シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

植物は生物的ストレスから逃れることができない、例えば、昆虫がそれらに餌を与える、彼らは検出し、その後、草食¹などの課題から身を守るために高度なストレスセンシングと信号伝達システムを進化させた。傷や草食動物の攻撃の際に、植物は負傷部位だけでなく損傷を受けていない遠位器官においても植物ホルモンジャスモン酸(JA)の蓄積を含む迅速な防御反応を開始する^2。このJAは、両方の直接損傷した組織の防御応答をトリガし、先制的に、損傷していない部分の防御を誘導します。シロイヌナズナでは、傷によるJAの蓄積が遠位で検出され、無傷の葉は、傷ついた葉³から急速かつ長距離信号が伝達されていることを示唆する植物の他の場所で損傷のほんの数分の範囲内で検出された。^Ca2+、活性酸素種(ROS)、および電気信号などのいくつかの候補は、植物^4、5におけるこれらの長距離創傷信号として機能するように提案されている。

Ca²⁺は、真核生物の中で最も汎用性が高く、ユビキタスな第二のメッセンジャー要素の1つです。植物では、毛虫の咀嚼と機械的傷害は、傷ついた葉の中と傷ついていない遠葉^6,7の両方で、細胞細胞体^Ca2+濃度([Ca2+]cyt)の急激な増加を引き起こす。この全身^Ca2+シグナルは、細胞内^Ca2+センシングタンパク質によって受信され、JA生合成^8,9を含む下流の防御シグナル伝達経路の活性化につながる。植物創傷応答における^Ca2+信号の重要性を支持する多数のそのような報告にもかかわらず、創傷によって誘発される^Ca2+信号の空間的および時間的特性に関する情報は限られている。

遺伝的にコードされたCa²⁺指標を用いたリアルタイムイメージングは^、Ca2+信号の空間的および時間的ダイナミクスを監視し、定量化するための強力なツールです。現在までに、このようなセンサーのバージョンは、単一の細胞のレベルでCa²⁺信号の可視化を可能にする開発された、組織、臓器、さらには植物全体¹⁰に。植物に使用される^Ca2+の最初の遺伝子組み換えバイオセンサーは、クラゲエーコレアビクトリア¹¹に由来する生物発光タンパク質aequorinであった。 この化学発光タンパク質は、植物12、13、13、14、15、16、17、18の様々なストレスに応じて^Ca2+の変化を検出するために使用されていますが、非常に低い発光シグナルのためにリアルタイムイメージングには適していません。黄色のカメレオンのようなフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)ベースのCa²⁺指標は、植物^{19、20、21、22、23、24}における^Ca2+シグナル伝達事象の範囲のダイナミクスを調査するためにも成功して使用されています。これらのセンサは、イメージングアプローチと互換性があり、最も一般的には、カ²⁺結合タンパク質カルモジュリン(CaM)とミオシン軽鎖キナーゼからのCaM結合ペプチド(M13)で構成され、いずれも2つのフルオロフォアタンパク質の間で融合され、一般的にはシアン蛍光タンパク質(CFP)と黄色蛍光タンパク質(YFP)10^である。CaMへの^Ca2+結合はセンサーの立体構造変化をもたらすCaMとM13の間の相互作用を促進する。この変化は、CFPとYFP間のエネルギー伝達を促進し、CFPからの蛍光放射を減少させながらYFPの蛍光強度を増加させる。CFPからYFP蛍光へのこのシフトを監視すると、Ca²⁺レベルの増加の尺度が提供されます。これらのFRETセンサーに加えて、GCaMPやR-GECOなどの単一蛍光タンパク質(FP)ベースのCa²⁺バイオセンサーは、植物イメージングアプローチと互換性があり、高感度と使いやすさ25、26、27、28、29、30による_cyt変化の研究に広く使用されています。GCAMPは、単一の円形に分通(cp)GFPを含み、再度CaMとM13ペプチドと融合する。CaMとM13の間の^Ca2+依存的相互作用は、cpGFPのプロトネーション状態の変化を促進するセンサーの立体構造変化を引き起こし、その蛍光シグナルを増強する。従って、Ca²⁺レベルが上昇するにつれて、cpGFP信号は増加する。

