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方法論記事

アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のGAL4-UASシステムの使用

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DOI：

10.3791/62131

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2021年4月15日

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1Department of Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2IMBB FORTH, 3Department of Biology, University of Crete

この記事について

サマリー

二部類GAL4-UASシステムは 、アノフェレスガンビアで機能的な遺伝子解析を可能にする制御された時空間的な方法で遺伝子発現を修飾するための汎用性の高いツールです。このシステムを使用するために説明されている手順は、半標準化されたクローニング戦略、蛍光タンパク質マーカーおよび胚固定のための子犬の性別とスクリーニングである。

要約

二部のGAL4-UASシステムは機能性の遺伝子解析のための多目的で強力な用具である。システムの本質は、酵母転写因子GAL4を組織特異的な方法で発現するトランスジェニックな「ドライバ」ラインを横断し、その発現がGAL4に結合する上流活性化配列(UAS)によって制御される遺伝子/RNA干渉構造の候補を運ぶトランスジェニックな「応答者」ラインである。その後の子孫では、遺伝子またはサイレンシング構築物は、このように規定された時空間的な方法で発現され、結果として生じる表現型をアッセイし、遺伝子機能を推測することを可能にする。バイナリシステムは、重度のフィットネスコストが誘発された場合でも、複数の組織特異的パターンでトランスジーン発現によって生成された表現型をスクリーニングする実験的アプローチの柔軟性を可能にする。我々は、アフリカの主要なマラリアベクター であるアノフェレス・ガンビアにこのシステムを適応させました。

この記事では、GAL4-UAS 分析で使用される一般的な手順をいくつか紹介します。我々は、すでに生成された AN.ガンビア GAL4-UASラインと、アップレギュレーションとRNAiノックダウンのための新しい応答構造のクローニングについて説明する。我々は、ドライバーと応答者の挿入をタグ付けする蛍光遺伝子マーカーの継承に従う子孫のスクリーニングを含む、遺伝的十字架を確立するための蚊の子犬のセックスのためのステップバイステップガイドを指定する。我々はまた、胚発生を研究するために An.ガンビア胚 をクリアするためのプロトコルを提示する。最後に、標的遺伝子のGAL4下流にCRISPR/Cas9を挿入してドライバラインを生成する方法の潜在的な適応を紹介する。

概要

二部GAL4-UASシステムは、昆虫モデルの生物ショウジョウバエメラノガスター1,2,3における遺伝子の機能的特徴付けの役馬である。GAL4-UASシステムを使用するには、トランスジェニックドライバラインは、調節配列の制御下にある酵母転写因子GAL4を発現し、GAL4によって認識される上流活性化シーケンス(UAS)によって制御される目的の遺伝子またはRNA干渉(RNAi)構築物を運ぶ応答線と交差する。この十字架の子孫は、GAL4発現を制御するプロモーターによって指示される時空間パターンにおける関心のトランスジーンを表す(図1)。ドライバー応答者十字の子孫によって表示される型のフェノタイプは、候補遺伝子の機能を解明するために評価することができる。D.メラノガスターは、他の生物から遺伝子を調べるために使用されているが4,5,6,7,, GAL4-UASシステムは、関心のある種8,9,11,12,13,14の直接分析を提供するために、医療および農業上重要の昆虫での使用に適応されています。

アフリカのマラリア蚊、アノフェレスガンビアでは、GAL4-UASシステムが最初に細胞株共トランスフェクション9によってテストされました。複数の構成体が異なる対の組み合わせで効率のためにアッセイされ、14のタンデム反復UASが小型の人工イントロン(UAS-14i)を補い、GAL4ドライバのパネルで使用すると、最も広い範囲の活性化電位を示すことがわかった。インビボ機能を実証するために、これらの構成体は、ピギーバクトトランスフォーメーション8によって2つの別々のトランスジェニックAn.ガンビアラインを作成するために使用されました:midgut特異的プロモーターによって駆動されるGAL4を運ぶドライバーラインと、UAS配列の調節下にあるルシメラーゼおよび強化された黄色蛍光タンパク質(eYFP)遺伝子の両方を含む応答線。腸特異的ルシメラーゼ活性および生前性における蛍光は、このシステムがアノフェレスで効率的であることを示した。それ以来、オエノサイト15やヘモサイト16を含むベクター容量および殺虫剤耐性に重要な他の組織におけるトランス遺伝子を発現するドライバラインが作成され、かつ、ユビキタスパターン10に近いものである。また、代謝および隔離媒介性殺虫剤耐性に関与すると考えられるアッセイ遺伝子、カチカリン炭化水素合成、および異なる細胞および組織タイプに蛍光タグを付ける測定遺伝子にも多数のUASラインが生成されている(表1)。応答線については、トランスジーンの部位指向統合が、UAS調節遺伝子のゲノムコンテキストを固定するために、ΦC31触媒再結合カセット交換17,18によって行われるようになりました。このようにして、遺伝子挿入位置に関して遺伝子導入発現が正規化され、異なる候補遺伝子の表現型効果をより正確に比較することが可能になる。

