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方法論記事

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

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DOI:

10.3791/62139

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2021年5月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Comparative Pathobiology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University, 3Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 5Program for Comparative Medicine, Gene Therapy Program, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 6Tuskegee College of Veterinary Medicine, 7Department of Human Pathology, Juntendo University Faculty of Medicine, 8Department of Surgery, Juntendo University Shizuoka Hospital, Juntendo University School of Medicine, 9Department of Urology, The Johns Hopkins School of Medicine, 10Department of Gastroenterology and Minimally Invasive Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、転移生物学の前臨床調査や新規治療薬の開発に使用できる自発的な肺転移を伴う骨肉腫の切断手順に続く同種の同一性の好交性移植法について説明する。

要約

骨肉腫(OS)の治療における最新の進歩は、多剤化学療法が手術単独と比較して全体的な生存率を改善することが示された1980年代に起こった。この問題に対処するために、研究の目的は、生存を延長する包括的な組織学的、イメージング、生物学的、移植、および切断外科的アプローチを有するラットのあまり知られていないOSモデルを改良することである。免疫担当のスプレイグ・ドーリー(SD)、移植されたUMR106 OS細胞株(SDラット由来)を有する同種ラットモデルを使用し、3週齢のオスおよびメスラットに直交性脛骨腫瘍インプラントを用いて小児OSをモデル化した。ラットは再現性のある原発および転移性肺腫瘍を発症し、移植後3週間で四肢切断が肺転移の発生率を有意に減少させ、予期せぬ死亡を防ぐことを発見した。組織学的には、ラットの主要および転移性OSはヒトOSと非常によく似ていた。OS細胞のタンパク質発現調査では、これらの腫瘍がErbBファミリーキナーゼを発現することが明らかである。これらのキナーゼはほとんどのヒトのOSでも高発現しているため、このラットモデルは、治療のためのErbB経路阻害剤をテストするために使用することができる。

概要

骨肉腫(OS)は、小児、青年、および若年成人において最も一般的な原発性骨腫瘍である。OSの治療における最新の進歩は、1980年代にマルチエージェント化学療法が手術単独と比較して全体的な生存率を改善することが示された1で起こった。OSは急速な骨成長の間に発症し、通常は大腿骨、脛骨、上腕骨などの長い管状骨で発生する。それらは、骨分解、骨芽細胞、または顕著な骨胞反応2との混合外観によって特徴付けられる。化学療法および外科的切除は、患者2,3の65%に対して5年間生存期間の患者の転帰を改善することができる。残念ながら、転移性疾患を有する高グレードOS患者は20%の生存率を有する。OSは地域的に侵入し、主に肺や他の骨に転移し、男性でより一般的です。これらの若い患者のための最も説得力のある必要性は、遠くの転移の生存率を予防し、排除する新しい療法である。

OSの前臨床モデルは、4、5、6、7のレビューを受けており、正体異性体OSの切断を用いた免疫担当モデルがいくつか開発されている。2000年には、異所性同質OSと切断8を有するBALB/cマウスを用いて重要なモデルが開発された。このマウスモデルと比較して、ラットモデルは遺伝的に繁殖し、10倍の大きな動物に基づいており、いくつかの利点につながる。ラットUMR106モデルは、スプレイグドーリー(SD)ラットで32P誘導OSから開発され、細胞株9に誘導された。2001年、UMR106-01の正代所移植は、ヒトのOSと共通する迅速で一貫した原発性腫瘍の発達および放射線学的特徴を有するア胸腺マウスの移植されたティビアに最初に記載された。肺転移が発症し、骨微小環境10へのUMR106の正交所配置に依存していた。2009年、Yu et al.11は、大きな雄SDラットにおいてUMR106細胞を用いて再現可能な直交体大腿骨OSラットモデルを確立した。切断せずにラットの腫瘍移植と肺転移率が成功したのは、ここで示したデータと類似していた。本研究では、若いラットを用いたモデルへの切断を追加し、特に転移性進行に関連するOSのモデリングにおいて原発性腫瘍除去のタイミングが重要であることを示唆した。この改良により、切断および生体内イメージングは、OSの新規薬物評価のための前臨床試験のためにこのモデルを改善する。

