組織組織の血栓溶解性の有効性と溶解薬を測定するインビトロシステム

サマリー

肝トリプシー支援溶解性分娩またはリソトリプシーは、深部静脈血栓症の治療のために開発中である。この併用療法の有効性を評価するために、インビトロの手順をここに提示する。血栓モデル、画像ガイダンス、および治療有効性の評価のための主要なプロトコルについて議論する。

要約

深部静脈血栓症(DVT)は世界的な健康上の懸念事項です。臨界閉塞の血管再カナル化を実現する第一のアプローチは、カテーテル指向血栓溶解薬(CDT)です。苛性副作用と CDT に関連する長い治療時間を軽減するために, アジュバントと代替アプローチが開発中です。.そのようなアプローチの1つは、気泡雲核形成を介して組織をアブラレートする集中超音波療法であるヒストトリップシーである。前臨床試験は血栓分解のためのヒストルシーと血栓溶解薬の間の強力な相乗効果を実証した。本報告書は、組織虫補助血栓溶解療法、またはリソトリップスの有効性を評価するためのベンチトップ法を概説する。

新鮮なヒト静脈血から製造された血栓は、その寸法およびアクロスメカニカル特性が腸骨静脈を模倣する流路に導入された。チャネルは、血漿およびリコンビナント組織型プラスミノーゲン活性化剤と浸透した。バブル雲は、大腿静脈血栓の治療のために設計された焦点を当てた超音波源を有する血栓に生成された。電動ポジショナーは、血栓の長さに沿ってソースフォーカスを変換するために使用されました。各インソネーション位置では、バブル雲からの音響放出を受動的に記録し、受動的キャビテーション画像を生成するためにビーム形成された。治療効果を測定するための指標には、血栓質量損失(全体的な治療効果)、およびパーフューズ動物中のD-二量体(線維化症)およびヘモグロビン(血糖化)の濃度が含まれていた。このインビトロ設計には、生体内の副作用を評価する手段の欠如や血栓のlysesとしての流量の動的変化を含む制限があります。全体として、このセットアップは、DVTを治療するためのヒストトリップシーベースの戦略の有効性を評価するための効果的な方法を提供する。

概要

血栓症は、循環を妨げる健康な血管における血栓形成の状態^である。静脈血栓塞栓症の医療費は年間7~100億ドルで、米国では375,000-425,000例^です。肺塞栓症は肺動脈の閉塞であり、静脈血栓塞栓症の最も深刻な結果である。肺閉塞の主な原因は深部静脈血栓症であり、主に腸骨静脈セグメント^4、5、6から^である。深部静脈血栓症(DVT)は、痛み、腫れ、足の潰瘍、および四肢切断^7、8、9をもたらす長期的な合併症を有する肺閉塞以外に固有の後遺症^を有する。重大な閉塞の場合、カテーテル指向血栓溶解薬(CDT)は、血管再カナル化¹⁰の最前線のアプローチである。CDTの結果は、血栓の年齢、場所、サイズ、組成、病因、および患者リスクカテゴリ¹¹を含む多くの要因に依存します。さらに、CDTは、血管損傷、感染症、出血合併症、およ....

プロトコル

ここに示された結果については、静脈ヒト血液は、地元の内部審査委員会(IRB #19-1300)の承認後に血栓を形成するために引き出され、ボランティアドナー²⁴によって提供された書面によるインフォームド・コンセントを形成した。このセクションでは、リソトリップの有効性を評価するための設計プロトコルの概要を説明します。プロトコルは、ボレンら²⁴の以前の作業に基づいています。

1. クロットモデリング

注:血栓の安定性を確保し、最大の引き込み²⁸を確保するために、2週間以内に、しかし、実験の日の3日以上前に血栓を準備します。地元の機関審査委員会の承認に従って血栓を準備してください。

1. 血液を保存するためのホウケイ酸パスツールピペットを準備します(ピペットの仕様については 、材料表 を参照)。ホウケイ酸チューブは、血小板活性化および血塊の引き込みを促進する材料の親水性の性質のために使用される^。ブンゼンバーナーの上に加熱してピペットの先端をシールします。
2. 新鮮な人間の静脈血を描きます。アリコート所望の血栓当たり2mL単位で引き出された総血液をアリコートする。各2 mLアリコ....

