方法論記事

糖尿病性創傷の加速治癒のためのドキシサイクリン装填されたコラーゲン-キトサン複合足場

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DOI：

10.3791/62184

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2021年8月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutics, JSS College of Pharmacy, JSS Academy of Higher Education & Research, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, North Dakota state university, 3Department of Pharmacology, JSS College of Pharmacy, JSS Academy of Higher Education & Research

この記事について

サマリー

調製されたDOX-CL足場は、機械的強度、多孔性、吸水性、分解速度、持続放出、抗菌、生体適合性、および抗炎症特性における理想的なDWドレッシングの前提条件を満たし、これは、DWの損傷した組織の回復に不可欠であると考えられる。

要約

糖尿病の大きな合併症の1つは糖尿病性創傷(DW)です。糖尿病の炎症の長期段階は、遅延創傷治癒につながる傷害のさらなる段階を妨げる。我々は、その報告された抗炎症特性と共に、その抗菌特性のために、選択の潜在的な薬物として、ドキシサイクリン(DOX)を選択した。現在の研究は、DOXに装填されたコラーゲンキトサン非架橋(NCL)および架橋(CL)足場を処方し、糖尿病状態での治癒能力を評価することを目的としています。足場の特徴付け結果は、DOX-CL足場が理想的な空隙率、低い腫脹及び分解率、およびDOXの持続的な放出をDOX-NCL足場と比較して保持することを明らかにする。 in vitro 研究は、DOX-CL足場がCL足場処理および対照群と比較して生体適合性および増強細胞増殖であることを明らかにした。抗菌研究は、DOX-CL足場がDWで見つかった最も一般的な細菌に対するCL足場よりも効果的であったことを示している。ストレプトゾトシンおよび高脂肪食誘導DWモデルを用いて、DOX-CL足場処理群における創傷収縮率が有意に(p≤0.05)より速く、CL足場処理および対照群のものと比較して観察された。DOX-CL足場の使用は、DWの局所治療のための有望なアプローチであることが証明できる。

概要

糖尿病(DM)は、体がインスリンを送達したり、単純な糖の異常な消化でその結果に反応しなかった場合に血糖値 1の上昇をもたらす状態である。DMの最も連続した破砕絡み合いは、糖尿病創傷(DW)である。DM患者のおよそ25%は、寿命 1でDWを構築する機会を持っています。DWの妨げ癒しはDMのトリオパシーに認定されている:免疫障害、血管障害、および神経障害。DWが治療を受けずに放置されると、壊疽の発症が生じ、その結果、関係する器官 2の除去を促す。

患者に指示するなど、多くの治療(創傷を毎日検査し、傷を浄化し、創傷に圧力をかける活動、定期的なグルコースモニタリングなどを避ける)、血糖値、創傷脱除剤、圧力オフロード、医療処置、高圧酸素療法、および高度な治療法を制御する。これらの薬の大半は、多因子性病態生理学的状態とこれらの薬に関連する予期せぬ費用に照らしてDWケアに不可欠なすべての前提条件に対処することができません5.DWの病因は多因子性であるが、不適当な組織管理を伴う持続的な炎症は、DW5,6における治癒遅延の実際の理由であると述べられている。

DWにおける炎症性および炎症促進メディエーターの増強レベルは、遅延創傷治癒を担う成長因子の減少をもたらす2,6.DWにおける不適切な細胞外マトリックス(ECM)形成は、形成されたECMの急速な分解に対して責任を負うマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)のレベルの増加に認定されています。MMPでは、MMP-9は、炎症の長期化および急速なECM劣化7を担う主要な仲介者として報告されている。MMP-9の上昇レベルを低下させる抗炎症薬による局所治療は、皮内恒常性を再確立し、フレームワークの配置およびDAW8、9のより良い治癒を促す。

ドキシサイクリン(DOX)は、MMP-9阻害剤であり、DW10、11、12における持続的な炎症を引き起こす主要な炎症性メディケーターであるMMP-9の上昇レベルを抑制するために選択された。さらに、DOXは、抗酸化剤(活性酸素種と結合し得る遊離ヒドロキシおよびフェノキシラジカルを産生する)13および抗アポトーシス(カスパーゼ発現およびミトコンドリア安定化を阻害する)14の活性を有する。DOX、コラーゲン(COL)、キトサン(CS)を含むフレームワークの配置を選択した。COLの選択は、機械的強度と組織再生15に必要なフレームワークを提供するのに役立つ方法に依存します。一方、CSは、構造的にグリコサミノグリカンに相同であり、いくつかの創傷治癒相と関連している。CSは重要な抗菌性を有する15を有することも報告されている。したがって、DOXのCOL/CS足場は、長時間の炎症を抑制するために処方され、続いてDM条件での創傷治癒に成功するためのマトリックス形成を支持する。

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プロトコル

実行されたすべての動物の手順は、JSS薬科大学の制度的動物倫理委員会によって承認されました, ウーティ, インド.