機械的な傷や草食に応答して発生する^Ca2+シグナルのダイナミクスを調べるには、GCaMP変異体を発現するトランスジェニックなシロイナナ植物、GCaMP3、および広視野蛍光顕微鏡⁶を用いた。このアプローチは、葉の創傷部位から植物全体への長距離^Ca2+信号の迅速な伝達を視覚化することに成功した。したがって、創傷部位で^[Ca2+]cytの増加がすぐに検出されたが、この^Ca2+信号は、創傷の数分以内に血管系を通って隣接する葉に伝播した。さらに、この急速な全身創傷シグナルの伝達が、2つのグルタミン酸受容体様遺伝子、グルタミン酸受容体様(GLR)、GLR3.3、GLR3.66の変異を有するシロイヌズナシス植物において消滅することを発見した。 GLRsは、創傷応答^3、花粉管成長^31、根発発生^32、寒冷応答^33、および自然免疫³⁴を含む多様な生理学的プロセスに関与するアミノ酸ゲート^Ca2+チャネルとして機能するように見える。このよく理解されているにもかかわらず、GLRsの広範な生理学的機能、それらのリガンド特異性、イオン選択性、および細胞内局在性などのそれらの機能特性に関する情報は^、35に制限されている。しかし、最近の研究では、GLR3.3とGLR3.6がそれぞれフロレムとキシレムに局在していると報告されています。植物GLRsは、哺乳動物におけるヨノトロピックグルタミン酸受容体(iGluRs)36と類似しており、哺乳類神経系³⁷におけるグルタミン酸、グリシン、およびDセリンなどのアミノ酸によって活性化される。実際に、創傷部位における100mMグルタミン酸の適用は、他のアミノ酸ではなく、シロイヌナズナでの高速の長距離^Ca2+シグナルを誘導することを実証^した。この応答は、グルタミン酸がこれらの受容体様チャネルの一方または両方を介して作用し得ることを示唆するglr3.3/glr3.6突然変異体において廃止され、実際に、AtGLR3.6は、これらのレベルのグルタミン酸³⁸によってゲート化されるのが最近示された。

植物では、構造アミノ酸としての役割に加えて、グルタミン酸は主要な発達レギュレータ³⁹として提案されている。しかし、その空間的および時間的なダイナミクスは十分に理解されていません。Ca²⁺と同様に、グルタミン酸に対する遺伝的にコード化された指標は、生細胞^{40, 41}におけるこのアミノ酸のダイナミクスを監視するために開発されています。iGluSnFRは、エシェリヒア・コリ^42,43由来のcpGFPおよびグルタミン酸結合タンパク質(GltI)で構成されるGFPベースのシングルFPグルタミン酸バイオセンサ^である。グルタミン酸結合によってGltIに誘導されるiGluSnFRの立体構造変化により、GFP蛍光発光が増強される。細胞外グルタミン酸が植物創傷応答においてシグナル伝達分子として働くかどうかを調べるため、iGluSnFR配列を基本的なキチナーゼシグナルペプチド分泌配列(CHIB-iGluSnFR)と結合し、このバイオセンサを再生不良空間6に局地化^した。このアプローチにより、このセンサを発現するトランスジェニックなシロイヌナズナシス植物を用いた、無形成グルタミン酸濃度([Glu]apo)の変化を画像化することができました。創傷部位でのiGluSnFRシグナルの急激な増加を検出した。このデータは、グルタミン酸が損傷した細胞/組織から創傷時にアポプラストに漏れ出し、GLRsを活性化し、植物⁶における長距離^Ca2+信号につながる損傷信号として作用するという考えを支持する。

ここでは、傷6に応答して長距離^Ca2+ および細胞外グルタミン酸シグナルのダイナミクスを監視および分析するために、遺伝的にコードされたバイオセンサーを用いた植物全体のリアルタイムイメージング^{方法について述}べている。遺伝子組み換えバイオセンサーを発現する広視野蛍光顕微鏡およびトランスジェニック植物の利用可能性は^、Ca2+ 波などの高速に伝達された長距離信号を検出するための強力で簡単に実装されたアプローチを提供します。

