菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

Lisa C. Ohman; Robin F. Krimm

doi:10.3791/62126

方法論記事

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

DOI：

10.3791/62126

⸱

2021年2月11日

Lisa C. Ohman¹ , Robin F. Krimm¹

¹Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本論文では、全体および無傷の味覚芽(それらを内面化する神経線維を含む)を一貫して生み出し、味覚芽内の構造と周囲の乳頭の構造間の関係を維持する全真菌形態、周回、口蓋味覚芽の組織調製、染色、分析の方法について説明する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

味覚芽は、口腔内の化学刺激のサブセットを検出するために特化した味覚伝達細胞のコレクションです。これらの伝達細胞は、脳にこの情報を運ぶ神経線維と通信します。味覚伝達細胞は成人期を通じて絶えず死んで置換されるため、味覚芽環境は複雑で動的であり、細胞の種類、その位置、およびそれらの間の物理的な関係の詳細な分析を必要とします。詳細な分析は、抗体透過性を著しく低下させた舌組織の不均一性および密度によって制限されている。これらの障害は、測定が近似され、細胞の関係が失われるように、セクション間で味覚芽を分割するプロトコルを切り離す必要があります。これらの課題を克服するために、本明細書に記載されている方法は、真菌形態乳頭、乳頭の乳頭の周り、および口蓋の3つの味覚領域から全体の味覚芽および個々の末端アーバーを収集、イメージング、および分析することを含む。全体の味覚芽を収集すると、バイアスと技術的な変動を減らし、味覚芽のボリューム、総味覚芽のインナレーション、トランスデューシング細胞数、および個々の末端アーバーの形態を含む機能の絶対数を報告するために使用することができます。この方法の利点を実証するために、本論文は、一般的な味覚芽マーカーとすべての味覚繊維のラベルを使用して、真菌形態と味覚芽の間の味覚芽とインナレーション量の比較を提供する。味覚ニューロンのまばらな細胞遺伝的標識(味伝達細胞の標識されたサブセットを有する)の使用のためのワークフローも提供される。このワークフローは、画像解析ソフトウェアを用いて、個々の味覚神経の構造、細胞型数、細胞間の物理的関係を解析します。これらのワークフローは、組織の調製と全体の味覚芽とその内側のアーバーの完全な形態の分析のための新しいアプローチを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

味覚芽は、口腔内に存在する化学的味覚刺激のサブセットを結合する50〜100特殊上皮細胞のコレクションである。味移調細胞は、一般に、分子マーカーと相関していた電子顕微鏡基準に基づいて、^タイプ^{1、2、3、4、5、6、7、8、9}として存在すると考えられている。II型細胞は、ホスホリパーゼC-β2(PLCβ2)2および一過性受容体電位カチオンチャネルを発現し、サブファミリーMメンバー⁵¹および甘味、苦味、及び旨味^1、10を透過する細胞が含まれる。III型細胞は炭酸脱水酵素4(Car4)11とシナプトソーム関連タンパク質²⁵⁸を発現し、酸味¹¹に主に反応する細胞を示す。塩分を伝達する細胞は^{、12、13、14}ほど明確に線引いがされていないが、タイプ^I、タイプII、タイプIII細胞15、16、17、18、19を含む可能性がある。味覚芽環境は複雑で動的であり、味覚伝達細胞が成人期を通じて継続的にひっくり返り、基底前駆細胞^3、20、21に置き換えられることを考えると。これらの味伝達細胞は、脳幹に味覚情報を渡す原発性およびペトロサル神経節から擬似単極神経線維に接続する。これらのニューロンは、形態に関する情報^が最近までとらえどころが見えなくなっていたため、主に^22,23を運ぶ味覚情報の種類に基づいて分類されている。II型細胞はカルシウム恒常性調節薬タンパク質1イオンチャネル²⁵を介して神経線維と通信するが、一方、III型細胞は古典的なシナプス^8,26を介して通信する。細胞型系統の導入を含む味覚芽細胞のさらなる特徴付け、それらの分化に影響を与える因子、および連結アーバーの構造は、すべて活発な調査の分野である。

