方法論記事

同種の抗体を用いた二重標識免疫蛍光による宿主と病原体の相互作用の研究

DOI：

10.3791/62219

⸱

2021年7月10日

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1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここで、プロトコルは、宿主と病原体の相互作用を研究するために同じ種で生起される一次抗体を用いて二重標識免疫蛍光を行う方法を説明する。また、このプロトコルには、別の宿主からの第3の抗体を含むことができる。このアプローチは、任意の細胞型および病原体で行うことができる。

要約

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今日では、寄生虫と宿主の細胞相互作用を研究するために利用可能な幅広い分子ツールを見つけることが可能です。しかし、寄生虫の中で特定の細胞構造およびタンパク質を認識する商業的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を得るためにいくつかの制限がある。また、トリパノソマチドの標識に利用できる市販の抗体はほとんどありません。通常、寄生虫に対するポリクローナル抗体は、社内で調製され、同じ種で産生される他の抗体と組み合わせて使用することはより困難である可能性があります。ここで、プロトコルは、同じ種で育てられたポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用して、宿主細胞および病原体相互作用を研究するために二重標識免疫蛍光を行う方法を示す。二重標識免疫蛍光を達成するためには、まずマウスポリクローナル抗体をインキュベートし、次に二次マウスIgG抗体を任意の蛍光色に結合してインキュベーションに従うことは重要です。その後、次の二次抗体によって一次抗体の痕跡が認識されるのを防ぐために、追加のブロッキングステップが必要です。次に、マウスモノクローナル抗体とその特異的IgGサブクラス二次抗体を別のフルオロクロームに結合させ、適宜にサンプルに添加する。さらに、異なる種で上げられた第3の抗体を用いて三重標識免疫蛍光を行うことが可能である。また、核やアクチンなどの構造は、その後、それらの特定の化合物またはラベルで染色することができます。したがって、ここで提示されるこれらのアプローチは、一次抗体の供給源が限られている任意の細胞に対して調整することができる。

概要

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病原体と宿主細胞との相互作用を細胞レベルで研究するために、ウイルス、細菌、原虫などの異なるグループがほとんどの宿主細胞タイプ1,2,3,4に感染する可能性があるため、疾患の根本的な原因に関する必須情報を提供する。また、病原体の成長を遅らせるか阻害する可能性のある治療標的を開発し、同定するのにも役立ちます。生きた条件では、産生された抗体は自己成分、ウイルスからの抗原、細菌成分または製品、真菌、寄生虫、および他の人を認識する責任がある5。

このため、抗体は、主に細胞構造およびタンパク質の位置および機能を理解するために広く使用されているツールである。複数の抗体標識を用いたいくつかの研究は、追加のブロッキングステップが免疫局在の特異性に寄与することを示している。さらに、ほとんどの記載されたプロトコルは、同じ宿主種からの抗体を含む特定の商業的モノクローナル抗体を使用する6,7,8,9,10,11,12,13,14

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プロトコル

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1. 細胞培養と寄生虫培養

  1. 10% のヒートインを添加したRPMI培地中の25cm2細胞培養フラスコで、アメリカ型培養コレクション(CCL-7)からLLC-MK2(アカゲザル腎臓上皮)細胞を増殖させる 活性FBS(ウシ胎児血清)および抗生物質(100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を5%CO2 17で37°Cで活性化した。
  2. LLC-MK2細胞を以前のプロトコル18に従ってトリパノソーマ・クルジ(Y株)で感染させる。
  3. LLC-MK2感染細胞(5mL)の上清を15mLの細胞培養円錐遠心分離管と遠心分離機で500xgで10分間、22°Cで細胞デブリを下げる。37°Cでチューブを10分間保ち、トリポマスティゴテが上清まで泳がせます。
  4. 22°Cで15分間、2500 x gで新しい円錐形管と遠心分離機に上清を集めます。 上清を捨て、完全なRPMI培地中に寄生虫を含むペレットを再懸濁し、ノイバウアーチャンバー内の細胞を計数して細胞密度を決定します。

2. 免疫蛍光プロトコルの制御

メモ:一度固定すると、カバーリップを含むプレートを1x PBS(pH 7.2)で4....

