ここでは、幼虫および若年期までの生体内でゼブラフィッシュ胚性脳を画像化する方法を提示する。この微侵襲的な手順は、電気生理学的アプローチから適応され、成熟したニューロンの細胞および細胞内の詳細へのアクセスを提供し、脳機能および薬物介入を特徴付けるための光遺伝学および神経薬理学的研究と組み合わせることができる。
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この記事について
サマリー
要約
脳の発達と成熟の間に起こる一時的な変化を理解するには、細胞および細胞内解像度での空間と時間における詳細な高解像度イメージングが必要です。分子および画像技術の進歩により、透明ゼブラフィッシュ胚における脳の発達の細胞および分子メカニズムに関する多くの詳細な洞察を得ることができています。最近では、受精の数週間後に起こる神経細胞の結合性の改善プロセスは、例えば社会的行動、意思決定、動機づけによる行動の制御など、研究の焦点に移っています。これらの段階では、ゼブラフィッシュ皮膚の色素沈着は、脳組織への光の浸透を妨げ、胚性段階の溶液、例えば、色素沈着の薬理学的阻害は、もはや実現不可能である。
従って、目覚めたゼブラフィッシュの脳への顕微鏡アクセスのための低侵襲外科的解決は、電気生理学的アプローチに由来する提供される。テレオストでは、皮膚および柔らかい頭蓋骨軟骨は、これらの層をマイクロ剥離することによって慎重に除去することができ、根底にあるニューロンおよび軸索管を損傷することなく露出させる。これにより、シナプス構造とその分子内容を含む神経形態、およびCa2+ 過渡性または細胞内輸送事象などの生理学的変化の観察を記録することができます。さらに、薬理学的阻害または光遺伝学的操作によってこれらのプロセスの尋問が可能である。この脳暴露アプローチは、ニューロンの構造的および生理学的変化に関する情報だけでなく、分または時間の範囲で生きている脳組織におけるこれらの事象の相関関係および相互依存性に関する情報を提供する。この技術は、受精後30日までのゼブラフィッシュ幼虫のインビボ脳イメージングに適している、これまでにテストされた最新の発達段階。したがって、シナプスの洗練とスケーリング、軸索および樹状輸送、細胞骨格貨物のシナプスターゲティング、または局所活動依存式などの重要な質問へのアクセスを提供します。したがって、この取り付けおよびイメージングアプローチの幅広い使用が期待できます。
概要
ここ数十年、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、胚性および幼虫発生研究のための最も人気のある脊椎動物モデル生物の一つとして進化してきました。初期胚発生期の胚の急速な 元子宮 の発達とその透明性と相まってゼブラフィッシュメスの大きな胎児性は、ゼブラフィッシュを発達の問題を和らげるための強力なモデル生物にする重要な要因のほんの一部である1。分子遺伝学的技術の進歩と高分解能 インビボ イメージング研究を組み合わせることで、発達過程の基礎となる細胞生物学的メカニズムに対処することが可能となった2.特に、神経細胞の分化、生理、接続性、機能の分野において、ゼブラフィッシュは、分子動力学、脳機能、および生物的挙動の相互作用をこれまでにない詳細に明示しています。
しかし、これらの研究のほとんどは、神経系組織の透明性が徐々に失われるため、発達の最初の週の間に胚および初期の幼虫段階に限定されている。これらの段階では、脳組織は、頭蓋骨の分化と色素沈着によって遮蔽される高分解能顕微鏡アプローチによってアクセスを妨げられる。
したがって、神経の分化、成熟、および神経の結合性の改良やシナプススケーリングなどの可塑性の主要な問題は研究が困難である....
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プロトコル
ここに記載されているすべての動物の仕事は、法的規制(EU指令2010/63)に従っています。魚の維持と取り扱いは、地元当局と技術大学ブラウンシュヴァイクの動物福祉代表によって承認されています。
1. 人工脳脊髄液(ACSF)、低融解アガロース、鋭いガラス針の調製
- 蒸留水中の以下の濃度で記載された化学物質を溶解することによってACSFを準備します。134 mM NaCl (58.44 g/mol), 2.9 mM KCl (74.55 g/mol), 2.1 mM CaCl2 (110.99 g/mol), 1.2 m M MgCl2 6x H2O (203.3 g/mol), 10 mM HEPES (238.31 g/mol), および 10 mM d-グルコース (180.16 g/mol).