味覚芽の研究は、いくつかの技術的な課題によって妨げられています。舌を構成する異種および緻密な組織は、免疫組織化学^27、28、29の抗体透過性を有意に低下させる。これらの障害には、セクション間で味覚芽が分割され、測定が代表的なセクションに基づいて近似されるか、セクション間で合計されるという切片プロトコルが必要です。これまでは、代表的な薄いセクションを使用して、体積値とトランスデューシングセル数³⁰の両方を近似していました。より厚いシリアル断面化は、すべての味覚芽セクションのイメージングと、各セクション³¹からの測定値の合計を可能にする。このような厚いセクションを切断し、全体の味覚芽を選択すると、小さな味覚芽^32、33、34に向かってサンプリングバイアス。切除された味覚芽からの神経の内挿推定値は、ピクセル数^13、35の分析に基づいており^{、36、37、38}で定量化した場合。これらの測定値は、アーバーが分割されるため(通常はラベルが不十分)ため、個々の神経アーバーの構造と数を完全に無視します。最後に、上皮を剥がすと味覚芽全体が^39、40に染色されますが^、味覚芽神経線維を取り除き、細胞間の正常な関係を混乱させる可能性があります。したがって、味覚芽内の構造的関係の調査は、染色アプローチによって引き起こされるこの混乱のために制限されています。

全構造コレクションは、代表的なセクションの必要性を排除し、容積、細胞数、および構造形態⁴¹の絶対値測定の決定を可能にする。このアプローチは、精度を高め、バイアスを制限し、技術的な変動性を低減します。味覚芽は^{、34、42、}および領域間で^43、44、および全体の味覚芽分析の両方でかなりの生物学的変動性を示すので、この最後の要素は重要であり^、完全な細胞数を制御と実験条件の間で比較することができます。さらに、無傷の味覚芽を収集する能力は、異なる形容細胞とそれに関連する神経線維との間の物理的関係の分析を可能にする。味移し細胞は互いに⁴⁵と通信し、神経線維⁴⁶と通信することができるので、これらの関係は正常な機能にとって重要である。したがって、機能喪失条件は、細胞の損失によるものではなく、セル関係の変化によるものと考えられます。ここでは、味覚芽とその内因、味覚細胞の数と形状の両方のボリューム分析を精製するための絶対的な測定の利点を達成するために全体の味覚芽を収集し、およびトランスデューシング細胞の関係と神経アーバー形態の分析を促進するための方法を提供します。また、この新しい組織準備のための全型実装方法の下流に提示される:1)味覚芽量と総インナービネーションを分析するための1と2)味覚ニューロンのまばらな細胞遺伝的標識(味覚変容細胞のサブセットを標識)と、その後の味覚神経アーバー形態の分析、味覚細胞型の数とその形状の分析細胞とその神経樹立。これらのワークフローは、組織の準備と全体の味覚芽の分析とその内側のアーバーの完全な形態に対する新しいアプローチを提供します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:すべての動物は、米国公衆衛生サービスポリシーによる「人道的ケアと実験動物の使用」および「実験動物のケアと使用のためのNIHガイド」によって定められたガイドラインに従って世話を受けました。Phox2b-Creマウス(MMRRC株034613-UCD、NP91Gsat/Mmcd)またはTrkB^CreERマウス(Ntrk2^{tm3.1(cre/ERT2)Ddg)}をtdTomatoレポーターマウス(Ai14)で飼育した。アドビリン^{・クロイアー}⁴⁷は、Phox2b-flpo⁴⁸およびAi65で飼育された。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)注射の場合、EdUを調製し、ペレア・マルティネスららによって用量を^{計算した。}

1. 材料の準備

ソリューションの準備
1. 2倍蒸留水(ddH₂O)にリン酸一塩基ナトリウム5.244g、23.004gのリン酸二分ナトリウムを攪拌板に溶かします。pHを7.4に調整し、総体積を持って0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(PB)の1 Lを得る。
2. パラホルムアルデヒドを発煙フードに溶かし、撹拌板で90°Cになるまで攪拌しながら加熱します。 4 M NaOH溶液を滴下してパラホルムアルデヒドをクリアし、真空のエルレンマイヤーフラスコとセラミックフィルターをフィルターペーパーで使用して溶液をフィルター処理します。0.2 M PBの等容量を加え、pHを7.4に調整して0.1 M PBで4%PFAを得る。