1. 凍結乾燥法によるDOX搭載多孔性足場の調製

  1. 100mLの水(例えば、ミリポア)に1.2gのCOLを加え、腫れのために脇に置きます。
  2. 腫れたCOL分散液を一晩2000rpmで撹拌し、COLの完全な溶解を確実にします。
  3. 1%酢酸の100 mLに約0.8gのCSを溶解して、CS溶液を調製します。
  4. CS溶液を2000rpmで一晩撹拌し、均一な分散を確保します。
  5. DOX(1%w/v)を混合し、CS溶液をコル溶液に混ぜ、30分間攪拌します。
  6. マスリン布を使用して得られた物理的な混合物をフィルタリングし、粒子状物質を除去します。
  7. 得られた濾液を-85°C±4°Cで約24時間凍結する。
  8. 深凍結混合物を-85°Cで4°C±72時間凍結乾燥させる。
  9. 得られた足場をデシケータに保管して、さらに分析するために16、17。

2. 足場の架橋

  1. 50mLの水にMES(0.488g)を溶かします。
  2. DOXの50mgを積んだ足場をMESバッファーの20 mLに30分間浸します。
  3. EDCの0.1264 gとNHSの0.014 gを別のビーカーに混ぜます。
  4. スキャフォールドをバッファ混合物に4時間浸漬し、架橋 16を達成する。
  5. さらに評価するために、DOX ロードされたクロスリンク (CL) と非クロスリンクスキャフォールド (NCL) を保管します。

3. 足場の特徴

  1. 走査型電子顕微鏡(SEM)を用いた形態学的検査
    1. SEM(1 cm × 1 cm 0.5 cm)を使用して形態解析のための足場×特徴付けます。
    2. スキャフォールドの断面と外面を金の繊細な層で染色します(〜150Å)。
    3. 5kVと10kVの励起電圧で写真画像をキャプチャします。
    4. サンプルをアルミニウムスタブに入れ、約9 Vの金で囲みます。
    5. 10 kV で解像度を上げた SEM を使用してスキャフォールドを測定します。
  2. 多孔性判定
    1. 液体変位法(エタノール )18を用いて足場の空隙率を測定する。
    2. 以下の式を使用して、足場の空隙率を計算します。
      figure-protocol-1
      Ww = 足場のウェットウェイト
      Wd = 足場の乾燥重量
      Wv = 足場の体積
  3. 吸水能力の決定
    1. 足場の乾燥重量を測定します。
    2. 37 °Cで秤量した足場をリン酸緩衝塩(PBS)pH 7.4で24時間インキュベートします。
    3. 濾紙を使用して、足場の上に余分なPBSを取り除きます。
    4. 以下の式 17を用いて吸水能力を測定する。
      figure-protocol-2
      WS = 吸水率
      W1=足場のウェットウェイト
      W0= 足場の乾燥重量
  4. 足場の劣化
    1. リソザイムを含むpH 7.4のPBSで、37°Cでスキャフォールド(1cm x 1cm)を7日間インキュベートする。
    2. 足場を洗って、表面に付着したイオンを取り除きます。
    3. 洗浄された足場 17を凍結乾燥する。
    4. 数式を使用して、劣化率を計算します。
      figure-protocol-3
      Ww = スキャフォールドの初期重量
      Wd = 凍結乾燥後の足場の重量
  5. インビトロ リリース研究
    1. 透析袋法を用いて、足場からのDOXの放出挙動を決定する。
    2. スキャフォールドを数ミリリットルの模擬創液(pH 7.4)に分散させ、透析袋に移します。
    3. 膜袋の端をしっかりと閉じ、500 mLの模擬創液液溶液に浸します。
    4. 透析袋を含む創傷液溶液を200~250rpmで攪拌します。
    5. 上清溶液を収集し、一定の時間間隔で同量の新鮮なバッファー溶液に置き換えます。
    6. 240 nmのUV可視分光計を使用して、上清溶液中の足場からのDOX放出の割合を決定します。