注: MgCl2、CaCl2、および KCl の場合、1 M ストック溶液は脱塩された無菌水で調製され、その後新しい ACSF を準備するために 4 °C で保管されます。グルコース、HEPES、およびNaClは、新鮮なACSF溶液中で固体化合物として溶解される。化学物質を溶解するには、製造元の指示に従ってください。 - ACSF の pH を 10 M NaOH で 7.8 に調整します。ACSFの調製には、脳脊髄液を置き換え、ニ....
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結果
図3A、C トランスジェニックラインTg[-7.5Ca8:GFP] の14 dpf幼虫を示すbz12[15] 頭蓋骨はまだそのままです。重ね合わせの皮膚の色素細胞は頭全体に分布し、対象領域(ここでは小脳)における蛍光シグナルに干渉している。この状態では、この状態では、脳の高解像度画像を得ることは不可能です。 図 3B 開いた頭蓋骨手術を行った後に同じトランスジェニックラインの幼虫を示す。励起レーザーのために興味のある領域は自由にアクセス可能であり、蛍光光を発して散乱して反射することなく組織に浸透する。この幼虫の写真は、詳細な高解像度画像をもたらすでしょう(図3D)、単離された脳の画像と同等であるが、脳がまだ完全に活動しているという利点を有する。さらに、脳は、固定され、植え.......
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ディスカッション
提示された方法は、脳の単離またはそれらの インビボ 環境でニューロンの高解像度画像を記録するための色素沈着を阻害する医薬品とゼブラフィッシュ幼虫の治療に代わるアプローチを提供する。この方法で記録された画像の品質は、自然な条件下で、植えられた脳からの画像に匹敵します。
さらに、固定剤18での治療は必要としないため、蛍光強度の低下は回避される。また、この方法は脳を単離するほど侵襲的ではなく、失敗につながる可能性のある重要なステップの1つだけで構成されているので、成功した準備の可能性は脳の排泄物に比べて高くなります。最も重要な利点は、この方法がin vivo画像記録に適していることである。頭蓋骨の開口部が正確に、速く、成功し、ACSFの酸素飽和が定期的に監視されるならば、脳は完全に機能し、何時間も実行可能でなければならない。電気生理学的記録、血液循環、呼吸、および魚の生存に基づいて、皮膚および頭蓋骨の除去は全体的な健康に大きく有害ではない可能性が高いと考えています。このように、この方法は、画像を乱す色素沈.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
特に、ティモ・フリッチの優れた動物ケアとヘルマン・ドーリング、モハメド・エルザイ、ソル・ポーズ・メンデス、ヤコブ・フォン・トロサ、コマリ・ヴァリシェッティ、バーバラ・ウィンターの皆様の支援に感謝します。また、Kösterラボの他のすべてのメンバーの皆様のフィードバックに感謝しています。このプロジェクトの一部は、ドイツ研究財団(DFG、KO1949/7-2)プロジェクト241961032(RWK)とブンデスミニウム・フュル・ビルドゥン・ウント・フォルシュン(BMBF;エラネットニューロンII CIPRESSプロジェクト01EW1520にJCM)が認められる。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 塩化カルシウム | Roth | A119.1 | |
| 共焦点レーザー走査型顕微鏡 | ライカ | TCS SP8 | |
| d-グルコース | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| ガラス キャピラリー タイプ 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| ガラス キャピラリー タイプ 2 | ハーバード装置 | GC100F-10 | |
| ガラスカバースリップ | deltalab D102424 | ||
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| イメージングチャンバー | Ibidi | 81156 | |
| 塩化カリウム | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| 塩化マグネシウム(六水和物) | Roth | A537.4 | |
| 顕微鏡カメラ | ライカ | DFC9000 GTC | |
| ニードルプラー 1型 | ナリシゲ | PC-10 | |
| ニードルプラー 2型 | サッター器具 | P-2000 | |
| パスツールピペット 3ml | A.ハルテンシュタイン | 20170718 | |
| 塩化ナトリウム | Roth | P029.2 | |
| 酸化ナトリウム | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mmシャーシャー | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mmシャーシャー | Sarstedt | 821473001 |
参考文献
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2....
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