2. 組織の準備

組織コレクション
1. 無菌生理液10mLと2,2,2-トリブロモエタノール5gとtert-アミルアルコール5mLを含むストック溶液の0.25mLを含む働く溶液を用いた麻酔薬の過剰摂取を使用した犠牲マウス。0.1 M PBで4%PFAを有する経心的にパーフューズ;舌と口蓋を取り除きます。
2. 後舌を分離するコロナカットを使用して、周回味覚芽を分離します, 交間部のeminenceの後ろに;かみそり刃で味覚芽を切り落とす。そして、正中線で前舌を二分します。0.1 M PBで4%PFAで4°Cで一晩後固定。
3. 4°Cで一晩30%スクロースで組織を凍結保護する。
  注:この組織は、ドライアイス上のビーカーで冷やした2-メチルブタンを使用して最適な切断温度(OCT)化合物で凍結し、ここで一時停止する必要がある場合は-80°Cで保存することができます。
真菌形態の味覚芽
1. ステップ2.2.8に備えて、ドライアイスのビーカーで2-メチルブタンを冷やす。
2. 0.1 M PBで舌を解凍し、すすいでください。真菌形態の乳頭を含む舌の半分を、解剖顕微鏡の下のガラススライドに置きます。
3. 鈍い終わりの鉗子と解剖はさみを使用して筋肉を取り除きます。鈍い終わりの鉗子を使用して、リングアル上皮が湾曲しているように組織を開いたままにし、上皮に平行に粗い解剖はさみの刃を保つことによって平らな配向を保障する。
4. それは味覚芽が含まれているので、舌の腹側非角化上皮を捨てます。
5. 角化上皮の下側に近い解剖のために細かい解剖はさみを使用してください。
  注:残りの筋肉の厚さが均一で、表面が均一な抗体の浸透を確実にするために滑らかになるように、上皮の近くで解剖することが重要です。残りの筋肉の不均一な厚さの結果は、クライオスタット上で不均一な切断になり、筋肉が少ない領域で上皮が露出し、他の領域の筋肉の層が厚くなり、抗体の浸透を妨げる。
6. 鈍い終わりの鉗子を使用して上皮の一部を組織型(筋肉側を下)に置き、平らに横たわるようにします。組織が平らになったら、組織にOCTの滴を加える。
  注:舌の先端が湾曲していることを考えると、組織が平らに置かることができるように、上皮を切断する必要があるかもしれません。
7. 組織モールドを、解剖範囲の下で(以前ドライアイスで冷却した)金属ベースに置きます。OCTが凍結するまで鉗子で組織を軽くタップし続け、組織ができるだけ平らに凍結するようにします。
8. OCT が凍結したら、すぐに OCT を追加し、凍結するまで 2-メチルブタン (ドライアイスで冷却) のビーカーに金型を入れます。
9. クライオスタットの切除
  注:クライオスタットは、抗体の浸透を阻害する可能性がある残りの皮下組織の微細除去に使用されます(図1)。
  1. OCT金型をクライオスタットに取り付け、20 μmのセクションをカットします。各セクションを収集し、それを上皮の基部に近く評価するために、それを光顕微鏡下で見る(図1E-H)。
  2. 上皮の下側から組織を剃った後、上皮を解凍し、シェーカー上で0.1 M PBで2回する。
味覚芽の周回
1. カミソリの刃でコロナカットを使用して、前舌から乳頭周りを分離します。同じカミソリブレードで2つのパラサジタルカットを使用して、解剖スコープ下で乳頭に組織を横切り除去します。乳頭を鉗子を使用して組織カビに入れ、乳頭周回の片端が組織の底に面するようにします。
  注:乾燥氷の上のビーカーで冷やされた2-メチルブタンを使用して10月に組織を凍結し、手順をここで一時停止する必要がある場合は-80°Cで保存することができます。
2. 凍結スタットの90μmの浮遊部分にティッシュを切りなさい。
味覚に芽を味わう
1. 硬口蓋前を柔らかい口蓋と硬い口蓋の接合部に切り出す(図2)。はさみを使用して、下の組織から柔らかい口蓋を分離し、残りの骨片が切り取られるようにします。追加の筋肉と結合組織を削除します。.
  注:一度除去すると、残っているすべての組織は、口蓋の下側に軽く付着している腺と緩い結合組織で構成されます。
2. 鈍い終わりの鉗子で口蓋を保持し、カミソリの刃でそっとそれらを掻き取ることによって残りの腺と緩い結合組織を取り除きます。
  注:乾燥氷の上のビーカーで冷やされた2-メチルブタンを使用して10月に組織を凍結し、手順をここで一時停止する必要がある場合は-80°Cで保存することができます。