結果

本研究で概説されているプロトコルは、DVTのインビトロセットアップにおける静脈血栓モデリング、血栓破壊のためのリソトリップ、および超音波イメージングの詳細を強調している。採用された手順は、rt-PAとヒストトリップスバブルクラウド活動の組み合わせによる血栓破壊を評価するために必要な手順を示しています。ベンチトップのセットアップは静脈の腸骨静脈の特徴を模倣するように設計されていた。 図1A は、骨位静脈の音響、機械的、幾何学的特性を有するモデル容器を示す。血栓は、部分的に閉塞性血栓を模倣するためにモデル容器の中に配置されます。血栓は0.65 mL/minの速度で貯留層から引き出される血漿およびrt-PAと浸透する。この速度は、非常に閉塞した容器³⁴における遅い流量と一致する。

楕円的に集線型のトランスデューサは、9cmの長軸、7cmの短軸、および6cmの焦点距離を有する1.5MHz基本周波数(図2A)が

ディスカッション

提案されたプロトコルは、リソトリップスの治療効果を定量化するモデルを提示する。重要な詳細については説明しましたが、このプロトコルの成功には、いくつかの重要な側面を考慮する必要があります。rt-PAの酵素活性は、アレニウス温度依存性³⁰を有する。温度は水や組織の音速にも寄与する要因であり、温度の変化は焦点域の幾何学的形状のわずかな変化を引き起こす可能性があります。したがって、水温は37°Cで慎重に調整する必要があります。プロトコルで使用されるrt-PAの用量(2.68 μg/mL)は、他の薬力学的血栓切除戦略⁴²のために臨床的に採用されたものと一致する。ステップ5.8では、30mLのプラズマがリザーバに移され、35mLアリコートがステップ3.1.3に記載されている。この追加のプラズマは、大気圧に平衡させるために37°Cに加えた時間の経過に伴う蒸発によるプラズマの損失を占めています。

焦点距離、絞り幅、および治療トランスデューサの周波数は、焦点領域のサイズと深さを決定します。したがって、トラ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
吸収シート	精密音響	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
ホウケイ酸パスツールピペット	フィッシャーサイエンティフィック	1367820A	長さ 14.6 cm、容量2 mL
遠心チューブ	エッペンドルフ	22364111	容量1.5 mL
ドラブキンアッセイ	シグマアルドリッチ	D5941-6VL
ドローシリンジ	コールパー	マーEW-07945-43	60mL容量
フィルターバッグ	マクマスターカー5162K111		ミクロンまでの粒子サイズを除去
流路チューブ	マクマスターカー5154K25		ポリエチレンライニングEVAプラスチックチューブ(外径:3/8インチ、内径:1/4インチ
発熱体	ウォンブラザーズ	HT 300チタン	ロッド タンクの底に置かれたチタンロッド
イメージングアレイ	ベラソニックス	L11-5v	128エレメント、感度は-55〜-49dB
低ゲル化アガロース	ミリポアシグマ	A9414
モデル容器	マクマスターカー	5234K98	長さ6.6cm、内径0.6cm、厚さ1mm
ナノ純水	バーンステッド	ナノピュアダイヤモンド	ASTMタイプI、18Mohm-cm抵抗率
プラズマ	Vitalant	4PF000	プラズマは24時間以内に凍結
プレートリーダー	Biotek	Synergy Neo HST プレートリーダー	ヘモグロビン定量用
プローブカバー	Civco	610-362
プログラミングプラットフォーム	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター (rt-PA)	ジェネンテック	アクティバーゼ
リザーバー	コールパーマー	EW-07945-43	60mL容量
リンジポンプ	コールパー	マーEW-74900-20	ポンプをシリンジに取り付け、あらかじめ決められた速度で流路の流れを吸い込む
トランスデューサ	社内でカスタマイズされた		8エレメント、楕円形に焦点を合わせたトランスデューサー(長軸9cm、短軸7cm、焦点距離6cm)、カスタム設計・造られたクラスDを搭載アンプとマッチングネットワーク
超音波スキャンシステム	ベラソニックス		バンテージ 研究用超音波システム
水タンク	高度なアクリル	C133	14 x 14 x 12, 1/2"

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