4. インビトロ 抗菌研究

  1. S.アウレウス、S.表皮、大腸菌、P.エルギノーサに対するCLおよびDOX-CL足場の最小阻害濃度(MIC)をマイクロブロス希釈法を用いて決定する。
  2. ミューラー・ヒントンスープを1:1000の比率で使用して細菌培養物を調製し、0.5マクファーランド濁度を得る。
  3. 高化のための細菌培養物にD-グルコース(800mg/dL)を加える19,20.
  4. DMSOでCLとDOX-CLを軽視し、可溶化する(陰性制御)。
  5. 高化した細菌懸濁液(100 μL)と試験サンプル(スキャフォールド溶液100 μL)を96ウェルプレートで連続して希釈します。
  6. プレートを37°Cで20〜24時間インキュベートします。
  7. 600 nm 21の波長で吸光度を記録します。

5. インビトロ 生体適合性試験

  1. MTT[(3-(4,5ジメチルチアゾール-2 yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化)アッセイを用いて、調製された足場の生体適合性を評価する。
  2. 標準的な次元の足場を殺菌し、24の井戸の版に置く。
  3. 24ウェルプレートに3T3-L1細胞を加え、72時間インキュベートする。

6. 生体内 動物研究

  1. DMおよび切除創の誘導
    1. 動物に2週間の高脂肪食を与え、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシン(STZ)(50mg/kg体重)を、2型糖尿病の誘導のためにウィスター・アルビノラット(180-200g)に腹腔内に投与する。
    2. 研究のための250 mg/dLの一定の血糖を持つ動物を選択してください。
    3. 切除創傷の誘導のために選択した動物をランダム化します。
    4. ジエチルエーテル(5mLを前飽和麻酔室に加えた)を用いて糖尿病ラットを麻酔し、つま先ピンチ法と粘膜色を用いて確認した。
    5. 無菌トリマーとブレード(A40)を使用して、後部領域(胸部、腰部領域)を剃ります。
    6. アルコール綿棒で剃った部分を殺菌する。
    7. 剃った区域の無菌の外科A40の刃と皮膚(2 x 2 cm2 および1mmの深さ)を切物にして開いた傷を作成する。
    8. 動物を3つの群(グループ1-疾病コントロール(対照)、グループ2-CL足場(プラセボ)、グループ3-DOX CL足場)に分け、各群は6匹のラットからなる。
    9. 外科テープを使用してCLとDOX CL足場を貼り付け、21日間無菌ガーゼでコントロールグループを覆います。
    10. 無菌のOHPシート上の創傷領域を追跡し、すべてのグループの0、7、14、および21日目のグリッド法を使用して創傷の減少率を測定します。
    11. 以下の公式を用いて創傷減少率を計算する。
      figure-protocol-4

7. 組織病理学的研究

  1. 7日目、14日目、21日目に治癒した創傷領域を分離し、ホルマリン溶液(10%)に保存する。
  2. ミクロトームを使用して組織を切り離し、6μmの厚さを得る。
  3. ガラススライドにセクションを取り付け、ヘマトキシリンとエオシン 17を使用して汚れを汚す。
  4. デジタル顕微鏡を使用して40倍の拡大率で画像をキャプチャします。

8. ヒドロキシプロリン推定

  1. 評価のために0、7、14、および21日目に治癒した創傷領域を分離する。
  2. Reddy G et al., 1996 22で説明した手順を用いてヒドロキシプロリン含有量を推定する。

9. エリサテスト

  1. メーカーの指示に従って、Elisaキットを使用してMMP-9レベルを推定します。
  2. 21日目に治癒した創傷領域から組織サンプルを分離し、組織ホモジナイザーを使用してミンチする。
  3. 得られたホモジネートを遠心分離し、上清を集める。
  4. アッセイバッファーを使用して上清を100倍に希釈します。
  5. 複数のプレートリーダーを使用してプレートをスキャンします。

10. 統計分析

  1. 取得した結果を平均± SD として表します。
  2. グラフパッドプリズムv5.01を使用して統計解析を実行します。
  3. 一方向分散分析 (ANOVA) と Dunnet のポストホック検定を使用して、統計的有意性を達成します。
  4. p≤0.05 を持つ値は重要であると考えてください。