3. 免疫染色染色

0.1 M PB、3 x 15分で組織を洗います。組織をブロッキング溶液(ロバ血清3%、非イオン界面活性剤0.5%( 材料表参照)、0.1M PB)を一晩4°Cで1mLチューブに入れます。
ブロッキング溶液を除去し、抗体溶液中の一次抗体(ウサギ抗PCLβ2)の組織(0.1M PB、非イオン界面活性剤0.5%)を4°Cで5日間インキュベートする。
0.1 M PBで洗浄し、各洗浄を4 x 15分、2次ロバ抗ウサギ488抗体(1:500)を抗体溶液中で4°Cで2日間インキュベートします。
0.1 M PB、洗浄ごとに4 x 15分で洗浄し、抗体溶液中の5%の正常なウサギ血清でブロックします。
0.1 M PB、4 x 15分で洗います。ロバの抗ウサギ遮断抗体(20 μg/mL)を抗体溶液中で4°Cで2日間インキュベートします。
1回の洗浄で0.1M PB、4×15分洗い、4°Cで5日間、抗体溶液中の蛍光標識(メーカーの指示に従って)に結合した一次抗体dsRed(ウサギ)でインキュベートします。
1回の洗浄で0.1M PB、4×15分洗い、抗体溶液中の一次抗体(ヤギ抗カー4(1:500))を4°Cで5日間インキュベートします。
0.1 M PB、4 x 15分ごとに洗浄してください。2次ロバ抗ヤギ647抗体(1:500)を抗体溶液中で4°Cで2日間インキュベートする。
0.1 M PBで洗浄し、各洗浄を4 x 15分、水性取り付け媒体に取り付け(上皮側を上に上に)、組織部の上にカバースリップを置きます。
注:ケラチン-8およびdsRedのみと同様に異なる種の抗体を使用する場合は、ステップ3.9に進む前に、ステップ3.2の抗体溶液にすべての一次抗体とステップ3.3のすべての二次抗体を追加します。

4. 共焦点画像化とデコンボリューション

60倍の目的(数値絞り= 1.40)、4 ms/pixel、ズーム3、カルマン2、サイズ1024 x 1024の共焦点顕微鏡を使用して、共焦点画像をキャプチャします。z 軸に沿って 0.47 mm のステップサイズを選択します。乳頭へのインナーブをキャプチャするには、3のズームを持つ視野が狭すぎて乳頭へのすべてのインナビテーションをキャプチャするには2.5のズームを使用してください。
イメージをデコンボリューションするには、一部の設定が自動的にイメージと共に読み込まれることに注意してください。したがって、モダリティ、対物レンズ、開口数、浸漬媒体、サンプル培地、および画像に取り込まれた蛍光穿光器の残りの詳細を記入してください。次に 、[3D デコンボリューション] を選択します。