これまでに作成された応答線は、高いレベルでトランスジーンを発現するか、RNA干渉(RNAi)を介して遺伝子発現を減少させるように設計されています。 通常、cDNAクローンはUAS配列に融合して適切な発現プラスミドを生成するが、完全なゲノム配列はクローニングには大きすぎるものではないと仮定しても可能である。サイレンシング構築物を生成するために、RNAiを刺激するヘアピンdsRNAを形成する適切なタンデム逆配列を得るために3つの異なる方法を用いた。これらには、融合PCR、非対称PCRおよびヘアピン構築物の商業的合成が含まれています。各方法に共通するのは、転写安定性を提供するために反転配列間にイントロン配列を含めることである。目的の遺伝子/RNAi構築物を挿入できる応答性プラスミドが開発された15。これらのプラスミドはまた、RMCE(RCME技術を詳細に記述するJoVE紙に付随するアドルフィに記載)に必要なΦC31 attB サイトを運びます。これらのプラスミドの1つに挿入するシーケンスを過剰発現にする際に必要な重要なステップをカバーするプロトコルが、この原稿に含まれている。また、RNAiヘアピン構築物作成用の2つのプロトコルを説明し、図示する。

新しいラインを作成する際には、まれなトランスジェニックな個体の同定は、トランスジェニックコロニーを確立し維持するために繁殖するために重要です。GAL4-UASシステムにとって最も重要なことは、応答者とドライバラインを区別して十字架を確立し、両方の遺伝子を運ぶ個々の子孫を特定する必要があります。これは、ドライバと応答側カセットにリンクされた異なる支配的な選択可能マーカー遺伝子を使用することによって達成される。最も一般的には、光学フィルター(例えば、eYFP、eCFP、dsRed)を使用して明確に識別可能な蛍光マーカー遺伝子です。マーカーは、異常や汚染の識別が容易になるため、既知の信頼性の高い時空間パターンで表現することが重要です。蛍光マーカー遺伝子発現は、合成 3xP3 プロモーターによって日常的に調節され、 An.gambiae 開発19のすべての段階で眼および腹側神経節特異的発現を引き起こす。 3xP3 で制御される蛍光マーカーは、本稿に記載されているすべての形質転換プラスミドに含まれています。蛍光 アンガンバエ PUPAe GAL4-UASラインをスクリーニングするために使用される一般的な方法を詳述するプロトコルがここに含まれています。

GAL4-UAS システムの重要な要素の 1 つは、差し切れにマークされたドライバとレスポンダラインを横断する必要があります。この男性と女性を各ラインから行うには、交配前に分離する必要があります。しかし、成人は視力によって容易に区別できるが、遺伝的十字架を確立するためには、交配が起こらないように成人の出現前に男女を分離することが賢明である。男性と女性の一般的なサイズの違い アンガンビアの 子犬は、性決定の効率的で信頼性の高い方法になるにはあまりにも可変です20。代わりに、外部生殖器の明確な形態学的違いは 、An.ガンビアでのセックスのための信頼できる基礎を提供します。この記事では、適切な十字架を設定するために An.ガンビア の子犬をセックスするための信頼できる方法について説明します。