1. 植物材料の準備

1. 1.5 mLマイクロチューブでは、GCaMP3またはCHIB-iGluSnFRを20%(v/v)NaClOで3分間振盪し、滅菌蒸留水で5回洗浄することにより、 シロイヌナズナ (Col-0加盟)植物の種子を表面に殺菌します。
   注:GCaMP3またはCHIB-iGluSnFRを発現する シロイヌナズナの トランスジェニックラインは、前に⁶を説明しました。
2. 無菌フードに、30 mLの無菌(オートクレーブ)ムラシゲとスクーグ(MS)培地[1x MS塩] 1%(w/v)スクロース、0.01%(w/v)ミオイノシトール、0.05%(w/v)MESおよび0.5%(w/v)ジェランガム;pH 5.7は1N KOHで調整された。蓋を交換し、外科テープで包みます。
3. 4°Cで2日間暗くインキュベートした後、使用前に約2週間、連続光(90-100 μmol^m-2 s^-1)下の成長室でプレートを22°Cに水平に置きます。2週間後、最年長から最年少⁴⁴のシロイヌナズナの葉の数を数える(図1)。傷の応答は、損傷した葉(n)からn番±3およびn±5⁶に優先的に移動する。
   注:このプロトコルでは、ペトリ皿は、蛍光顕微鏡の下で創傷およびグルタミン酸効果をイメージングするために開かれます。したがって、この実験の後続のステップは、温度と湿度制御室の条件下で行われるべきです。これは^、Ca2+ 信号もこれらの環境条件の変化によって引き出されるためです。また、バイオセンサタンパク質の蛍光の励起のために記録中に顕微鏡から放出される青色光は、細胞質^Ca2+ 濃度⁴⁵ の増加を引き起こす可能性があるため、実験を開始する前に数分間植物を青色光照射に順応させるべきであることも知られている。

2. 化学製剤

1. L-グルタミン酸を液体増殖培地に溶解する[1/2x MS塩、1%(w/v)スクロース、0.05%(w/v)MES;pH 5.1を1N KOHで調整して100mMの作業溶液を作る。
   注:Ca²⁺ ダイナミクスに対するカチオン関連の影響を防ぐために、グルタミン酸ナトリウムなどのグルタミン酸塩の使用を避けてください。

3. リアルタイムイメージングの実施と顕微鏡

1. 1x対物レンズ(NA=0.156)とsCMOSカメラ(図2)を搭載した電動蛍光体顕微鏡をオンにし、470/40 nm励起光を照射し、535/50nmフィルタを通過する発光光を取得するようにデバイス設定を行います。
   注:GFPに敏感な蛍光顕微鏡は、GCaMP3およびiGluSnFR信号をリアルタイムで検出するために使用できますが、低電力対物レンズと広いsCMOSチップを備えた高感度カメラを使用して、プラント全体からの信号を取得することをお勧めします。低電力の目的は 、シロイヌナズナ ズ植物全体の応答をイメージングし、高感度カメラの使用を可能にし、創傷誘発Ca²⁺ 波の急速な時間経過をキャプチャするために必要な高速データ取得を可能にします。本研究で使用される蛍光顕微鏡の場合、視野の最大値と時間分解能はそれぞれ3cm x 3 cmおよび30フレーム/秒(fps)である。
2. 蓋を外し、皿を対物レンズの下に置きます。
3. 植物からの蛍光シグナルを確認し、植物が新しい環境条件に適応するまで暗闇の中で約30分待ちます。この適応ステップは、湿気の変化が傷に関連する事象を妨げる可能性のある植物の_[Ca2+]cytの上昇を引き起こすので必要である。
4. 視野の植物全体を見るために焦点と拡大を調整します。現在のプロトコルでは、0.63倍の倍率が使用されました。
5. リアルタイムイメージングを開始する前に、取得パラメータを設定して、顕微鏡イメージングソフトウェアを使用して蛍光信号を検出します。現在のプロトコルでのイメージングの設定は、露出時間と間隔時間をそれぞれ 1.8 s および 2 s (つまり 0.5 fps) に設定します。記録時間を11分に設定します。
6. 実験を開始する前に5分間画像を使用して、植物を顕微鏡から青色光照射に順応させ、次に「 今すぐ実行」をクリックするか、または使用している顕微鏡ソフトウェアの同等のコマンドをクリックして記録を開始します。平均ベースライン蛍光を決定するには、巻き付けまたはグルタミン酸塗布前に少なくとも10フレーム(すなわち、現在のプロトコルに少なくとも20 s)を記録する(セクション4参照)。
   1. 創傷誘発^[Ca2+]_の部位および[Glu]_アポ変化のリアルタイムイメージングについては、葉L1のペチオールまたは中間領域をハサミで切断する(図3および図4)。
   2. グルタミン酸誘発^[Ca2+]_シト変化のリアルタイムイメージングでは、葉1の縁(先端から約1mm)をハサミで主静脈に切ります。少なくとも20分の回収期間の後、葉の切断面に100 mMのグルタミン酸の10 μLを適用する(図5)。
      注:このプレカットは、応答をトリガするために葉アポプラストへのグルタミン酸アクセスを可能にするために必要でした。さらに、葉L1の切断面に蒸留水の滴を塗布することは、グルタミン酸を塗布する前に回収中にサンプルが乾燥するのを防ぐために重要であることが判明した。
7. 11分記録を終えた後、データを保存します。