5. 画像解析

味覚芽とインナーブボリューム
1. 装飾された画像スタックをピクセルベースの画像解析ソフトウェアにインポートし ( 材料表を参照)、味覚芽のボリュームと味覚芽内の全インレーションの体積を決定します。
  1. メインのオブジェクトメニューで音量をオフにします。
  2. [オブジェクト] メニュー の [新しいサーフェスの追加 ] を選択 します。[自動作成をスキップ し、手動で編集する] を選択し、[ コンター] を選択します。
  3. [選択]をクリックし、矢印が+として表示され、味覚芽の境界線をトレースするのを観察します。スライサーを移動し、各光学セクションで味覚芽の輪郭を描きます。輪郭が完成したら、[サーフェスを作成]をクリックします。
  4. メインのオブジェクトメニューに味覚ボリュームオブジェクトが表示されている のを確認 します。 ツールの下で味覚芽のボリュームを見つけます。
2. 味覚芽内のインナーブのボリューム
  1. 味覚芽オブジェクトの下にある鉛筆アイコンを選択し、 マスクをすべて選択します。
  2. ドロップダウンメニューで、神経線維ラベルに対応する 蛍光チャネル を選択します。 [重複したチャネルの作成] をオンにします。
  3. [ ボクセルをサーフェス外に設定:] をオンにし、 ボックスに 「0」 と入力します。
  4. 「 表示調整 」ウィンドウに表示される新しいチャンネルを観察します。
  5. [オブジェクト] メニュー の [ 新しいサーフェスを作成] を選択します。[ 自動作成をスキップする、手動で編集する]チェックボックスをオフにします。
  6. 青い矢印を 2 回クリックして、次の手順に進みます。
  7. [削除] をクリックし、緑色の二重矢印をクリックして、味覚芽内に存在する神経線維の体積を表すサーフェスを完成させます。ボリュームの値を検索するには、神経繊維オブジェクトメニューの下にある「ツール」を選択し、ドロップダウンメニューから「ボリューム」を選択します。
3. 乳頭へのインナーブの体積
  1. セクション 5.1 で説明したように、味覚芽のボリュームを作成します。
  2. テイストバッドオブジェクトの下にある鉛筆アイコンを選択し、 マスクをすべて選択します。
  3. ドロップダウンメニューで、神経線維ラベルに対応する 蛍光チャネル を選択します。 [重複したチャネルの作成] をオンにします。
  4. [サーフェス内のボクセルを: に設定] をオンにし、ボックスに「0」と入力します。[OK] をクリックします。
  5. [新しいサーフェスを追加]をクリックして サーフェスを生成します。[ 対象地域のみをセグメント化] を選択します。
  6. 青い矢印をクリックし、関心のある領域が味覚芽の基部から始まるようにZ値を増やします。
  7. 青い矢印を 2 回クリックして、次の手順に進みます。
  8. [削除] をクリックし、緑色の二重矢印をクリックして、乳頭へのインナビネーションの体積を表すサーフェスを完成させます。ボリュームの値を検索するには、神経繊維オブジェクトメニューの下にある「ツール」を選択し、ドロップダウンメニューから「ボリューム」を選択します。
4. 端子アーバー接触解析
  1. 画像準備
    1. [編集]メニューに移動し、[3D トリミング] を選択します。すべての側面に画像をトリミングし、味覚芽の外側のスペースを削除します。
      注:任意の関連する構造を削除せずに味覚芽に近いようにトリミング - 任意の余分な画像は、処理時間を長くします。
    2. メインメニューの [編集] を クリックし、[ データ型の変更] をクリックします。ドロップダウンメニューから [To: 32ビットフロート ]を選択します。
    3. [オブジェクト] メニュー の [新しいサーフェスの追加 ] を選択 します。[ 自動作成をスキップして手動で編集する] をクリックし、[ コンター] を選択して、スライス位置を右にドラッグして、光学スライスの総数を確認します。
    4. 等角ボクセルを生成し、ボクセルがそれぞれ長方形(0.0691 x 0.0691 x 0.474)であるのではなく、ボクセルが元のボクサー強度の同じ値を持つ立方体に分割することによって、ボクセルが0.0691 x 0.0691 x 0.0691であることを確認します。[ イメージのプロパティ] を選択します。次に、ボクセルサイズのZ値をXまたはY値で除算し(= 0.474/0.0691)、その値に前のステップで見つかったスライス(光学断面)の数を掛けます。
    5. メインメニューの [編集] に戻り 、[3D リサンプル]を選択します。
    6. Z 値 (スライスの数) を新しく計算された値に置き換えます。
  2. 蛍光に基づく自動サーフェスの作成
    1. [新しいサーフェスを追加] をもう一度クリックして新しいサーフェスを追加し、[対象の領域のみをセグメント化] をオフにして、[次へ] をクリックします。
    2. ソースチャネルドロップダウンメニューから、味を伝える細胞タイプの1つに対してチャンネルを選択します。スムーズを選択解除し、次のステップに進みます。
    3. 画像に存在する蛍光強度の範囲を示す次の画面で何かを変更しないでください。次のステップに移動するには、下部にある 青い矢印 をもう一度クリックします。
    4. [ 削除] をクリックし、 緑色の二重矢印 をクリックしてサーフェスを完成させます。
    5. 完成したセルサーフェスが表示される画面の左側にある [オブジェクト ] メニューに移動し 、Surface 2などの汎用的なものと呼ばれます。 サーフェス名 をダブルクリックして、ラベルが表す名前に従って名前を付けます。
      注: この場合、生成されるサーフェスは PLCß2 ラベルのセルに基づいています。
    6. サーフェスの代わりに点がある場合は、左下隅のメニューの下にある[中心点]ではなく[サーフェス]をクリックします。次に、メッセージが表示されたら[OK] をクリックします。
    7. 他の味を伝達する細胞マーカーと神経線維マーカーについて、ステップ 5.3.2.1~5.3.2.5 を繰り返します。
    8. 進行状況を保存 (エクスポート) します。
    9. メインメニューでセルタイプ の Surface をクリックします。そのオブジェクトのメニューから[ ツール ]をクリックし、 [ 距離変換] をクリックします。
    10. [XTDistance 変換] というポップアップボックスが表示されるのを待ちます。[外部サーフェスオブジェクト]を選択します。[表示調整] メニューの [サーフェス名までの距離] に表示される新しいチャネルをメモしておきます。
    11. [オブジェクト]メニューから[神経ファイバ]サーフェスを選択します。鉛筆アイコンをクリックし、[すべてマスク] をクリックします。
    12. 表示されるドロップダウンメニューから、新しいチャンネル[サーフェス名までの距離]を選択します。[表示調整] ウィンドウに表示される [サーフェス名までの距離]という新しいチャネルをメモしておきます。
    13. メインの [オブジェクト] メニューを使用して、新しいオブジェクトを作成します。[対象地域のみをセグメント化する] をオフにし、青い矢印をクリックします。[PLCß2 までのマスク距離]チャネルを選択し、[スムーズ]をオフにします。
    14. 次の画面で、味を伝達する細胞がこのソフトウェアで識別可能な神経線維から最小の距離内にある領域があるかどうかを確認します。これを行うには、0.01-0.11 μmの制限を設定して、神経線維に近い任意の受容体細胞蛍光をチェックします。
    15. 左側の緑色のボックスに 「0.01」 と入力して下限しきい値を設定し 、Tabキーを押します。次に 赤いボタン をクリックし 、0.11 と入力して上限を設定します。 Tab キーを押してから、 下部の青い矢印を クリックして次のステップに進みます。
    16. [削除]をクリックし、次に緑色の二重矢印をクリックして終了します。
    17. [オブジェクト]メニューの PLCß2 の 0.01~0.11 以内にこのサーフェスの名前を変更します。[オブジェクト]メニューの[PLCß2サーフェスの0.01~0.11以内]を選択します。
    18. 鉛筆を選択し、[すべてマスク] をクリックします。ドロップダウンメニューから赤(神経線維)チャンネルを選択し、[OK]をクリックします。
    19. チャンネルの名前をクリックします。チャネルの名前を0.01 ~ 0.11 の PLCß2 の内部で変更します。
      注:これは、作成された表面内に存在する赤色蛍光チャネルの複製を表す蛍光チャネルです。
    20. カラーセレクタの中央にある白をクリックします。構造の色と対比する色を選択します。
    21. この段階でファイルをエクスポート (つまり、保存) します。
    22. 他の味を伝達する細胞マーカーについて、手順 5.4.2.9 ~5.4.2.21 を繰り返します。
    23. この段階でファイルをエクスポート (つまり、保存) します。
      注: ラベル付きのセルタイプと別のタイプのセルの近接性を解析するには、ステップ 5.4.2.11 の神経ファイバーサーフェス (および次の手順) を対象とするオブジェクトと、後続の各ステップに関連する同等のコンポーネントに置き換えます。