蚊のRNAiを用いた遺伝子編集プロセス,クローニング,注射,表現型解析を網羅した図
図1 -アノフェレスガンビアにおける二国間GAL4-UASシステムを使用するためのプロセスの図示的表現。 (A)例ベクトルの主要成分(pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP])が描かれ、対象遺伝子にヘアピン構造またはコード配列を挿入するのに適した複数のクローニング部位内の利用可能な制限部位(EcoRI、NheI、XhoIおよびNcoI)を詳述している。ドッキングラインの構造も描かれています。(B)交差工程は、ドライバーライン(3xP3プロモーターによって駆動される目的のプロモーターおよびeCFPによってGAL4ドライバーを運ぶ)および応答側ライン(UASプロモーターおよび3xP3プロモーターによって制御されるeYFPマーカーによって制御される関心のある遺伝子またはヘアピン構築物を運ぶ)からの雄の使用を示す図示される。(C)Bにおける十字架の子孫における目的の遺伝子のGAL4駆動発現の図示および評価される典型的な表現型の一部のリスト。略称:複数クローニング部位(MCS)、リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)、アップストリームアクチベーター配列(UAS)、強化された黄色蛍光タンパク質(eYFP)、強化シアン蛍光タンパク質(eCFP)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

GAL4-UAS システムの二者間の性質を提供する十字の使用であり、より線形なアプローチよりも明確な利点があります。例えば、ドライバーとレスポンダーラインの組み合わせは、プロモーター/遺伝子の組み合わせごとに新しいトランスジェニックラインを生成して維持する必要がある場合よりも評価できます。さらに重要なことは、線形系で作成/維持することが困難な発現が摂動されたときに致死的または無菌表現型を産生する遺伝子の分析を可能にする。このような致死性表現型は、遺伝子機能および時空間的発現に応じて、すべての発達段階で現れるが、胚発生時に最も頻繁に観察される。蚊の胚の発達を視覚化するには、卵をコーティングする不透明な絨毛のクリアが必要です。Trpiš(1970)21 およびカイザーら(2014)22に記載されている方法に従って、我々は、構造的完全性を維持しながら、胚を固定するために使用するプロトコルを記述し、顕微鏡的可視化およびイメージングを可能にするエンドコリオンをクリアするために漂白する。

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プロトコル

1. UAS構造の設計と構築

  1. 遺伝子発現候補のベクターの設計と組み立て
    1. 候補遺伝子アップレギュレーションに使用する配列を決定する。
      1. 関心のある株からcDNA/gDNAをシーケンス化し、公開されたシーケンスと比較して、その識別を確認し、診断ダイジェストの潜在的なSNPsおよび制限サイトを特定します。
      2. 遺伝子増幅に使用されるフォワードプライマーが、ネイティブのKozak配列を覆い、必要に応じてコドンを開始することを確認します。開始コドンの上流に~10 bpの結合を有するプライマーは、コザック配列を包含する。
      3. ほとんどの状況において、逆プライマーから増幅された断片中に停止コドンを含める。記載されたプラスミドベクターに設けられている3'終了配列を使用するか、または候補遺伝子ゲノム配列から増幅する。
      4. 必要に応じて、特定のコドンバイアスを伴う商業シーケンスを注文する。
    2. 標準的なサブクローニング手順を使用して、UASプラスミドベクターに遺伝子カセットを挿入し、例えば、pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15(図1)をアップレギュレーションおよびRNAi構築物の両方に対して使用します。
