シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

サマリー

細胞外グルタミン酸誘発全身カルシウムシグナル伝達は、植物における機械的創傷および草食動物攻撃に対する植物防御応答の誘導にとって極めて重要である。本稿では、カルシウムとグルタミン酸に敏感な蛍光バイオセンサーを発現する シロイヌナズナ植物 を用いて、これらの要因の空間的および時間的ダイナミクスを可視化する方法について述べる。

要約

植物は損傷や草藻などの機械的ストレスに反応し、損傷を受けた部分と遠位の損傷のない部分の両方で防御応答を誘導します。葉の傷を負った時、創傷部位で細胞細胞のカルシウムイオン濃度^(Ca2+シグナル)の増加が起こる。この信号は、損傷していない葉に迅速に送信され、そこで防御応答が作動します。私たちの最近の研究は、葉の負傷した細胞から周囲のアポプラストに漏れるグルタミン酸が創傷信号として機能することを明らかにしました。このグルタミン酸はグルタミン酸受容体様^Ca2+透過性チャネルを活性化し、植物全体に長距離^Ca2+シグナル伝達をもたらす。これらの事象の空間的および時間的特性は、遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーを発現する生きている植物のリアルタイム画像化によって捉えることができる。ここでは^、Ca2+シグナルのダイナミクスと、創傷に応答して発生する無熱性グルタミン酸の変化の両方を監視する植物全体のリアルタイムイメージング方法を紹介します。このアプローチでは、緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースの^Ca2+およびグルタミン酸バイオセンサーを発現する広視野蛍光顕微鏡およびトランスジェニックシロイヌズン植物を使用しています。さらに、創傷誘発、グルタミン酸誘発の急速かつ長距離^Ca2+シグナル伝播を容易に引き出す方法論を提示する。このプロトコルは、他の植物ストレスに関する研究にも適用され、植物の全身シグナリングがシグナリングおよび応答ネットワークにどのように関与しているかを調査するのに役立ちます。

概要

植物は生物的ストレスから逃れることができない、例えば、昆虫がそれらに餌を与える、彼らは検出し、その後、草食¹などの課題から身を守るために高度なストレスセンシングと信号伝達システムを進化させた。傷や草食動物の攻撃の際に、植物は負傷部位だけでなく損傷を受けていない遠位器官においても植物ホルモンジャスモン酸(JA)の蓄積を含む迅速な防御反応を開始する^2。このJAは、両方の直接損傷した組織の防御応答をトリガし、先制的に、損傷していない部分の防御を誘導します。シロイヌナズナでは、傷によるJAの蓄積が遠位で検出され、無傷の葉は、傷ついた葉³から急速かつ長距離信号が伝達されていることを示唆する植物の他の場所で損傷のほんの数分の範囲内で検出された。^Ca2+、活性酸素種(ROS)、および電気信号などのいくつかの候補は、植物^4、5におけるこれらの長距離創傷信号として機能するように提案されている。

Ca²⁺は、真核生物の中で最も汎用性が高く、ユビキタスな第二のメッセンジャー要素の1つです。植物では、毛虫の咀嚼と機械的傷害は、傷ついた葉の中と傷ついていない遠葉

プロトコル

1. 植物材料の準備

1. 1.5 mLマイクロチューブでは、GCaMP3またはCHIB-iGluSnFRを20%(v/v)NaClOで3分間振盪し、滅菌蒸留水で5回洗浄することにより、 シロイヌナズナ (Col-0加盟)植物の種子を表面に殺菌します。
   注:GCaMP3またはCHIB-iGluSnFRを発現する シロイヌナズナの トランスジェニックラインは、前に⁶を説明しました。
2. 無菌フードに、30 mLの無菌(オートクレーブ)ムラシゲとスクーグ(MS)培地[1x MS塩] 1%(w/v)スクロース、0.01%(w/v)ミオイノシトール、0.05%(w/v)MESおよび0.5%(w/v)ジェランガム;pH 5.7は1N KOHで調整された。蓋を交換し、外科テープで包みます。
3. 4°Cで2日間暗くインキュベートした後、使用前に約2週間、連続光(90-100 μmol^m-2 s^-1)下の成長室でプレートを22°Cに水平に置きます。2週間後、最年長から最年少⁴⁴のシロイヌナズナの葉の数を数える(図1)。傷の応答は、損傷した葉(n)からn番±3およびn±5⁶に優先的に移動する。
   ....

結果

傷に応じて^[Ca2+]cytと[Glu]_アポの信号伝播は図3、図4、ムービーS1、およびムービーS2に示されている。GCaMP3を発現する植物で葉1のペチオールを切断(0s)で、血管構造を介して局所的に急速に誘導された^[Ca2+]cytの有意な増加(図3およびムービーS1)。その後、信号を数分以内に隣接する葉(葉3および6)に急速に伝搬した(図3およびムービーS1)。

葉1を.......

ディスカッション

全身シグナル伝達は、植物が局所的な外部環境刺激に応答し、その後、植物全体のレベルで恒常性を維持するために重要です。動物のような高度な神経系は装備されていないが、移動式電気信号(そしておそらく油圧)信号やROSとCa^2+46、47の波を伝播するなどの要因に基づいて、臓器内および器官間の迅速なコミュニケーションを採用している。上記のプロトコルは、創傷に応答して^Ca2+および好塑性グルタミン酸のダイナミクスを監視することによって、このシグナル伝達システムの活性の植物全体のリアルタイムイメージングを可能にする。この方法は、高い時空間分解能と使いやすさを組み合わせた植物の高速および長距離信号を理解するための堅牢なツールを提供します。このプロトコルはまた、高速シグナル伝達系の推定元素に欠陥がある変異体を使用するか、Ca²⁺チャネル遮断薬(例えば、LaCl₃₎または他の潜在的に主要なシグナル^{伝達活動の}.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シロイヌナズナ expressing GCaMP3	埼玉大学
<>シロイヌナズナ expressioning CHIB-iGluSnFR	埼玉大学
GraphPad Prism 7	GraphPad ソフトウェア
L-グルタミン酸	富士フイルム和光	072-00501	液体増殖培地[1/2x MS 塩、1% (w/v) スクロース、0.05% (w/v) MES; pH 5.1 を 1N KOH で調整
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	富士フイルム 和光	392-00591	組成: 1x MS 塩、1% (w/v) スクロース、0.01% (w/v) ミオイノシトール、0.05% (w/v) MES、0.5% (w/v) ジェランガム; pH 5.7 1N KOHで調整。
ニコン SMZ25 実体顕微鏡	ニコン
NIS-Elements AR 解析	ニコン
1倍対物レンズ (P2-SHR PLAN APO)	ニコン
sCMOS カメラ (ORCA-Flash4.0 V2)	浜松ホトニクス	C11440-22CU
角型プラスチックシャーレ	輸入	D210-16

] に溶解。