このプロトコルは、クロマチン上に凝縮物を作製する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを示す。 化学二量体を用いたテロメア上の前骨髄性白血病(PML)核体の形成が実証されている。液滴の成長、溶解、局在化および組成物は、生細胞イメージング、免疫蛍光(IF)および蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)でモニタリングする。
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この記事について
サマリー
要約
クロマチン関連凝縮物は多くの核プロセスに関与しているが、根本的なメカニズムは依然として不可解である。このプロトコルは、テロメア上に凝縮物を作成するための化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを記述する。化学二量体は、それぞれタンパク質に結合できる2つの結合リガンドで構成されています: ハローリガンドからハロエンス酵素への結合とトリメトプリム (TMP) 大 腸菌 ジヒドロホウ酸還元酵素 (eDHFR) それぞれ).Halo酵素をテロメアタンパク質に融合させ、共有化Haloリガンド-酵素結合を介して二量体をテロメアに固定します。TMPとeDHFRの結合は、eDHFR融合相分離タンパク質をテロメアに採用し、凝縮物形成を誘導する。TMP-eDHFR相互作用は非共有化であるため、過剰なフリーTMPを使用してeDHFR結合のための二量体剤と競合することにより結露を逆転させることができる。テロメア上に前骨髄性白血病(PML)核体形成を誘導し、凝縮物の成長、溶解、局在化および組成物を決定する例が示される。この方法は、局所クロマチンに直接結合するタンパク質またはガイドRNAを用いてゲノム遺伝子座に標的とされるdCas9にHaloを融合させることにより、他のゲノム位置で凝縮物を誘導するように容易に適応することができる。生化学的アッセイのための細胞集団における相分離を維持しながら、単一細胞の生画像化に必要な時間分解能を提供することにより、クロマチン関連凝縮物の形成と機能の両方を調査するのに適しています。
概要
多くのタンパク質および核酸は、液体-液相分離(LLPS)を受け、生体分子凝縮物に自己集合して細胞1,2の生化学を組織する。クロマチン結合タンパク質のLLPSは、特異的ゲノム遺伝子座に関連する縮合物の形成を導き、様々な局所クロマチン機能3に関与している。例えば、HP1タンパク質のLLPSは、ゲノム4、5、転写因子のLLPSが転写センターを形成して転写センターを形成し、新生mRNAのLLPSおよび多セックスコームタンパク質がヒストン軌跡体を生成してヒストンmRNAの転写および処理を調節するヘテロクロマチンドメインの形成を基礎とする。 しかし、クロマチン関連凝縮物の多くの例が発見されているにもかかわらず、凝縮物形成、調節および機能の基礎的なメカニズムは依然として十分に理解されていない。特に、LLPSを介してすべてのクロマチン関連凝縮物が形成されるわけではないが、生細胞における凝縮物形成の慎重な評価は依然として8,9が必要である。例えば、マウスにおけ....
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プロトコル
1. 過渡細胞株の製造
- 培養U2OSアクセプター細胞は、22 x 22 mmガラスカバーリップ(ライブイメージング用)または直径12mmの円形カバーリップ(IFまたはFISH用)でポリDリジンを6ウェルプレートにコーティングし、成長培地(10%のウシウシ血清およびDMEMのペニシリン・ストレプトマイシン溶液)に達するまで
- トランスフェクション前に1 mLトランスフェクション培地(ペニシリンストレプトマイシン溶液を使用しない成長培地)に置換します。
- トランスフェクションウェルごとに、4 μL のトランスフェクション試薬を 150 μL 減らされた血清培地に加え、ボルテックスを 10 秒間加え、5 分間インキュベートします。
- 各ウェルに対して、ハローコンストラクトプラスミド(Halo-GFP-TRF1またはHalo-TRF1)を加え、eDHFRコンストラクトプラスミド(mCherry-eDHFR-SIMまたはmCherry-eDHFR-SIM変異体)を1:1質量比(0.5 μgのハロー構築物プラスミドを有する0.5 μg eDHFRコンストラクトプラミド)から150μLに低下させた、滴下し、滴下し、滴下した
注:タグは比較的小さく(Halo 33 kD、eDHFR 28 kD、mCherry 30 kD、eGFP 27 kD)、相分離に影響は認められなかった。ただし、ここで使用するSIM変異体などの変異体を使用して、....