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結果

DOX ロードされた NCL および CL スキャフォールドの特性
目視検査では、NCLとCL足場は色のクリームであることが判明した。また、両方の足場は、物理的に調べるとスポンジのように見え、硬く、弾力性があります。図 1に、NCL および CL スキャフォールドの SEM イメージを示します。この図から、分子間結合を形成して架橋した後の孔径の減少があったことが明らかであった。また、NCLおよびCL足場の空隙率はそれぞれ92.3±4.21および71.35±2.65であることが判明した。NCLおよびCL足場の吸水率は750±11.4%、492±8.66%であった。

さらに、生分解研究は、リソザイムを含むpH7.4の模擬創液中で7日間行われた。NCL足場は最初の3日間でより速い分解速度を示し、4日間連続してゆっくりと減少した。他方では、CL足場は、劣化の長期化率を示した。足場の架橋は、機械的特性およびネットワーク強度を増強し、その結果、劣化率が低下し、劣化に対する耐性が向上したことを示す...

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ディスカッション

本研究の主な目的は、ラットのDW治癒に対するDOX装填されたCOL-CS足場の効果を決定することであった。CLおよびNCLは、形態、腫脹指数、生体外放出動態、および生体適合性の観点から調製および評価した。

DOX ロードされた NCL および CL スキャフォールドの特性
準備された足場は、相互接続された細孔を有する多孔質であることが判明した。これらの相互接続された細孔は、増殖と移動のために細胞への酸素と栄養素の適切な拡散に役立つ多孔質、海綿状の性質を保証し、治癒を加速させる。ここで、細孔サイズは主に架橋に依存していた。足場を架橋すると、CSおよびCOLとのEDC/NHSによる強い分子内相互作用を形成し、足場の機械的強度を増加させることによって、孔サイズが減少した。

気孔率は、スポンジ支柱と体積の質量の関数である相対密度に依存しています。一般的に、架橋剤が支柱の位置を互いに近づけて変化させると足場体積の収縮が起こり、足場の緻密化を招く。しかし、カルボジイミド化学の場合、その独特のメカニズ...

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開示事項

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

謝辞

著者らはアシシュ・D・ワドワニ博士に感謝する。(インド・ウーティ薬学部薬学院薬学院薬学科薬学科助教授・部長)

著者らは、ニューデリーの大学および高等教育機関(DST-FIST)の科学技術インフラ改善基金である科学技術省が私たちの部門を支援してくれたことに感謝したいと考えています。

著者はまた、三十氏に感謝したいと思っています。Sとスリラムさん。ビデオ撮影で彼らのサポートのためのナルクラM.ファームの学生。

この研究は、JSS高等教育研究アカデミー(JSSAHER)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-エチル-(3-3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)Merck Millipore、ムンバイ、インドE7750
2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)Merck Millipore、ムンバイ、インド137074
3-(4,5ジメチルチアゾール-2イル)-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)サーモフィッシャー、ムンバイ、インドM6494
ディープフリーザーバーティクルLabline Instruments, Kochi, India
透析サックMerck Millipore, Mumbai, IndiaD6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da Doxycycline
Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, IndiaD9891
Elisa kitR&D SystemsRMP900
Escherichia coli (E. coli)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 2567
EthanolMerck Millipore, Mumbai, India100983
Lyophilizer-SZ042Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
メカニカルスターラー-RQ-122/DRemi laboratory instruments, Mumbai, India
中分子量 ChitosanSisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India18824
Microtome-RM2135Leica, U.K
マウス胚性線維芽細胞 (3T3-L1)National Centre for Cell Sciences, Pune, India
マルチプレートリーダー -Inifinte M200 ProTecanInstruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 2036
走査型電子顕微鏡(SEM)-S-4800日立製作所, インド
水酸化ナトリウム(NaOH)ペレットクォリゲンファインケミカル、ムンバイ、インドQ27815
黄色ブドウ球菌 (S. aureus)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)National Collection of Industrial Microorganisms, プネー、インドNCIM 5270
ストレプトゾトシン (STZ)Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., ムンバイ, インド14653
Type-1 rat CollagenSigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, IndiaC7661
紫外線–可視分光-1700島津製作
所

参考文献

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