我々は、胚および成体マウス舌の上皮および間線質/結合組織から大量の高品質単一細胞を解離するための一般化されたプロトコルを開発した。
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この記事について
サマリー
要約
細胞解離は、個々の細胞レベルおよび/または細胞集団レベル(例えば、単一細胞RNAシーケンシングおよび一次細胞培養)での研究に不可欠な手順であった。大量に生存可能で健康な細胞を産出することは重要であり、そのために最適な条件は組織依存である。舌上皮および基礎となる間質/結合組織における細胞集団は異種であり、組織構造は異なる領域および異なる発達段階で異なる。我々は、初期発達[胚性12.5日目(E12.5)]および若年成人(8週間)段階でマウス舌上皮および間葉/結合組織から細胞を単離するためのプロトコルを試験した。上皮と下層の間質/結合組織との間のきれいな分離は容易に達成した。しかし、さらに細胞を処理して単離するには、生存可能な健康細胞を大量に生成し、酵素消化バッファー、インキュベーション時間、遠心分離の速度と時間を慎重に選択することが重要です。分離した上皮または基になる間葉系/結合組織を37°Cで30分間0.25%トリプシン-EDTAでインキュベーションし、続いて200xgで8分間遠心し、高い生存率(>90%)で細胞の高収率をもたらしたマウスのステージと舌の領域に関係なく。さらに、胚性および成体の舌からの解離された上皮および間葉/結合組織細胞の両方が、細胞生存率の有意な減少なしに少なくとも3時間細胞培養ベースの培地で生存できることを発見した。このプロトコルは、初期発達(E12.5)および若年成人(8週間)段階で異なる組織コンパートメントからの細胞解離を必要とするマウス舌からの単離細胞の調製を必要とする研究に有用である。
概要
哺乳類の舌は、味、話す、および食品処理に不可欠な複雑な器官である。それは間葉/結合組織によって区分され、味乳頭および味覚芽を含む階層化された上皮シートによって覆われる高度に組織化された組織の複数のタイプで構成される。舌上皮と間質/結合組織の両方の細胞集団は不均一である。舌の特定のタイプの細胞の機能と分布をよりよく理解するためには、解き分け細胞を用いた研究が必要である。例えば、単一細胞RNAシーケンシングは、個々の細胞における転写プロファイリングのための強力かつハイスループットな方法であり、単一細胞分解能1、2、3、4における複雑な組織の転写物を理解するように設計されている。一次細胞培養は、味覚芽5,6の幹細胞/前駆細胞の機能と分化を研究するのに有用なツールであることが証明されている。これらの研究は、大量の高品質の単離された細胞集団(例えば、適切な濃度および高い生存率を有する十分な総細胞数)を必要とする。
したがって、言語組織の異なる領域から、異なる発達段階で細胞を分離する必要があります。現在、舌上皮および基礎となる間質/結合組織からの細胞解離に利用できる詳細なプロトコルはない。ここでは、単一細胞RNAシーケンシングや一次幹細胞培養など、高い品質の生細胞を必要とする実験のために細胞を調製するための最適化された細胞解離方法を報告する。我々は、酵素消化バッファー、穏やかなピペット、再懸濁培地の選択、および最適な遠心分離時間と速度の選択は、これらの大量の高品質の細胞を生成するために重要であることを発見しました。
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プロトコル
動物の使用(研究を通じてC57BL / 6マウス)は、ジョージア大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認され、研究のための動物のケアと使用のための国立健康ガイドライン研究所に従っていました。
1. 動物の使用
注:マウスは、ジョージア大学動物酪農科学科の動物施設で、12時間/夜間サイクルの下で22°Cで飼育および維持しました。
- マウスにおける膣プラグ検出の日の正午を胚(E)日0.5として指定する。E12.5で胚を使用し、生後マウスを生後8週で以下の実験に使用する。
2. 実験前の準備
注: このプロトコルに必要なインストゥルメントは、 資料一覧に記載されています。
- 実験前のオートクレーブ楽器。実験中にビーズ滅菌器を使用して器具を殺菌します。
- 70%エタノールワイプを使用して、外科領域、解剖顕微鏡、およびバイオセーフティキャビネットを洗浄します。バイオセーフティキャビネットのUVライトをオンにし、実験手順の前に20分間オンにします。
- 1:1ディスパーゼ(5.0 mg/mL)とコラゲナーゼ(2.0 mg/mL)の酵素混合物を最終濃度2.5と1.0mg/mLにそれぞれ調製し、0.22 μmシリンジフィルター7を使用して溶液をフィルター処理します。
- 成人の舌に対して1 mL、または特定の舌の領域(例えば、後部、または前舌)に対して0.5mLの酵素混合物を調製する。
- 胚性舌用酵素混合物2 mLを調製する。
- 0.1 M PBS で 2.5% BSA の 10 mL を作り、1 mL シリンジと 0.22 μm シリンジフィルターを使用して溶液をフィルターします。
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結果
基礎間質/結合組織からの舌上皮の分離
胚性マウス舌では、適切な酵素消化後に上皮下腔の隙間が見える。一部の舌の上皮シートは、インキュベーション中に機械的な力なしで分離されます。
成人マウス舌では、注入された領域の腫脹(図1B2)によって酵素注射が成功したことを示しており、これは、酵素が舌によって保持され得ことを示唆している。間葉系および/または舌上皮の針による浸透への酵素および/または深部注射が不十分な場合、注射領域の部分的な腫脹を誘発するか、全く腫脹を起こさない。酵素消化後、適切な酵素消化を有する根底にある結合組織が緩んで粘着性になる。上皮シートの端を穏やかに持ち上げると、上皮下空間の隙間が見える。
細胞の解離が細胞総数と生存率に及ぼす影響
ステップ4では、E12.5舌、上皮シート、および舌の上皮のすぐ下に間質の薄い層がそれぞれプール...