    3. ΦC31組換え媒介カセット交換10,17,18,23を用いて作製したトランスジェニック蚊を生産する。
  2. RNAiヘアピン構築物の作成:非対称PCR15,24を用いた単一ステップ増幅
    1. リラック法25を用いて、目的の候補遺伝子を運ぶ成人女性アンガンビアからゲノムDNA(gDNA)を抽出する。
      1. 隣接イントロンに向けられた所望の断片の5'でターゲットエキソンに結合するようにフォワードプライマーを設計します。イントロンを増幅するために、前のエキソンの端に結合するようにブリッジプライマーの3'端を設計します。5'の端はイントロンの直後にターゲットエキソンの小さな断片に相補的である。
    2. Xiao (2006)24に記載されているように、非対称PCR反応を実行する(図2)。
    3. 精製 PCR 産物を UAS プロモーターを持つ適切なベクターにクローン化します (例えば、 pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15)。
      注: pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] クローニング15および必要な次のステップに適した複数クローニング部位内の酵素を図 1 に示します。 単一酵素消化は、1つの制限部位のみが追加されるので不可欠である。プラスミドの脱リン酸化はクローニング効率を向上させる。
  3. RNAiヘアピン構築物の構築:cDNAとgDNA15の融合PCR
    1. リラック法25を用いて、目的の候補遺伝子を運ぶ成人女性アンガンビアからゲノムDNA(gDNA)を抽出する。
      1. エクソン配列とイントロン配列の標的領域を増幅するPCR反応にgDNAを含める(図2)。
      2. 前方プライマーの3'末端を逆ターゲットのエキソンシーケンスに結合してターゲットイントロンシーケンスに向かって増幅し、5'末端にクローニングを容易にする制限部位を運ぶように設計します。
      3. 逆プライマー(1)はイントロンの5'端に結合し、5'エンドオーバーハングは、隣接するエキソンの前方シーケンスの最初のベースを運ぶ。このオーバーハングは、融合 PCR で使用されます。
      4. 目的の反応生成物を精製します。
    2. RNAを抽出し、DNaseを使用してDNAを除去し、メーカーのプロトコルに従って所望の候補遺伝子を運ぶ成人女性アンガンビアからcDNAを調製する。
    3. PCR反応でcDNAを使用して、エキソンの標的領域のみを増幅します(図2)。
      1. 前方プライマー(2)は、3'末端が相補的なターゲットエキソンシーケンスの3'末端に結合し、プライマーの5'末端がクローニングに使用するための制限部位を運ぶように設計する。
        注:1.3.1.2からの前方プライマーは、この2番目の反応で再び使用することができます。しかし、これは単一の酵素消化が不可欠であることを意味します。別の制限部位を持つ第2のフォワードプライマーを使用すると、二重消化が可能になり、クローニング効率が向上する可能性があります。
      2. リバースプライマー(2)-3'の端は、ターゲットエキソンを増幅する隣接エキソンの5'端に結合する。5'の端はイントロンの前方鎖の3'端に結合する。このオーバーハングは、融合 PCR で使用されます。
      3. 目的の反応生成物を精製します。
    4. ステップ 1.3.1 および 1.3.2 の生成物を、フォワードプライマー 1 および 2 との標準濃度を使用した融合 PCR 反応のテンプレートとして含めます。目的の製品を浄化します。
    5. 精製した製品を消化して、クローニング用のオーバーハングを生成します。UASプロモーターの下流の適切なベクターにクローンを作成する。pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]クローニング15および必要な次のステップに対する適切な酵素を図1に示す。

