ここでは、マウスにおける創傷感染からの細菌分散を評価するための ex vivo および in vivo 方法について述べた。このプロトコルは、局所抗菌および抗菌性の治療の有効性をテストするために、または異なる細菌株または種の分散能力を評価するために利用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
バイオフィルム関連感染症は、非治癒糖尿病性足潰瘍、慢性副腎炎、再発性中耳炎などの慢性疾患の広い配列に関与しています。これらの感染症内の微生物細胞は、抗生物質および宿主免疫細胞が感染をクリアするのを防ぐことができる細胞外ポリマー物質(EPS)によって保護される。この障害を克服するために、研究者は潜在的な治療薬として分散剤の開発を開始しました。これらの薬剤は、バイオフィルムEPS内の様々な成分を標的とし、構造を弱め、細菌の分散を起こし、理論的には抗生物質の効力と免疫クリアランスを改善することができる。創傷感染に対する分散剤の有効性を判断するために、 我々は、ex vivo と in vivoの両方のバイオフィルム分散を測定するプロトコルを開発した。我々は、バイオフィルム関連の慢性創傷感染症を作成するためによく説明されているマウス外科切除モデルを使用する。 生体内の分散を監視するために、ルシファーゼを発現する細菌株で創傷に感染します。成熟した感染症が確立したら、バイオフィルムEPSの成分を分解する酵素を含む溶液で創傷を灌漑します。次に、創傷と臓器の発光信号の位置と強度を監視し、達成した分散レベルに関する情報を提供します。バイオフィルム分散の ex vivo 解析では、感染した創傷組織がバイオフィルム分解酵素溶液中に沈下され、その後、組織に残っている細菌負荷は、溶液中の細菌負荷に対して、評価される。どちらのプロトコルにも長所と短所があり、分散処理の有効性を正確に判断できるように最適化できます。
概要
世界的な抗生物質耐性の上昇は、細菌感染症の様々な治療するための抗生物質の選択肢の欠如につながっている1.抗生物質耐性に加えて、細菌はバイオフィルム関連のライフスタイル2を採用することによって抗生物質耐性を得ることができる。バイオフィルムは、多糖、細胞外DNA、脂質、タンパク質3のマトリックスによって保護される微生物の集まりであり、細胞外高分子物質(EPS)と総称されます。抗生物質耐性の危機が続く中、抗生物質の使用を延長したり、有効性を増強したりする新しい戦略が必要です。抗バイオフィルム剤は、有望なソリューションの1つです 4.
提案されている異なる抗バイオフィルム戦略の中で、バイオフィルムEPSの異なる成分を標的とする分散剤の利用は、治療開発5の最前線にある。グリコシド水化酵素(GH)は、分散剤のそのようなクラスの一つである。GHは、EPSに構造的完全性を提供する多糖内の異なる結合の切断を触媒する酵素の大規模なクラスである。我々のグループは、他のグループと同様に、GHが効果的にバイオフィルムを分解し、分散を誘導し、インビボ
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プロトコル
この動物プロトコルは、テキサス工科大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会によって見直され、承認されました(プロトコル番号07044)。この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用ガイドの勧告に厳密に従って行われました。
1. マウス感染のための細菌の準備
注:ここでは、 緑膿菌に感染するマウスについて説明します。しかし、他の細菌種は、感染を引き起こすために使用され得る。細菌株と材料は、 材料の表に詳述されています。
- シュードモナス・エルギノーサ野生型株PAO1を使用して、前述のとおりこれらの実験のために発光プラスミドpQF50-lux23を運ぶ7。
- バッフルエルレンマイヤーフラスコで P.エルギノーサ 株を成長させ、200rpmで振盪し、ルリア・ベルタニ(LB)スープで37°Cで16〜20時間成長させる。プラスミドの維持のためにPAO1(pQF50-lux)の一晩培養に100 μg/mLのアンピシリンの最終濃度を加えます。
- サブカルチャー P.エルギノーサは、100μg/mLアンピシリンの最終濃度を有するLBスープ10mLを含むエルレンマイヤーフラ....