4. データ分析

1. 時間経過に関する蛍光強度解析では、蛍光強度を分析する場所で対象領域(ROI)を定義します(図6 および 図7)。Ca²⁺ 波の速度計算では、解析用の 2 つの ROI(ROI1 および ROI2)を定義します。イメージングソフトウェアで、[ 時間測定]をクリック||の定義サークル.[注釈]と[計測]をクリックしてROI1とROI2の間 の距離を測定|長さ|単純線 (図 6)。
2. [Measure] をクリックして、各 ROI の生蛍光値 (F) を時間の経過とでも 測定します。未処理データをスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートし、蛍光信号を各時点で [すべて] をクリックして数値 に変換|エクスポート.
3. 記録されたデータの最初の10フレーム(すなわち治療前)のFの平均を計算することによって_、F0と定義されるベースライン蛍光値を決定する。
4. 式 ΔF/F = (F-F 0)/F₀を使用してF データを正規化します(ΔF は蛍光の時間依存変化)。
5. Ca²⁺波速度波解析では、統計ソフトウェアを用いて_F0データから計算した標準偏差(2x SD)の2×までの上昇基準を用いて、事前刺激値より大きな信号上昇点を各ROI(t1および_t2)の上昇の検出を表すものとして定義します。 F₀データの95%は平均から2倍のSD以内に収まり、偶然このレベルを超える信号の上昇が≤5%であることを示す。ROI1 と ROI2 の間の CA²⁺の増加の時間差を計算する [t₂- t₁タイム ラグ(Δt)]し、ROI1 と ROI2 の間の距離を測定し、任意の Ca²⁺波の速度を決定します。

傷に応じて[Ca2+]cytと[Glu]アポの信号伝播は図3、図4、ムービーS1、およびムービーS2に示されている。GCaMP3を発現する植物で葉1のペチオールを切断(0s)で、血管構造を介して局所的に急速に誘導された[Ca2+]cytの有意な増加(図3およびムービーS1)。その後、信号を数分以内に隣接する葉(葉3および6)に急速に伝搬した(図3およびムービーS1)。

葉1をCHIB-iGluSnFRを発現する植物で切断すると、切断領域(2s)の周囲で急速に[Glu]アポ増加が見られた。この信号は、数分以内に局所的に血管系を通って伝播したが(160 s)、全身葉では観察されなかった(図4およびムービーS2)。

グルタミン酸の適用によってトリガされるCa2+信号伝搬のリアルタイム撮像については、図5AおよびムービーS3に示すようにGCaMP3を発現する植物における葉1の縁(先端から約1mm)を切断した。葉1の縁を切ると局所的な[Ca2+]のシト増加(40s)が発生したが、この信号は数分以内に消えた(124s)。植物が回復するまで約10分間待った後、100mMグルタミン酸の10μLを葉1の切断面に塗布し、局所的に(56sで)cytの急激かつ有意な増加を引き起こし、遠位葉への信号伝搬(図5BおよびムービーS4)。

全身葉の傷によって誘導される[Ca2+]シトの変化を測定するために、図6Aに示すようにGCaMP3を発現する植物において葉6の基部領域と先端に2つのROI(ROI1およびROI2)を設定した。葉1のペチオールを切断した際のROI1およびROI2におけるGCaMP3信号強度の経時変化を測定した(図6B)。ROI1 での [Ca2+]cytの有意な増加は、ROI2 よりも早く検出されました (図 6B)。[Ca2+]cytは創傷後約100sでピークに達し、10分以上続き、2つの相を示した(図6B)。