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プロトコル

ラットを含むすべての手順および実験は、ジョンズ・ホプキンス動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。

1. SDラットOS細胞株UMR-106細胞培養プロトコル

  1. DMEMで細胞を成長させ、10%(v/v)FBS、ペニシリン(10 U/mL)-ストレプトマイシン(10 U/mL)を加湿した5%CO2 雰囲気で37°Cで増殖させる。2-812の通路を持つ細胞を使用して実験を行う。

2. OS細胞プロトコルの脛腔内注入

注意:時間交配妊娠中のSDラットは、動物施設で出産し、3週齢で、ごみが使用されます(UMR 106細胞株はSDラットに対して同種であるため、照射は必要ありません)。

  1. 誘導
    1. ラットを中型誘導室に入れ、2%~3%のイソフルランで麻酔を誘発する。足指のピンチ、呼吸数、および性格に反射することによって麻酔の深さのために継続的に動物を監視します。
    2. 鼻をノセクネに挿入します。必要に応じてテープで保護します。
    3. 右足の毛を腹側まで取り除き、後側の下腹部をバリカンで取り除くか、脱毛剤を使用します。ラットをサピーヌの位置に置きます。
    4. 70%エタノールと希釈クロルヘキシジン酢酸または希釈ベタジンを使用して、手術領域を無菌でスクラブします。膝の領域の周りを開始し、近位と遠位の両方の円形の動きでスクラブ。この手順を 3 回繰り返します。腫瘍の移植にはドレープは使用しない。
    5. 麻酔によって引き起こされる角膜乾燥を防ぐために、ラットの両眼に目の潤滑剤を塗布する。弱火設定の加熱パッドにラットを置きます。ラットの体温(37°C)と呼吸数を確認してください。
  2. 手術
    1. イオブルランを1.5%~2%(メンテナンス用)でオンにします。動物がつま先ピンチ反射の欠如を介して麻酔の十分な平面にあることを確認してください。ない場合は、2.5%にイオブルランの割合を増やします。
    2. 挿入する深さのガイダンスのために先端から10mmで滅菌針(約22G)をマークします。
    3. 脛骨台の真ん中で曲がった膝に入り、光ドリルのような動きをして腸の脛骨の糖尿病に針を10mm下げて開きます。針を取り外します。
    4. 脛脛に注入する前に、細胞懸濁液をハミルトン注射器に直接ロードします。これを行うには、重力が細胞をチューブの底に落ち着かせるように、注射器に描く前に細胞を穏やかに混ぜます。
      注:細胞は、慎重に混合した後、ハミルトンシリンジ(100 μL)に描画する前に、1.5〜2 mLチューブ(室温)に保存することができます。細胞は、移植手順中に2〜3時間室温で保つことができます。常に、移植セッションの前と後にチューブ内の細胞の生存率を確認してください。トリパンブルー除外は、細胞生存率評価の最も簡単な方法です。
    5. 最初の針で骨を通過したら、細胞を装填した100 μLハミルトン注射器に取り付けられた第2の針(直径の小さい針も10mmでマーク)を挿入します。10mmのマークまで針を同じ穴に挿入して、糖尿病に伸びるようにします。
    6. PBSで75,000個のOS細胞懸濁液を20μL軽く排出し、ジアフィシスと骨髄腔に排出します。
      注:針は骨の中でぐらつくべきではなく、安全に感じるはずです。針が動きやすくなれば、皮質は、糖尿病で横断された可能性がある。セルの挿入前にしっかりと配置するには、挿入をもう一度繰り返します。
    7. 骨からハミルトン針を取り除きます。
      注:血液の小さな滴が形成された場合は、光圧を適用します。穿刺部位に透明な流体が滴下する場合、針は骨内で十分に伸びていない可能性があり、腫瘍細胞懸濁液が穴を通って漏れ戻った可能性がある。これをノートに記録するが、一般的に、腫瘍移植は成功するだろう。経験を積むと、腫瘍移植手順はラット1ラットあたり5分を要するはずです。経験を積むと、骨内の細胞の腫瘍移植が容易になります。骨の周りの筋肉に細胞を偶発的に注入することは、肺転移に必要な腫瘍微小環境に至らない可能性がある。
  3. 回復
    1. ラットが規範的であることを確認します。ラットをケージに入れ、ケージの下に暖房パッドを置いて回収します。
    2. 完全に目を覚ました後, 移動, よく呼吸, ブプレノルフィンでラットを注入 (1.0-1.2 mg/kg SC).
      注:ブプレノルフィンへのアクセスを得るためには、獣医スタッフを通じて承認のためのオプションを確認するために機関に確認してください。
    3. ラットを清潔なケージに戻し、毎週1日1回監視します。