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結果

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ここでは、トリパノソマチド中の特異的構造およびタンパク質を認識する市販の抗体の利用不能により抗体の供給源が制限される場合の免疫蛍光による宿主寄生虫相互作用を研究する方法を示す。

トリパノソマチドの中で、T.クルシは脊椎動物と無脊椎動物の宿主19の間の様々な発達段階を含む最も複雑なライフサイクルの1つを有する。T.クルジのライフサイクルの間、哺乳動物感染の初期段階で、メタサイクリックトリポマスチゴスは、寄生虫および脊椎動物宿主細胞19,20に存在する多種多様な分子を含むプロセスを通じて細胞に侵入する。これらのプロセスを研究するために、私たちの研究室では、T.クルーシ、T.ブルゼイ、リーシュマニアsp16、21

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ディスカッション

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ここでは、同じ宿主種の2つの異なる抗体を用いて 、トリパノソーマ・クルジ 感染細胞において二重免疫標識を行うプロトコルを提示する。研究するために、より詳細に、感染の影響を、核または細胞質小器官などの宿主細胞内の構造は、このプロトコルを用いて標識することができる。また、後埋め薄いセクション免疫金標識法にも使用できる。このアプローチは、トリパノソマチドおよび他の寄生虫を研究するために利用可能な抗体が少ないという障害を克服するのに役立ちます。

さらに、我々のプロトコルは、細胞内寄生虫が宿主細胞と一緒に標識され、同じ免疫蛍光における2つの真核生物が、異なる種類の組織で実現されたプロトコルとは異なる7、8、9、10、11.......

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開示事項

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著者らは、競合する利益や財政的利益を宣言しません。

謝辞

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この作品は、フンダソン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP 2010/19547-1;; 2018/03677-5)からMMABへ、フンダサン・デ・アポオ・アオ・エンシーノ、ペスキサ・エ・アシストエンシア-FAEPAからMMAB、そしてクオルデナソン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーベル・スーペリア・ブラジル(CAPES) - ファイナンス・コード0011。CG-CはCAPESから修士と博士の交わりを受け、LAMT-SはCNPqから博士課程のフェローシップを受けました。共焦点顕微鏡支援のイライザベテ・R・ミラニと、LLC-MK2細胞(USPリベイラオ・プレト医科大学)を提供してくれたダリオ・ザンボニ博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa Fluor 488 - IgG2b 抗体Life technologies, USAA21141ヤギ抗マウス
AffiniPure Rabbit 抗マウス IgG (H+L)Jackson Immunoresearch, USA315-005-003抗マウス抗体
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体Life technologies, 米国A11017ヤギ抗マウス
Alexa Fluor 594 IgG1 抗体Life technologies, 米国A21125ヤギ抗マウス
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体Life technologies, USAA21237ヤギ抗マウス
抗hnRNPA1抗体 IgG2bSigma-Aldrich, USAR4528マウス抗体
抗TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) 抗体Our labIn-houseMouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, USAA2153-10Gアルブミンタンパク質
洗剤 Igepal CA-630Sigma-Aldrich, USAI3021Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo fisher scientific, USA12657-029Serum
Penicillin StreptomycinGibco, Thermo fisher scientific, USA15140-122Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594Life technologies, USAA12381アクチンマーカー
ProLong Gold 退色防止剤 with DAPILife technologies, 米国P36935封入剤
試薬 RPMI 1640 1X with L-glutamineCorning, 米国10-040-CV細胞培養培地
トリプシン-EDTA溶液Sigma-Aldrich, 米国T4049-100MLBioreagent

参考文献

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  1. Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalis....

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タグ

Trypanosoma cruziDAPI

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