非対称および融合PCR図;遺伝子編集方法論;配列変更のためのエクソン‐イントロン設定
図2 - pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]に挿入するためのRNAiコンストラクトの作成を図示する2つの方法:(A)単一ステップ非対称PCR(Xiaoから適応した。Y H et al (2006) および (B) 多重ステップ融合 PCR.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. ガンビアの子犬スクリーニング

  1. 微視的特徴付けのための子犬のコレクション
    注:これらのプロトコル全体で水は0.01%の池塩で補われた蒸留水を指します。
    1. リアアンガンビア蚊は、標準的なプロトコル(例えば、MR426)を使用してパパルステージに。
      注意:このプロセスを通して子犬を傷つないように注意してください。
    2. 実体顕微鏡で使用するのに適した透明な平らな皿に子犬を集める(例えば、100 x 15 mmプラスチックペトリ皿、縁を避ける)。
      注:子犬を収集するために、我々は端から約10ミリメートルカットして3mLプラスチックパスツールピペットを使用して、終わりを広げ、蚊の怪我を防ぎます。スクリーニングとセックスは個人で完了することができますが、これは非常に遅いです。50-200の子犬のグループにスクリーニングとセックスを行うことをお勧めします(可能なグループのサイズは使用される料理のサイズによって制限され、個人的な好みの対象となります)。多数のスクリーニングを行っている場合、まず4~5深部の子犬を整列させ、このラインからターゲットの子犬を移動させることで効率を高めることができます。
    3. パスツールピペットを使用して、慎重に子犬の周りからほぼすべての水を除去します。彼らは効果的に不動であるが、細かいブラシで簡単に移動できるように、子犬の周りにちょうど十分な水を残します。彼らが移動することが困難になった場合は、より多くの水を追加します。
      注:十分な水が取り除かれると、子犬は彼らの側に横たわり、蛍光検出と二型性器の識別のための目の視覚化を可能にします(図4DE)。
      注意:子犬が乾燥しないようにしてください。非常に少量の水しか残されていない場合、顕微鏡のランプからの熱と、子犬のプール間で分割すると、さらに減らすことができます。3 mLパスツールピペットを使用して、必要なグループに追加の水を追加する必要があります。
  2. パパエにおける蛍光マーカーの同定
    注:低倍率のステレオスコープの使用は広い視野スクリーニングを可能にし、並べ替えは逆の複合顕微鏡で行うことができるが、個々に行われなくてはなれ。
    1. 蛍光マーカーをスクリーニングする際には、まず、期待される発現パターンと遺伝パターンを知ることが重要です。次の点を考慮してください。
      1. 色: 式を視覚化するフィルターを決定します。
      2. 時空間表現パターン: どこで、どのようなライフステージで表現を期待しているかを理解します。
      3. 異なる型の比率: 母集団の何パーセントが関心のマーカーを運ぶべきかを確立します。
    2. 低光でも蛍光の分解能を妨げる可能性がありますので、暗闇の中で蛍光スクリーニングを行ってください。ただし、他の操作に光が必要な場合は、ステレオスコープの横にランプを使用してください。
      注意: 蛍光ステレオスコープの周囲のワークスペースが明かりを消す前に明確であることを確認してください。
    3. 蛍光灯をオンにし、メーカーの推奨期間(通常10〜15分)のために暖かくしておきます。蛍光ステレオスコープで必要なフィルターを選択し、ステージプレートの中心に向けられた光の色のビームが見えるかどうかを確認します。これが見えないか、非常にかすかな場合、蛍光灯が完全に温まっていないか、シャッターが閉じているか、顕微鏡光学がうまく整列していない可能性があります。
    4. 白色光を使用して、視野に子犬を中心に、焦点にそれらを持って来ます。この倍率は、蛍光強度に応じて異なるフィルタを切り替える際に変更する必要があります。
    5. 細かいディテールペイントブラシを使用すると、調べた子犬が重ならないようにします。
    6. ステレオスコープの白色光を消し、細かい焦点を使って、興味のある表現型を持つ子犬の領域を焦点にします。蛍光パターンが表示されている必要があります。3xP3プロモーター制御蛍光の例を図3に示す。
      1. 蛍光表現型が蛍光シーンのない個体と確実に区別できる最も低い倍率を使用してください。
      2. 明るい蛍光を持つ株については、蛍光シグナルがまだ明確に識別可能である場合、スクリーニング中に同様に低強度の明視野光を使用します。
      3. 一次スクリーニングが終了すると、他のフィルターの下で集団を迅速にスキャンして潜在的な汚染を検出します。
        注意:子犬の動きによる汚染を防ぐために、分類された子犬のグループ間に明確な距離があることを確認してください。グループのサイズは、子犬がセックスされるにつれて変化し、拡大の下で見ると距離が大きく見える可能性があることに注意してください。プールが視野の中にない場合は特に注意してください。

幼虫における蛍光タンパク質の発現;顕微鏡画像;3xP3-eYFP、3xP3-dsRed、3xP3-eCFP。
図3 - 3xP3プロモーター(A)eYFP、(B)dsRedおよび(C)eCFPによって駆動される蛍光マーカーを発現するアノフェレスガンビアの子犬。拡大: A=16X、B、C=20X。

  1. セックス パパエ
    1. 子犬を収集します。余分な水を取り除くが、肛門のパドルが視覚化と形態学的特徴付けを助けるために生殖器からわずかに部分を提供するように十分に提供する(図4D、E)。
    2. 子犬/eが側にない場合は、細かいディテールペイントブラシを使用して子犬をそっと回し、肛門パドルを動かして外部生殖器を特定できるようにします。
    3. 特徴的な外部生殖器に基づいて別々の子犬;男性は、肛門パドルの長さの約半分の長さの最終の裏線から突き出る長い管を有する(図4B)。女性の子犬の外性器はかなり短く、二分(図4A)である。
      注:時折、第4のインスター幼虫外骨格が付いたままであるか、外部生殖器が損傷している場合(図4C)、セックスの自信に満ちた識別はより困難です。子犬の性別がはっきりしない場合は、それを捨てるのがベストプラクティスです。個人が飼われる場合、子犬は単独で出現し、その性別は成人形態学的特徴を使用して決定されるべきである。生殖器が損傷した場合、個人は正常に交尾しない可能性があります。
    4. 料理の反対側にある各セックスのプールをセックスされていないプールに作り、細かいディテールペイントブラシを使用して料理全体で識別された子犬を移動します。2つのプールが集まる皿の下側にラベルを付けて、後でそれらを識別します。
    5. 性と蛍光スクリーニングの両方が必要な場合は、2つの方が速いプロセスであるため、まず蛍光スクリーニングを行う。