3. 測定と監視

  1. 腫瘍サイズを9-10日の移植後測定し、その後、2日ごとに3週間の移植後まで、増殖速度を確立します。電子または手動キャリパーを使用して脛石の最大直径を測定します。データを、腫瘍量を計算する式を使用してスプレッドシートに保存します。ベースラインとして対側(移植された脛骨ではない)を測定する。
    注:埋め込まれた後肢の直径は腫瘍のサイズの代理として使用される。後肢は、脛骨長軸に対して垂直に測定され、2回の測定で、腹側/裏側および四肢のメディア/横方向の2つの測定を行います。推定腫瘍容積は式11:腫瘍容積(mm3)=最大径(mm)x 最小径(mm)2/2で算出される。
  2. 腫瘍が最大の次元で15mmに近づくか、腫瘍移植後3週間で生存切断または化学療法治療のためのラットを考慮する。対側肢は、この年齢でほとんどのラットで約7〜9mmを測定する。

4. ドキソルビシン静脈内投与

  1. 2%イオブルランでラットを麻酔します。13のようにベタジンとアルコールを使用して3回の外科的なするみで頸静脈の上に皮膚を準備する。
  2. 慎重な解剖の下で、右または左の頸静脈を視覚化する。上にある筋肉に針を挿入し、胸部筋の頸静脈前部に視覚化されるように、ラットの頭に向かって頸静脈の内腔に向かいます。
    1. 針が頸静脈に挿入されたら、血液を注射器にそっと引き込み、適切な挿入を確実にします。針が静脈を通っていると信じることは可能ですが、針は静脈の下にあり、内腔には入っていません。頸静脈が、鈍い解剖をして頸静脈を露出させると注射に対して小さすぎる場合は、他の頸静脈を注射に使用する。
  3. 100-150 μLの体積で1分以上ゆっくりとドキソルビシン(2mg/kg)を注入します。溶液は、送達中の頸静脈内で静脈内に可視化することができる。
  4. コントロールラットに正常な生理学の同様の量を注入します。
  5. 針を取り除き、滅菌ガーゼで静脈に穏やかな圧力をかける。
  6. 3~4巻切りクリップを使用して皮膚切開を閉じます。射出後7~10日でクリップを取り外します。
    注:ラットは通常、金属クリップを取り外そうとしませんが、縫合糸を噛んだり取り除くのです。頸部注射法は、血管外に漏れる薬物が尾部切断を必要とする尾の壊死を引き起こすので、ドキソルビシンの尾静脈注射に好ましい。