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結果
テロメアDNA FISHおよびSUMOタンパク質IFによって同定されたSUMOのテロメラ局在化の代表的な画像を 図2に示す。SIM採用を有する細胞は、SIM変異体採用を有する細胞と比較して、テロメア上のSUMO1およびSUMO 2/3を豊かにした。これは、SIM二量体化誘導によるテロメアのSUMO濃縮がSUMO-SIM相互作用に依存することを示している。
二量体化後のTRF1とSIMの代表的なタイムラプス映画を ビデオ1に示します。4 つの時点のスナップショットを 図 3Aに示します。SIMはテロメアに採用され、液滴の形成と成長が予測されるように、SIMとTRF1の両方の病巣が大きくなり、明るくなりました(図1B)。また、TRF1病巣の融合が観察された(図3B)、テロメア数の減少(
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ディスカッション
このプロトコルは、化学二量体化システムを用いたテロメア上の凝縮物の形成と溶解を実証した。相分離および液滴融合誘発テロメアクラスタリングのキネティクスは、ライブイメージングで監視されます。凝縮物の局在および組成は、DNA FISHおよびプロテインIFで決定される。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。1つ目は、タンパク質および二量体濃度を決定することです。ゲノム遺伝子座で局所相分離を誘導することに成功することは、相分離のための重要な濃度を上回る相分離タンパク質の局所濃度の増加に依存する(図 1B).相分離タンパク質のグローバル濃度は、局所的に濃縮するのに十分なタンパク質が存在するように十分に高くする必要があります。相分離タンパク質の濃度は高すぎないので、全地球相分離が発生したり、容易に誘導されたりする可能性があります。 アンカーDNAの長さ(またはアンカータンパク質が結合する修飾クロマチンのサイズ)とHalo融合アンカータンパク質の濃度は、最大二量体化効率で核形成中心のサイズを決定します。アンカーサイズが大きい.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、米国国立衛生研究所(1K22CA23763201からH.Z.、GM118510からD.M.C.)、チャールズ・E・カウフマン財団からH.Z.に支援されました。著者たちは、原稿を校正してくれたジェイソン・トーンズに感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.25% トリプシン、0.1% EDTA in HBSS w/o カルシウム、マグネシウム、重炭酸ナトリウム | コーニング | MT25053CI | |
| 16% ホルムアルデヒド (w/v)、メタノールフリー | Thermo Scientific | 28906 | 1% in 1x PBS |
| 6 ウェル培養プレート | VWR | 10861-554 | |
| アルミホイル | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| 抗 mCherry 抗体 | アブカム | Ab183628 | |
| 抗 PML 抗体 | サンタ クルス | sc966 | |
| 抗 SUMO1 抗体 | アブカム | Ab32058 | |
| 抗 SUMO2/3 抗体 | 細胞骨格 | Asm23 | |
| ブロッキング試薬 | ロシュ | 11096176001 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTXチューブマイクロ1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| サークルカバースリップ | Thermo Scientific | 3350 | |
| 共焦点顕微鏡 | ニコン | MQS31000 | |
| DAPI | フィッシャーサイエンティフィック | D1306 | |
| ジメチルスルホキシド | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Na Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| ヤギ抗ウサギIgG(H + L)、組換え二次抗体、Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| 高精度ストレートテーパー超微細ポイントピンセット/鉗子 | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| レーザーマージモジュール | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| イメージングソフトウェアNIS-Elements | ニコン | ||
| Opti-MEM減量血清培地 | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x、pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| ピペットチップ | VWR | 10017 | |
| プレーンおよびつや消しクリップ コーナー顕微鏡スライド | フィッシャーサイエンティフィック | 22-037-246 | |
| ポリ-D-リジン溶液 | シグマ-アルドリッチ | A-003-E | |
| アジ化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP922I-500 | |
| スピニングディスク | 横河電機 | 用CSU-X1 | |
| スクエアカバースリップ | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Syntheized by Chenoweth lab | に応じて | |
| TNH | Syntherated by Chenoweth lab | に応じてご利用いただけます | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | に0.5%を調製 |
| E.V. Makayev研究室(南洋理工大学、シンガポール) | HTB-96 | ||
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
参考文献
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
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