蚊の幼虫の比較;男性対女性の形態;顕微鏡画像;蛹の発達段階。
図4 - セックスアノフェールガンビアの子犬.(A)女性(B)男性の外性生殖器を示す個々の子犬と(C)幼虫外骨格の不完全剥離のために容易に同定できない個体である。外部生殖器を強調する下の拡大画像。(女性)と(男性)を伴♀う子犬の外性器を示す(女性)と♂(男性)は、水中に沈んだ子犬の50%〜50%を水に沈め、(E)すべての水を取り除き、外性器の視覚化の容易さの違いを強調する。拡大: A,B,C=40x, D,E=30x. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 大人としてのセックスの確認
    1. 非常に低いエラー率が実証されるまで、出現後に成人形態による子犬のセックスを確認する。数mLの水を持つ透明な20 mLチューブで10以下のグループに別々のセックスされた子犬は、期待されるセックスでラベル付けされた綿毛のボールで密封し、一晩出現することを可能にします。
      注:成人は翌朝転勤なので、新興の成人に食べ物を供給する必要はありません。
    2. 翌日形態学的特徴を用いて成人の性別を確認する。
    3. 男性が女性のコレクションに存在する場合は、交配が既に発生している場合に備えて、女性を捨てます。
    4. 女性が男性のコレクションに存在する場合は、メスを取り除き、男性を横断のために保ちます。
  2. GAL4-UAS システムのクロスの設定
    1. ステップ2.4のチューブから、An.ガンビア飼育のための標準的な方法で設定されたケージまたは小さなバケツに、望ましい数の男性と女性の成人を吸引する。
      注:この転送中に大人に損傷を与えないように注意してください。
    2. 約50人の女性を同数の男性で使用し、約2000人の成人が子孫から必要とされる場合。
      注:十字架は、各セックスの200までの複数のバッチを生成するために複数回供給される場合は、30cm x 30cm x 30cmケージに設定することができます。十字架に利用できる女性の数が少数(<20)の場合、我々は成功した交配の可能性を高めるために、男性の数を〜4倍加えます。
    3. 血液は、適切な段階に交差した女性および後方の子孫を供給し、標準的なプロトコル26に従って、表現型評価(例えば、殺虫剤耐性、ベクター容量およびフィットネスコストアッセイ)を実施する。
    4. トランスジーン発現の母性効果が高い場合、ドライバーと応答線の相互交差を設定し、予測される表現型をアッセイする。
      注:ドライバーと応答線の「ヘテロ接合」または混合集団を使用して交差し、4つの可能な遺伝子型のそれぞれで子孫を生成します。これは野生型、UASのみおよびGAL4の制御、および表現型を分析する経ヘテロ接合GAL4-UASを提供する。ホモ接合母集団が交差している場合は、相乗りを追加して、相型を比較するための適切な制御を行います。子孫は、表現性評価のために、両方またはどちらかのマーカーだけでなく、ネガのみを運ぶ子孫を分離する上記としてスクリーニングされるべきです。
  3. 代替蛍光マーカーを運ぶRCMEを介して生成されたラインからホモ接合集団を確立する
    注:両方のラインの蛍光マーカーが同じゲノム位置に存在し、完全に区別できることが不可欠です。
    1. 上記のように、スクリーニング後にスクリーニングの1行の男性と他の行の女性の差額が同数の約200人の成人のペアクロスを設定し、正しい蛍光と性別を表示する個人を選択します。約1週間後、確立されたプロトコル26を使用して十字架を血液供給する。
      1. F1の子孫を標準プロトコルを使用して子犬にリアし、前述のように子犬を収集します。
    2. 両方の親のマーカー(経ヘテロ接合)を担持するものを選択する蛍光のためのスクリーン。これらの子犬とF1インタークロスを設定します。
    3. 1週間後、血液はF1メスと後部子孫を標準的なプロトコルに従ってプパルステージに供給する。
    4. F2の子犬は、マーカーの1つだけを表示するものを選択します。これらは挿入のためのホモ接合である。各挿入に対して子孫の25%だけがホモ接合性となるので、ストックケージ(400-500)を提供するのに十分な子孫が飼育されていることを確認してください。
      注:半二重化後生とは、プロセスが汚染され、完全な均質性が達成されない場合があります。F1 インタークロスに選択されたすべての子孫を再確認します。