5. 後肢切断プロトコル

  1. 誘導
    1. ラットを中型誘導室に入れ、2%-4%のイソフルランで麻酔を誘発する。麻酔の深さについて、ラットを継続的に監視します。
      注:誘導室は炭キャニスターに清掃され、他のガスは手術に使用されるダウンドラフトテーブルによって取り除かれます。
    2. 鼻をノセクに挿入します。必要に応じてテープで保護します。
      注: この手順は、ダウンドラフトテーブルで、過剰な揮発性ガス(すなわち、イオブルラン)を清掃するために行われます。
    3. 右足の毛を腹側まで取り除き、後側の下腹部をバリカンで取り除くか、脱毛剤を使用します。ラットをサピーヌの位置に置きます。
    4. 70%エタノールと希釈クロルヘキシジン酢酸または希釈ベタジンを使用して、手術領域を無菌でスクラブします。ふくらはぎの真ん中から右下腹部の股関節のすぐ上の皮膚領域までの手術のために皮膚を準備します。脚を近位と遠位領域を円周にスクラブします。この手順を 3 回繰り返します。
    5. ネズミの両眼に目の潤滑剤を塗布します。ラットに体温(37°C)と正常なバイタルサインがあることを確認してください。直腸温度プローブモニターに接続された加熱パッドを使用して、体温を監視および調整します。
  2. 手術
    1. 1.5%-3%でイオブルランをオンにします(メンテナンス)。つま先ピンチ、呼吸数、および性格への反応を含む麻酔深さを監視します。適切な麻酔面を維持するために、必要に応じてイオブルランの速度を調整します。
      注:麻酔下で呼吸速度は毎分50〜100呼吸の間でなければなりません。深く、まれな呼吸は、ラットがあまりにも深く麻酔されていることを示す。
    2. 無菌の器具パックとドレープを開き、無菌手袋を着用してください。手順の持続時間を通して無菌性を維持するように注意してください。必要な基本的な滅菌手術器具は、メスの刃のホールダー、鉗子、止止め、針のホールダー、はさみおよび傷のクリップの付け器を含んでいる。
    3. 無菌手術ドレープの通気孔を通してラットの脚を引っ張ります。動物がつま先ピンチ反射を介して麻酔の十分な平面にあることを確認してください。
    4. メスの刃または外科用はさみを使用して、周回、皮膚切開をちょうど凝縮(膝関節)に近い。
    5. 後肢の後肢をガーゼまたは鈍い解剖を使用して、後肢の腹側内側表面に大腿動脈および静脈を露出する。
    6. 大腿骨中のレベルで4-0吸収性縫合糸を使用して血管をリゲートし、遠方に経転します。
    7. 筋肉解離中の漏れを減らすために静脈を遠位にクランプします。
      注:周筋は、大腿骨からcoxofemoral関節のレベルに上昇した大腿動脈血管結紮および筋肉のレベルに遠位します。
    8. 鈍い解剖を使用して、股関節を外側の外側の回転で外向きに誘拐する。
    9. 大腿骨の頭部を見つけ、アセタブラムからそれを分離します。脚を体に取り付けたまま残りの組織を切る。
    10. 約6mg / kgロピバカインでアセタブラムと坐骨神経にスプラッシュブロックを与えます。
    11. 単純な中断された縫合糸(4-0、吸収可能な縫合)を使用して、アセタブラムの上の筋肉を閉じます。
      注:追加の0.5%ブピバカインまたはリドカイン(0.15-0.2 mgの合計)は、閉じた筋肉層(局所浸潤/スプラッシュブロック)に沿っていくつかの部位に注入することができます。
    12. 5~10mmごとに巻きクリップを使用して、皮膚の端に対して閉じます。
  3. 回復
    1. ケージの下に置かれた加熱パッドを使用して、熱サポートできれいな回復ケージにラットを置きます。
      注:温熱を防ぐために、加熱パッドは、動物と直接接触しないようにし、40°Cを超えてはならない。
    2. 完全に回復し、規範的になるまで動物を監視します(37.5-39 °C)。
      注:動物は完全に意識し、厳格にリカンベントし、ケージの周りに簡単に移動するまで、放置してはなりません。
    3. 完全に目を覚ました後, 移動, よく呼吸, ブプレノルフィンでラットを注入 (1.0-1.2 mg/kg SC).
      注: 麻酔ラットにブプレノルフィンを与えることは、回復を損なう可能性があります。
    4. 肩甲骨の間に10mLの温かい授乳リンガーの溶液を皮下に投与する。
    5. ラットをクリーンケージに戻し、同じ特異性を持って再会します。
    6. 次の月に向けて、毛細開き、腰痛の姿勢、欠当や切開部位感染の兆候(紅斑、膿性放電、創傷脱菌など)の兆候について、すべての動物を1日2回監視します。
      注:これまでに、どの動物でも術後の回復後の臨床徴候(感染症など)は観察されていません。1つのラットだけが縫合糸で脱ヒスジェンスを持ち、その後、創傷クリップを使用してそれ以上の問題なく傷を閉じた。
    7. ブプレノルフィンまたはメロキシカムを、検査動物獣医師と相談して公開された用量で痛みの臨床徴候を呈する動物に投与する。
    8. 抗生物質(すなわち、セファロスポリン)を、臨床徴候を発表された用量で発表された動物動物獣医師と相談して行う動物に投与する。
      注:鎮痛薬で改善しない痛みや苦痛の長引く兆候を示す動物や、抗生物質に反応しない感染の兆候を示す動物は、人道的に安楽死させる必要があります。