6. ニューロンアーバー再構成と絶対細胞数定量化

ターミナルアーバーのトレースと分析
1. 3D ベクターベースのイメージ解析ソフトウェアでデコンボルトされたイメージファイルを開き ( 材料表を参照)、[ トレース] を選択し、[ ニューロン] をクリックして[ デンドライト] をクリックします。
2. イメージスタック内の味覚芽のベースまでスクロールします。イメージスタックをスクロールしながら、各ファイバーを最後までトレースします。
3. 分岐の終わりに、最後を右クリックし、終了を選択します。分岐点で右クリックし、[ ノードの分岐] を選択します。
  注: これにより、1 つの分岐を最後までトレースし、分岐点に戻り、このトレースがまだ同じニューロンであることを認識するプログラムで他の分岐をトレースできます。
4. データファイルを .DATファイルは、3Dベクトルベースの画像解析ソフトウェアで解析のために開くことができます。

7. 細胞数の定量化

Z位置に固定された細胞タイプを転写するための別個のマーカーが核レベルに置くことができる限り、任意の画像解析ソフトウェアパッケージ内の標識された味覚芽細胞を定量化する。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSRedおよびケラチン-8に対する抗体によるリングアル上皮の染色(一般的な味覚芽マーカー)は、Phox2b-Cre:tdTomatoマウス^50,51において味覚芽全体と全味覚芽の内インベーションの両方を標識した(図3A)。毛穴からそのベースにこれらの味覚芽をイメージングすると、最高解像度のx-y平面画像(図3A、B)を与えた。ピクセルベースのイメージングプログラムの輪郭関数を用いて、各セクション(図3B)における味覚芽の周辺を概説し、次いで味覚芽体積を表す表面(図3C)を生成した。表面内のみの味覚芽ラベルに関連する蛍光をマスキング(または複製)は、この蛍光のみを含む新しいチャネルを作成し、味覚芽を隠す乳頭染色を排除した(

