を得ることが重要です。

概要

我々は、PylRSおよびtRNA^Pylを利用して、部位特異的アセチル化ヒストンを有する再構成単核体を合成および組み立てる。PylRSは、翻訳後修飾(PTM)を用いてタンパク質を産生する遺伝コード拡張ツールとして非常に価値があることが証明されており、約200の異なるncAAを組み込むために遺伝的に進化してきました。PylRSは、アンバーストップコドンで組み込み、翻訳中に他のアミノ酸との競合を除去します。PylRSは、メタノジェニック古風で初めて発見され、その後、新しい反応性化学基をタンパク質^1,2に組み込むために化学生物学に利用されている。

MmAcKRS1はメタノサルシナ・メイジ・ピルスから進化し、アセチル化タンパク質^{3、4、5、6}の合成のために私たちの研究室で頻繁に使用されました。MmAcKRS1は、大腸菌での翻訳中に選択したmRNAの中で、黄色の突然変異部位でAcKを提供する。この技術は、以前にK4、K9、K14、K18、K23、K27、K36、....

プロトコル

1. プラスミド建設

1. まず、ヒストンタンパク質がアセチル化され、どのリジン部位でアセチル化されるか決定します。サイト指向変異誘発を用いて、サイトをアンバーストップコドン(TAG)に変異させる。
   注:ヒストンタンパク質の発現に利用される4つの以前に設計されたプラスミドがあります。4つのヒストンタンパク質はすべて、N末端ヒスチジンタグを用いてpETDuet-1ベクターにクローン化された。ヒストンH4はまた、SUMOタグ、約40のコピー数を有する複製 colE1 の起源、アンピシリン耐性、およびT7プロモーターを含む。
   1. 4つのヒストンタンパク質プラスミドの1つで、目的の部位にTAG突然変異を含む前方および逆プライマー(既存のリジンコドンをアンバーストップコドンに置き換える)を設計します。
   2. プラスミドを含むタグを増幅するために、全プラスミドPCRを使用してください。プライマーに適したアニーリング温度を決定します。一般に、プライマーから5°Cを引いた融解温度_(Tm)で十分です。PCR産物の入手が困難な場合、T m~5°C付近の温度勾配を使用して、アニーリング温度を最適化して増幅することができます。
      注:この実験では、30 sの94°C(変性)、30秒のアニーリング温度、6分間(またはキロベースペアあたり1分)の72°Cの条件で、30サイクルに対して、社内で表現されたPFUポリメラーゼを使用しました。このタイプの....

結果

ダイマー、テトラマー、および八重差は、12% SDS PAGEゲルを実行することによって評価できます (図 1および図 2)。ここでは、アセチル化四量体の一部が他のテトラマーよりも低い収率を持っていることがわかります(図1)。実際、コア領域に近いほど、収率は低く見られます。これは、アセチル化が四量体の組み立てに干渉するため、コア領域に近づく可能性が最も高いです。オクタマーを組み立てた後も同様の影響が認められる(図2)。601 DNA配列を有するオクターマーを組み立てた後、ヌクレオソームは、5%1x TBE Native PAGEゲルを用いて、臭化エチジウムによる染色を行い、それを用いて評価することができる(図3)。TEV消化前に、10k基底対マーク付近ではヌクレオソームバンドが.......

ディスカッション

実験中にこのプロトコルを詳細に従うことは不可欠です。ヌクレオソームは非常に安定しておらず、多くの試行錯誤がこのプロトコルを決定することに入っています。粒子状物は容易に組み立てプロセスを妨げる可能性があるので、すべてのステップ(または観察されるたびに)で沈殿物を除去することが重要です。常にヒストンサンプルを氷の上に置いてください。ヌクレオソームが4°Cで長時間保存されている場合、自発的に分解することができます。実験で使用する前に2週間以上4°Cで保存されている場合は、ネイティブPAGEでサンプルを確認してください。これはまた、それらを分解する原因となる可能性がありますので、渦オクターやヌクレオソームを避けてください。ダイマー、テトラマー、または八重奏体の組み立てに問題が発生した場合、これは通常、タンパク質の質が悪いという指標です。タンパク質の品質を15%SDS-PAGEで確認してください。タンパク質の純度が低い場合の1つの選択肢は、純粋な水に対してタンパク質を透析することです。これは、重い沈殿を引き起こし、タンパク質の収量を大幅に減少させるが、より純粋なサンプルを生成します。ヒストンアセチル化部位の組み込みおよびヌクレオソーム安定性は大き.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5 M TE バッファー	NA		NA 0.5 M NaCl、20 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.8
1 M TE バッファー	NA	NA	1 M NaCl、20 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.8
100x TE バッファー	NA
NA 2			M NaCl、20 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.8
20 mM TE バッファー	NA		NA 20 mM NaCl、 20 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.8
6 M GuHCl			6M 塩化グアニジン、20 mM Tris、500 mM NaCl、pH 8.0
アセチルリジン
カラム洗浄バッファー	NA	NA	6 M 尿素、500 mM NaCl、20 mM Tris、20 mM イミダゾール pH 7.8
溶出バッファー	NA	NA
Fisherbrand 可変流量薬液移送ポンプ	フィッシャーサイエンティフィ	15-077-67
His-TEV プロテアーゼ
ヒストン溶解バッファー	NA		NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA 樹脂			6 M 尿素, 500 mM NaCl, 20 mM トリス, 250 mM イミダゾール, pH 7.8
PCR クリーンアップキット	Epoch Life Sicences	2360050
ペレット洗浄バッファー	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
保存バッファー	NA	NA	20 mM NaCl、20 mM トリス、20 mM NaCl、1 mM EDTA、20% グリセロール、pH 7.8
サーモサイクラー

ック petDUET-His-TEV-H2B