6. X線によるイメージング

  1. 腫瘍移植後、ティビアスと肺を非侵襲的に画像化し、げっ歯類用に設計された機械でX線を使用して腫瘍の成長を検出します。
  2. ラットを以前に行ったように麻酔します。
  3. 25 kVで6 sの3倍の倍率で画像を撮ります。
  4. X線処理装置を使用してフィルムを処理します。X線写真もデジタルスキャンが可能です。

7. 壊死手順

  1. CO2でラットを安楽死させる。心拍の欠如によって死を確認し、血清または血漿サンプルのために心臓から3mLの血液をすぐに引き出す。
  2. 検査のために胸部と腹部を開きます。
  3. 気管を分離し、カテーテル(18G)でカニューレートします。気管のカテーテルを固定するには、両方の気管の周りに絹の縫合糸をカテーテルで結びます。
  4. 注入カテーテルを3 mLまたは5mLのシリンジに接続します。ホルマリンまたは生理学を注入して、より良い占星術標本のために肺葉を穏やかに膨らませる。注入では、肺が膨らみ、肺転移のより良い視覚化を可能にする。
  5. 検査、解剖、およびすべての選択された胸部および腹部の器官(肝臓、腎臓など)を計量する。
  6. 組織病理学のためにホルマリンの器官を固定するか、ドライアイス、2-メチルブタン、または液体窒素に凍結します。
  7. ウェスタンブロットを用いたタンパク質発現の評価のために、凍結組織のライセートを作る。ラット組織と反応する抗体は、詳細13.

8. 免疫染色化学

  1. 一次OS組織を処理し、パラフィンに埋め込み、免疫組織染色のためにそれを切除する。
  2. クエン酸緩衝液(pH 6.0)を用いて脱パラフィン化後の抗原を取り出す。0.3% H 2O2でメタノール中で30分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼをクエンチする。
  3. 通常の血清を使用して、5 μmの厚いパラフィンセクションをブロックします。
  4. 一次抗CD68およびCD3抗体(表を参照)を4°Cで一晩インキュベートする。
  5. PBSでセクションをリンスし、検出キットを使用してHRPポリマーにインキュベートします。
    注:免疫染色は、染色体としてジアミノベンジジンで開発されました。

9. ウェスタンブロッティング

  1. UMR-106細胞を200〜300μLのリシスバッファー14 でリーゼし、標準的なゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングを行う。
  2. 4%~12%のビストリスゲルを使用してください。
  3. 抗エルブB2、抗エルブB4、抗EGFR、抗ERK、β-アクチンまたは抗マウスβ2-AR一次抗体(表参照)および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体。
  4. 化学発光基質を追加します。膜をX線フィルムに露出させる。
    注: βアクチンレベルは、ロードコントロールとして使用されます。