3. ガンビア胚クリアリングプロトコル

  1. 血液の供給とメンテナンス
    1. リアアンガンビア蚊は、標準的なプロトコル(例えば、MR4)に従って成人に蚊。
    2. 血液は5-7日の女性成人を養い、ほとんどの人が完全に魅了されていることを保証する。
      注意:このプロトコルを通して、卵が脱ジケイを許されないようにするためには、迅速に動作することが不可欠です。
  2. 誘発産卵
    1. 授乳後3日は、誘発産卵を通じて卵を収集する。
    2. オビポジションチャンバーを組み立てます。
      1. 約5ミリメートルの深さに水で卵子ポットを充填します。鍋を50 mLポリプロピレンチューブの一方の端に取り付け、前に両端が開くようにハックソーで切断します。(私たちは、ポット(図5)にプラスチック製のディスクを使用しますが、チューブの元の蓋を代わりに使用することができます)。
      2. カットポリプロピレンチューブのもう一方の端を、材料(ホース/タイツ)またはラテックス手袋の切片を弾性バンドで固定して覆い、大人を導入することはできますが、脱出することはできません(図5)。他の代替の卵位の部屋の設計は存在し、使用することができる26。
    3. 10~15名の女性(ステップ3.1.2で血液を供給)を卵膜室に慎重に導入する。暗闇を生成し、20分間放置するために、排卵室をカバーします。
      注意:卵の座礁や乾燥を防ぐために卵が産まれたら、卵の卵子ポットを動かさないようにしてください。
    4. 50 mLポリプロピレンチューブをオビポジションポットから慎重に取り外し、蚊を放出しないようにします。白い卵が見えるはずです。規定された目的のために十分な準備ができたことを確認してください。必要に応じて、この手順を繰り返します。
    5. ポット(防塵用)を覆い、卵が目的の発達段階まで成熟できるようにします。
    6. 細かいディテールペイントブラシを使用して、ポットから卵を拾い上げ、40mm2の発掘ガラスブロックに水の上に置きます。

DIYろ過セットアップ;プラスチック容器、図の輪ゴム:自家製浄水器の設計。
図5 -オビポジションチャンバー(A)の例は、構成部品を強調するために解体され、(B)組み立て。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 胚固定
    注意:ホルムアルデヒドの使用により、ヒュームフードですべての固定手順(ステップ3.3)を実行します。
    1. カイザーら(2014)22に記載されたFAA溶液を調製する。FAAは、3.6Mホルムアルデヒド、0.87 M酢酸、8.5 Mの絶対エタノールで、蒸留水(dH2O)で体積まで作られています。
      1. FAAの10 mLは13.42 Mホルムアルデヒドの2.68 mL、17.14 Mエタノールの4.96 mL、蒸留H2Oの1.86 mLの17.4 M酢酸の0.5 mLを組み合わせたもので、密閉されたガラス容器に少なくとも3ヶ月間保持することができます。
    2. ガラスブロックからマイクロピペットで慎重に水を取り出し、卵を500μLのFAAで覆い、室温で30分間軌道シェーカーで穏やかに振動します(約25RPM)。この時点では、色の変更は表示されません。
    3. 卵を蒸留水で十分に洗い流します。15回すすいでホルムアルデヒドの痕跡をすべて除去します。1000 μL マイクロピペットを使用して、1 mL の dH2O を一度に加え、取り除き、卵を損傷しないようにします。
    4. 安全ガイドラインに従って処分するために、指定されたホルムアルデヒド廃棄容器にすすりから排水を保管してください。
    5. この時点で、固定卵は水に一晩4°Cで保存することができ、水分補給を維持することができます。
  2. 胚の漂白
    注意:次亜塩素酸ナトリウムと酢酸を組み合わせると塩素ガスが放出される可能性があるため、発煙フードですべての漂白手順(ステップ4)を実行します。
    1. 漂白液を調製する(Trpiš溶液-Trpiš(1970)21に記載され、カイザーら(2014)22に従って修正された)。Trpiš溶液は、0.59 M次亜塩素酸ナトリウム及び0.35Mの酢酸を蒸留H2Oに溶解した。
      1. Trpiš溶液の10 mLオードの場合、2.2M次亜塩素酸ナトリウム2.68mLと17.4 M酢酸の0.2 mLと蒸留H2Oの7.12 mLを組み合わせます。
        メモ:Trpiš溶液は、密閉ガラス容器に少なくとも3ヶ月間保存し、安全な化学食器棚に保管することができます。溶液は貯蔵後にボルテックスする必要があり、塩素ガスが放出される場合には常にヒュームフードで開く必要があります。
    2. 1 mLのTrpiš溶液で固定卵を覆い、室温で30分間インキュベートします。卵は、インキュベーションの約5分後に淡いパッチを開発し始め、最終的に一度クリアされると乳白色に達します。
    3. ステップ3.3.3のように卵をリンスし、Trpiš溶液を除去する。
    4. 排水を指定された廃水容器に保管し、排水管の下に余分な水で処分します。
  3. 貯蔵
    1. dH2Oを500μLで保存し、2〜8°Cの間で数日間保管してください。質量の観察とイメージングの前に慎重に水のほとんどを取り除くが、時計ガラスに少量の水を残すことによって卵の乾燥を避ける。これは卵の撮影を妨げない。個々の卵は、より高い拡大画像のために顕微鏡スライドに置くことができる。