機械的な傷の場合のCa2+波の速度を決定するために、ROI1およびROI2における事前刺激値を上回る有意な信号上昇の時点を決定した(タイムラグ;セクション4を参照)。ROI1とROI2の間の距離は2.7mm(図6A)であったため、葉6のCa2+信号速度は0.15mm/sと計算されました。機械的損傷に応じて[Glu]アポ変化を測定するために、図7Aに示すようにL1とマークされた葉の切断部位付近にROI1を設定した。[グル]ROI1のapoシグネチャは、創傷時に約100sで単一のピークを示しました(図7B)。

図1: シロイヌナズナズナ の葉の番号付けシロイヌナズナの 葉は、最年長から最年少(左パネル)に番号が付けされています。葉の位置の概略図は右側のパネルに示されています。L:葉、C:コチルドン。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:本研究で用いた蛍光顕微鏡である[Ca2+]cytと[Glu]アポダイナミクスを広視野蛍光実体顕微鏡で画像化した。R:リモートコントローラ、O:1x対物レンズ、C:sCMOSカメラ、T:三眼傾斜チューブ、S:ステージ、P:植物材料。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:創傷誘発長距離Ca2+信号伝送GCaMP3を発現する植物中の葉1(L1)の葉1(白矢印0s)を切断すると、全身葉[葉3(L3)と葉6(L6)に伝達された局所[Ca2+]シト増加(赤矢印、40s)を引き起こした(オレンジ矢印、80s)。スケールバー、5 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:創傷誘発された[Glu]アポ 標高。 葉1(L1)(白矢印、0s)をCHIB-iGluSnFRを発現する植物で切断すると、血管系(オレンジ矢印、160s)を通って伝播する[Glu]アポ (赤い矢印、80s)の急速な上昇を引き起こした。スケールバー、2 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:グルタミン酸誘発長距離Ca2+信号伝達(A)GCaMP3(白矢印、0s)を発現する植物の葉1(L1)の端部(先端から約1mm)を切断すると、その後[Ca2+]シト増加(赤矢印、40s)を引き起こした。(B)L1の切断面に100mMグルタミン酸(白矢印、0s)を塗布すると、遠位葉(例えば、葉3(L3)、葉4(L4)、葉6(オレンジ矢印、104s)に急速に伝播する局所的[Ca2+]cyt増加(赤矢印、56s)を引き起こした。スケールバー、5 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:機械的な傷に応答して全身葉のcytシグネチャを「Ca2+」にした。(A)GCaMP3を発現する植物における葉6(L6)の拡大像を図3に示す。ROI1(青い円)とROI2(ピンクの円)は、それぞれベースとチップ領域に設定されました。白い矢印は葉1のペチオール(L1)のカット部位を示す。この場合、ROI1とROI2の間の距離は2.7mm(B)ROI1とROI2における[Ca2+]cytシグネチャの定量化であった。蛍光強度変化をイメージングソフトを用いて解析した。(C) (B) 0 s から 80 s までのデータの拡張トレース。ROI1およびROI2のCa2+増加の検出点はそれぞれt1およびt2と定義され、基準として、事前刺激値の標準偏差を2倍に上昇させる(2倍のSD、点線)を基準として使用した。t2 - t1の値は、現在のプロトコルでタイムラグ (Δt) として定義されました。黒い矢印は、カット時間を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:機械的な傷に応答した[Glu]アポシグネチャ(A)CHIB-iGluSnFRを発現する植物における葉1(L1)の拡大像を図4に示す。ROI1はカットサイトの近くに設定されました。白い矢印はカット領域を示します。(B)ROI1における[Glu]アポシグネチャの定量は、イメージングソフトウェアを用いて監視する。黒い矢印は、カット時間を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

動画S1:機械的な傷を負った後の長距離Ca2+透過。葉1(L1)のペチオールでの機械的な傷は、遠位葉に伝達される[Ca2+]のシト増加を引き起こした[例えば、葉3(L3)及び葉6(L6)]。この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ムービーS2:切断に応答して、再生不良性グルタミン酸レベルの上昇. 葉1(L1)の機械的な傷は、即座に[Glu]アポの増加を引き起こした。この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

動画S3:切断に応じて[Ca2+]シトレベルの標高。葉1(L1)の縁部で機械的な傷が発生し、即座にローカルの[Ca2+]cytの上昇を引き起こした。この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ムービーS4:グルタミン酸の適用は、全身性[Ca2+]cytが増加するトリガを引き起こす。100 mMグルタミン酸の塗布は、全身葉へのCa2+伝達を誘発した[例えば、葉3(L3)、葉4(L4)および葉6(L6)]。この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は利害の対立を持っていません。