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結果

免疫担当SDアウトブレッドラットは、無傷の免疫系を持つ動物モデルを提供するこれらのOS研究に使用されます。我々は、ATCCのUMR106細胞株を使用し、最初はSDラットからOSから単離された細胞から開発した。細胞をSDラットに移植し、OSの同系モデルを提供し、UMR106細胞を3週齢の男性および女性SDラットの脛骨に移植し、小児OSモデルをシミュレートする。さらに、UMR106細胞の直属形移植は、脛骨の転移/糖尿病に直接、関連する腫瘍微小環境を与える。

腫瘍細胞を移植する場合、針先端を骨の中央腔に約10mm伸ばす正しい角度(骨シャフトに平行)で脛骨台を通して正しく針を挿入しなければならない。この手順では、ラットの95%(52/55)が膝に遠位のチビアスで腫瘍を発症した。脛部注射の経験では、ラットの100%が腫瘍を発症した。切断されなかったラット群では、男性の平均腫瘍容積は3週で504mm3、移植後5週間で1195mm3であった。女性では、腫瘍容積...

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ディスカッション

OS脛骨インプラントを有するラットは、移植後3週間で測定可能な腫瘍を発症する。腫瘍を有する肢が移植後3週間切断された場合、肺転移の発生率は有意に減少する。オスは骨分解性と骨芽細胞の両方です。切断されていないラットは、複数かつ可変的な大きさの肺転移を発症し、X線撮影によって、または移植後7週間までに壊死で観察される。EGFR、ErbB2、およびErbB4は、ヒトOS16、17、18と同様に、ラットUMR106 OSで発現される。CD3 T細胞およびマクロファージは、免疫細胞化学法により容易にOSで検出される。頸静脈注射は、OS患者に与えられる薬物であるドキソルビシンの化学療法の送達のために尾静脈に好まれる。ここで説明する方法は、完全なcoxofemoral切断です。この手順は、改良であり、患者8の切り株を残して骨が切断される腫瘍除去外科方法(大腿骨骨切除術)を置き換えると考えることができる。この研究は、手術...

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開示事項

申告する開示はありません。

謝辞

国立がん研究所を通じたNIHの資金調達、助成金#CA228582。石山俊は、東レメディカル(株)から助成金を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AKT細胞シグナル伝達技術4685S
吸収性縫合EthiconJ214H
β-アクチンサンタクルスバイオテクノロジーsc-47778
β2-AR抗体SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-569&betaに置き換えました。2-AR(E-3):sc-271322
Bis–トリスゲルサーモフィッシャーNP0321PK2
ブプレノルフィン SR ラボZooPharmIZ-70000-201908
CD3 抗体Dako#A0452
CD68 抗体eBioscience#14-0688-82
化学発光基質cytivaRPN2232
CL-Xposureフィルムサーモフィッシャー34089
完全な麻酔システムEVETEQUIP922120
ジアミノベンジジンVECTOR LABORATORIESSK-4100
ドキソルビシンActavisNDC 45963-733-60
EGFR 抗体サンタクルス バイオテクノロジーsc-03EGFR (A-10) に置き換えられました: sc-373746
ERBB2 抗体サンタ クルス バイオテクノロジーsc-284Neu(3B5)で置き換えられました:sc-33684
ERBB4抗体SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-283ErbB4(C-7)で置き換えられました:sc-8050
ERK抗体SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-514302
目の潤滑剤PHARMADERMNDC 0462-0211-38
Hamiltonシリンジ(100 & micro;L)HamiltonModel 1710 SN SYR
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体cytivaNA934
HRP ポリマー検出キットVECTOR LABORATORIESMP-7401
HRP ポリマー検出キットVECTOR LABORATORIESMP-7402
イソフルランBUTLER SCHEINNDC 11695-6776-2
イソフルラン気化器EVETEQUIP911103
UMR-106 セルATCCCRL-1661
X 線FaxitronUltraFocus
X 線プロセッサHope X-Ray Peoducts IncMicroMax X 線プロセッサHope プロセッサはもう米国では利用できません
傷口クリップBECTON DICKINSON427631
糸を

参考文献

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