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結果
この実験では、8-10週齢のスイスウェブスターマウスは、pQF50-ルクスの発光プラスミドを運ぶPAO1の104 CFUに感染した。上述したように、感染症は、バイオフィルムEPSを消化するためにPBS(車両制御)または10%GH(処置)の3 x 30分治療を投与する前に48時間の間確立することを許した。マウスは、治療前に、治療後(0時間)および10時間および20時間後に直接、処置前に画像化した。 図2A および 補足図1 は、明るい生物発光シグナルを発生する創傷床内で確立された感染を示す。創傷床から細菌の分散はGH処理後(0時間)の直後に可視化することができるが、PBS処理後には可視化されない。以前の研究では、GH治療7の5時間後に早くも血液および脾臓中の細菌を検出した。器官への細菌の播種はまた、 図2Aの下のパネルに示すように、マウスをその側に置いて画像化することによっても見ることができる。
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ディスカッション
ここでは、バイオフィルム分散剤の有効性を研究するために利用できるプロトコルについて説明する。これらのプロトコルは、さまざまな種類の分散剤、細菌種またはex vivoサンプル(臨床デブリドメントサンプルを含む)で使用するように容易に適応することができる。このプロトコルはまた、分散細菌細胞を収集し、研究するための臨床的に関連するモデルを提供します。分散細菌細胞のフェノタイプは、プランクトニック細胞またはバイオフィルム細胞5、24、25、26のいずれかのものとは異なることを示している。しかし、生体内に分散した細菌の表現型は、まだ説明されていない。分散剤を治療上使用する場合、それらの効能を決定し、またこれらの細胞が採用する表現型を理解することが重要である。さらに、このプロトコルは、EPS構造の変動やシグナル伝達経路の変化が分散にどのように.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所(R21 AI137462-01A1)、テッドナッシュロングライフ財団、ジャスパーL.とジャックデントンウィルソン財団、国防総省(DoD MIDRP W0318_19_NM_PP)からの助成金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | フィッシャー | 14823434 | の連続希釈を完了するために使用 |
| フィッシャー | 14823434 | 1 mLシリンジアン | |
| ピシリンナトリウムソル | トフィ | ッシャーBP1760-5 | 50 mg / mLのストック溶液を作り、100 & micro;一晩および継代培養のためのLBのスープのLへの10のmL |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | 5% w/vの解決、ボルテックスを作る他の分散剤は |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | 痛みの管理としての使用-他の選択を使用することができます |
| セルラーゼ | MPのBiomedicals | 2150583 | 5% w/v アミラーゼ溶液 Vortex に 5% w/v を加え、37°Cで活性化します。C 30分間-他の分散剤を使用することができます |
| 脱毛クリーム | ウォルマート | 287746 | 少量を使用して動物の背中の毛包にマッサージし、髪の毛を取り除くために10分を割り当てます |
| ドレッシング鉗子、鋸歯状の先端 | フィッシャー | 12-460-536 | 他の形態の鉗 |
| 三角フラスコ 困惑した 125 mL | フィッシャー | 101406 | 一晩中成長するために使用し、細菌の亜培養 |
| FastPrep-24ベンチトップホモジナイザーMP | バイオメディカル | 6VFV9 | 組織を均質化するために5 m/sを60秒間2回使用 |
| 致命的なプラス | ボルテックファーマシューティカル | 0298-9373-68 | 各マウスに0.2mLの会陰内注射 |
| 均質化チューブ(ビーズチューブ2 mL 2.4 mm金属) | フィッシャー | 15340151 | |
| をめっきするためのサンプルを均質化するために使用されます | |||
| ケタミン塩酸塩/キシラジン塩酸塩の解決C-IIIN | シグマAldrich | K4138 | の使用 anasethia-他の選択としてまたanasethia |
| LBのスープ、ミラー | のフィ | ッシャーBP1426-2 | 25 g/Lおよびオートクレーブ |
| のリドカイン2%の注射可能な | ダイヤモンドの背部薬剤 | 2468 | を加えるマークされた創傷床領域の側面から0.05mLを注入して、マークの中央に沈着させます。メロペネムを切断する10分前に割り当て |
| Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | 的に適用するためにGH溶液に加えるために5 mg / mLを作り、治療の4時間前と6時間後に腹腔内に注射する15 mg / mL溶液を作り | |
| 非滅菌綿ガーゼスポンジ | フィッシャー13-761-52 | 脱毛クリーム | |
| PAO1 pQF50-lux細菌株 | Ref [13] | N / A | PAO1 pgF50-luxは、この論文の代表的な結果で関心のある緑膿菌株として使用されました |
| ペトリ皿 | フィッシャー | PHR1772-500MG | |
| リン酸緩衝液 生理食塩水 10倍 | フィッシャー | BP3991 | 使用前に10倍から1倍に希釈 |
| ポリウレタンドレッシング | マッケソン | 66024007 | 丸みを帯びたエッジを切り取り、残りの正方形を4等分に切ります |
| シュードモナス分離寒天 | VWR | 90004-394 | グリセロール / L 20 mL と 45 g/mL を水、オートクレーブに加え、20 mL をシャーレに注ぎ |
| リフレッシュ PM | ウォルマート | は、処置中の乾燥を減らすために目で使用します。 | |
| 滅菌アルコール準備パッド | フィ | ッシャー22-363-750 | 領域を消毒するために傷つく直前に皮膚をきれいにするために使用 |
| ストレートデリケートはさみ | フィ | ッシャー89515 | また、湾曲したはさみを使用することができます |
| スイスウェブスターマウスチャー | ルズ | リバー551NCISWWEB | 他のマウス株は、 |
| シリングスリップチップ1mL | ッシャー | 14823434 | 薬物を投与するために使用されます酵素治療 |
参考文献
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
- Flemming, H. C., et al.
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