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ディスカッション
現在までに、舌上皮および基礎となる間質/結合組織からの細胞解離に関する詳細なプロトコルは利用できていない。この現在の細胞解離プロトコルは、高い細胞生存率(>90%)を有する単一細胞懸濁液を生成する再現可能な手順を提供するE12.5と成体マウスからの単離された細胞が異なるにもかかわらず、胚および出生後の両方の段階で上皮シートおよび間葉/結合組織を含むマウスの舌組織から。例えば、E12.5マウス舌の上皮および間質から単離された細胞は、8週齢のマウス舌からの細胞の大きな変動(小さいから大きいものまで)とは対照的に、一貫しており、小さい。高い生存率(>90%)の利点を有する単離された細胞の、得られた単一細胞懸濁液は、生存細胞の高品質を必要とする下流実験を容易にすることができる(例えば、単一細胞RNAシーケンシングおよび一次細胞培養)。
細胞の高い生存率を保証するためには、いくつかの重要な要因に注意が払われなければなりません。ディスパーゼとコラゲナーゼ混合物を用いた適切な消化時間は、生存細胞を維持しながら、効果的に間葉/下層の結合組織から上皮を分離することができます。胚舌の20分インキュベー...
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所、助成番号R01DC012308、R21DC018089によってHXLに支援されました。ブレット・マーシャル(ジョージア大学、アテネ、GA)とエゴン・ランヒニ(10X GENOMICS、プレザントン、CA)に感謝し、細胞解離に関する技術支援と相談を行いました。フランシスカ・ギブソン・バーンリー(ジョージア大学、アテネ、ジョージア州)に英語編集。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| 培養ディッシュ(直径35 mm) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| カルチャーディッシュ(直径100 mm) | GeneseeScientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting はさみ (Student Fine Scissors) | 科学ツールを探す | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine sersps (Dumount #3 Forceps) | 科学ツールを探す | 11293-00 | |
| 血球計算盤 | ハウサーサイエンティフィック | 3520 | |
| 倒立顕微鏡 イメージングシステム (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| 低保持ピペットチップ | メトラー・トレド | 17014342 | |
| ミニハサミ (Evo Spring Scissors) | ファインサイエンスツール | 15800-01 | |
| プラスチックワープ | VWR | 46610-056 | |
| スパチュラ (モリア・スプーン) | ファイン サイエンス ツール | 10321-08 | |
| 外科用鉗子 (デュマウント #2 椎弓切除用鉗子) | ファイン サイエンス ツール | 11223-20 | |
| トリパン ブルー | ギブコ | 15250061 | |
| タイロード | Σ-Aldrich | T2145-10L | Tyrode 塩 |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | M PBS |
| 0.22-μmシリンジフィルター | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-243 | |
| 70%エタノール | Koptec | 233919 | 100%エタノール |
| 1mLシリンジ | BD | 8194938 | |
| 5mL低結合マイクロ遠心チューブ | エッペンドルフ | 30122348 | |
| 30-G ニードル | BD | 9193532 | |
| 35-μm細胞ストレーナー | Falcon | 64750 | |
| 70-μMセルストレーナー | Falcon | 64752 |
参考文献
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367(2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
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再版と許可