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結果

eYFP、dsRedおよびeCFPの3xP3発現は、アンガンビアの子犬の目と腹側神経節で発現を産生するマーカー遺伝子を有する個体の信頼性の高い、容易に区別可能な同定を提供する(図3)。男女の性器で観察される差形の形態と、識別できない子犬の例を図4に示す。子犬からすべての水を除去すると、肛門のパドルが生殖器の可視化をあいまいにするので、セックスの困難が増加します(図4D,E)。二partite GAL4-UASシステムは、応答線UAS-mCD8:mCherry10を有するユビキタス(図6A、C)およびオエノサイトドライバ(図6B、D)ラインを横断することによって...

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ディスカッション

蚊の遺伝子機能を理解することは、アノフェレスを制御し、マラリア感染に影響を与える新しいアプローチを開発するために不可欠です。記載されているGAL4-UASシステムは、候補遺伝子の機能解析のための汎用性と強力なシステムであり、現在までに我々は殺虫剤耐性の遺伝的基礎を調べるためにシステムを使用しています17とキューチキュラー炭化水素生産15,23だけでなく、蛍光で異なる蚊細胞集団をタグ付けする8.これまでのところ、レスポンダーコンストラクトは、制限酵素を介してプラスミドにクローニングされ、UASの下流に複数のクローニング部位を運ぶ(図1、表1)。しかし、複数の要素(attB部位、3xP3-YFPおよびジプシー絶縁体配列)を運ぶ構造のモジュール的な性質のために、より現代的な技術は新しい応答性プラスミドを構...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

我々は、LSTMとIVCC(アドリアナ・アドルフィ)、BBSRC(新捜査官賞(AL)、MRC(BCP:MR/P016197/1への博士課程の学生シップ)、ウェルカム(LGへのヘンリー・ウェルカム博士研究員:215894/Z/19/Z)からの資金提供を感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 x 15 mmプラスチックペトリ皿SLS217554610
1000個入りパック&マイクロ;L ギルソン ピペットギルソンF144059P
20/25 mL ユニバーサル チューブStarlabE1412-3020400 個入りパック
3 mL パスツールピペットSLSG612398Greiner パスツールピペット 3 mL 滅菌済み 個別包装
50 mL ファルコン チューブフィッシャー サイエンティフィ11512303
無臭エタノールフィッシャー サイエンティフィBP2818-500500 mL
酢酸SLS45726-1L-F1 L
ケージSLSE609930x30x30 スクリーンポート付き
ファインペイントブラシAmazonUKDPB66KOLAMOON 9 個 ディテールペインティングブラシセット ミニチュアブラシ 水彩、アクリル画、油絵 (ワインレッド)
魚料理アマゾンテトラミンフィッシュフード、健康、色、活力のためのすべての熱帯魚のための完全なフード、10リットル 
ホルムアルデヒド溶液シグマ アルドリッチF8775
口内吸引器ジョン・ホック612
ポンドソルトアマゾンブラッグドン ガーディアン ポンド トニックソルト、魚の健康、水質、一般的な強壮剤、pH バッファー、9.08 kg、9,092 L 
蛹の鉢Cater4youSP8OZ蓋付き 250 鉢
小さなプラスチック バケツアマゾン2.5 L 白いプラスチック バケツ 白い蓋付き (10 個入り) 
次亜塩素酸ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS25552
ック ック

参考文献

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