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3つの口腔味覚領域(真菌形態、円周、口蓋)から味覚芽全体を一貫して収集し、染色するアプローチの開発は、味移し細胞を分析し、新たに組み込まれた細胞、インナーブ、およびこれらの構造間の関係を追跡するための重要な改善を提供する。さらに、標識母集団⁵⁰の内部または外側の両方で潜在的な二次ニューロンマーカーの局在化を促進する。これは、特に、味乳頭が堅牢な体性感覚のインナーヴィス^52、53を受け取ることを考えると、いくつかの味覚ニューロンを標識する可能性があることを考えると、特に関連する。乳頭ハウジング味覚芽は、より低い倍率を使用して画像化することもできます。これは、乳頭全体、ならびに味覚芽へのインナーブの視覚化を可能にし、味覚芽および周囲の神経線維に浸透する内インレーションの独立した分析を可能にする。

皮膚の体性感覚神経終末は、毛包の周りの彼らの組織と上皮の他の成分との関係に基づいて区別することができます。乳頭の平行分析は、類似...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

カヴィスカ・クルパラナンタは、組織染色と周回味覚芽のイメージングへの貢献、乳頭へのインナーゼーションの染色とイメージングのためのジェニファー・シュー、動物のケアとジェノタイピングのためのカイティー・ホーン、柔らかい口蓋味の芽の組織染色に対するリクン・マに感謝します。このプロジェクトは、R21 DC014857とR01 DC007176からR.F.K、F31 DC017660からL.Oにサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
2,2,2-トリブロモエタノール	ACROS 有機物 AC421430100
2-メチルブタン	ACROS	126470025
AffiniPure Fab Fragment ロバアンチウサギ IgG	ジャクソン免疫研究	711-007-003	15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson Immuno Research	712-605-150	(1:500)
AutoQuant X3 ソフトウェア	メディアサイバネティクス
鈍器エンドフォーセプス	ファインサイエンスツール	FST 91100-12
Click-iT™Plus EdU Cell Proliferation Kit	Molecular Probes	C10637	キットの指示に従ってください
カバーガラス	マリエンフェルド	107242
サイトケラチン-8	発生研究ハイブリドーマバンク(DSHB)、(RRID:AB_531826)	Troma1上清	(1:50、4°Cで保存;C)
解剖ハサミ(粗)	Roboz	RS-5619
解剖ハサミ(細)	Moria	MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A21206	(1:500)
Donkey anti-Rabbit、Alexa Fluor® 555	ThermoFisher Scientific	A31572	(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG	Jackson Immuno Research	805-477-008	(1:500)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
スライド	Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope slides)	12-550-15
Goat anti-Car4	R&Dシステムズ	AF2414	(1:500)
イマリス	ビットプレーン	ピクセルベースの画像解析ソフトウェア
Neurolucida 360 + Explorer	MBF Biosciences	3Dベクトルベースの画像解析ソフトウェア
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121
Normal Rabbit Serum	Equitech-Bio, Inc	SR30
Olympus FV1000		(波長458、488、515のマルチアルゴンレーザー、および543および633
パラホルムアルデヒド	EMD	PX0055-3	4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed	Living Colors DsRedポリクローナル抗体;Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)	632496	(1:500)
ウサギ抗PLCβ2	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-206	(1:500)
リン酸ナトリウム二塩基性無水	フィッシャーサイエンティフィック	BP332-500
ナトリウムモノベーシック	フィッシャーサイエンティフィック	BP330-500
tert-アミルアルコール	アルドリッチケミカル	カンパニー8.06193
ッシュモールド電子	顕微鏡科学	70180
ティッシュテック® O.C.T.コンパウンド	さくら	4583
トリトン X-100	BIO-RAD	#161-0407
ゼノン™アレクサフロー&トレード;555ウサギIgGラベリングキット	ThermoFisher Scientific	Z25305	キットの指示に従ってください

を放出する追加のHeNeレーザー)リン酸ティ

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