ここでは、3Dバイオリアクターを用いて滑液間葉系幹細胞から多数のGMPグレードのエキソソームを作製するためのプロトコールを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
間葉系幹細胞(MSC)によって分泌されるエクソソームは、軟骨損傷および変形性関節症治療の有望な候補として示唆されている。臨床応用のためのエキソソームは、大規模な生産を必要とします。この目的のために、ヒト滑液MSC(hSF-MSC)をマイクロキャリアビーズ上で成長させ、動的3次元(3D)培養システムで培養しました。3D動的培養を利用することにより、SF-MSC培養上清から大規模なエクソソームを得ることに成功した。エキソソームを超遠心により回収し、透過型電子顕微鏡、ナノ粒子透過アッセイ、およびウェスタンブロッティングによって検証しました。また、エクソソームの微生物学的安全性も検出されました。エキソソーム検出の結果は、このアプローチが多数の適正製造基準(GMP)グレードのエキソソームを生成できることを示唆しています。これらのエキソソームは、エキソソーム生物学研究および臨床変形性関節症治療に利用することができる。
概要
関節軟骨とその根底にある骨の破壊に起因する変形性関節症(OA)は、障害につながる深刻な課題であり続けています1,2。血液と神経の供給がなければ、軟骨の自己治癒能力は一度損傷すると最小限になります3,4。過去数十年で、自家軟骨細胞移植(ACI)に基づく治療法は、OA治療においてある程度の進歩を遂げました5。軟骨細胞の単離と拡張のためには、OA関節の非体重支持領域から小さな軟骨を採取する必要があり、軟骨に損傷を与えます。また、この手順は、拡張した軟骨細胞6を移植するための第2の操作を必要とするであろう。したがって、軟骨損傷のないOA治療のためのワンステップ療法が広範囲に検討されています。
間葉系幹細胞(MSC)は、OA治療の有望な代替手段として示唆されています7,8。複数の組織に由来するMSCは、特定の刺激で軟骨細胞に分化することができます。重要なことに、間葉系幹細胞は抗炎症を介して免疫応答を調節することができます
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プロトコル
この研究は、深セン第二人民病院の人間倫理委員会によって承認されました。 インビトロ プロトコルでhSF-MSCから単離されたエキソソームの概略図を 図1に示します。
1. ヒトSF-MSCの培養と同定
- 臨床OA患者から注射器と針を使用して20mLのSFを採取します。
- OA患者の膝関節を消毒します。膝蓋骨の外側の大腿四頭筋腱から7#針で関節腔に穿刺します。
- 関節液10mLを抽出します。輸血スティックで穿刺部位を覆い、5分間押します。
- SF上清を1,500 x g で4°Cで10分間遠心分離した後、廃棄する。
- 細胞ペレットを10 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再懸濁し、1,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、PBSを廃棄します。
- ペレットを10 mLのヒトMSC培地で細胞密度5 x 104 cells/mLで再懸濁し( 材料表を参照)、懸濁液を100 mmディッシュにプレートします。
- 5%CO2を含む雰囲気下で37°Cでディッシュをインキュベートする。
- 48時....
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結果
フローサイトメトリーは、国際細胞療法学会が推奨するヒトMSCを定義するための最小限の基準に従って、SF-MSCの表面マーカーを同定するために使用されました14,15。フローサイトメトリー解析の結果、本研究で培養したSF-MSCsがMSCの同定基準を満たしていることが明らかになりました。CD34、CD45、およびHLA-DRは陰性(3%未満)、CD73、CD90、およびCD105(95%以上)は陰性でした(図2)。
倒立顕微鏡下では、SF-MSCがマイクロキャリア上で増殖することが注目されました(図3A)。2D培養プレートおよび3D培養マイクロキャリアから細胞を消化洗浄した後、細胞数をカウントした。2D培養と比較して、3D培養はSF-MSCを6日以降より迅速に増殖させました(図3B)。3つの.......
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ディスカッション
間葉系幹細胞は、その自己複製、特殊な機能を有する組織細胞への分化、およびパラクリン効果により、再生医療において広く利用されてきた16,17。特に、エクソソームが及ぼすパラクリン効果が大きな注目を集めている18。エクソソームは間葉系幹細胞の生体情報を運び、その生物学的機能を果たし、面倒な保管や出荷などのMSCの欠点を克服します。このように、間葉系幹細胞由来のエクソソームは、OA療法において最も注目されている治療介入に用いられている。
現在、MSCを増殖させるには、2D培養と3次元(3D)培養の2つの方法があります19。2D培養は、低コストでin vitro研究用のMSCを培養する従来の方法です。ただし、時間がかかり、規模の可能性が限られています。また、2D微小環境でのMSCの伝播は、MSCの最も重要な特性の1つであるステムネス
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開示事項
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。
謝辞
中国国家自然科学基金会(第81972116号、第81972085号、第81772394号);広東省自然科学財団の主要プログラム(No.2018B0303110003);広東省国際協力プロジェクト(No.2021A0505030011);深セン科学技術プロジェクト(No.GJHZ20200731095606019、いいえ。JCYJ20170817172023838, No.JCYJ20170306092215436, No.JCYJ20170413161649437);中国ポスドク科学基金会(No.2020M682907);広東省基礎応用基礎研究財団(No.2021A1515010985);深センの三明医学プロジェクト(SZSM201612079);広東省の高レベル病院の建設のための特別基金。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BCAアッセイキット | ThermoFisher | 23227 | タンパク質濃度アッセイ |
| 血液寒天プレート | 南京Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0903 | 細菌培養 |
| CD105 抗体 | Elabscience | E-AB-F1243C | フローサイトメトリー |
| CD34 抗体 | Elabscience | E-AB-F1143C | フローサイトメトリー |
| CD45 抗体 | BD Bioscience | 555483 | フローサイトメトリー |
| CD63 抗体 | アブクロナール | A5271 | ウェスタンブロッティング |
| CD73 抗体 | Elabscience | E-AB-F1242C | フローサイトメトリー |
| CD81 抗体 | ABclonal | A5270 | ウエスタンブロッティング |
| CD9抗体 | アブクロナール | A1703 | ウェスタンブロッティング |
| CD90抗体 | Elabscience | E-AB-F1167C | フローサイトメトリー |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 遠心分離機 5810R | |
| CO2インキュベーター | サーモ | セル培養 | |
| 共焦点レーザー走査型 蛍光顕微鏡 | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | エキソソームラベル |
| EZ-PCR マイコプラズマ検出キット | BI | 20-700-20 | マイコプラズマ検出 |
| フローサイトメトリー | ベックマン | MSC 同定 | |
| Gene Pulser II System | バイオ・ラッド・ラボラトリーズ | 1652660 | 遺伝子トランスフェクション |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | バージョン 8.0.2 | |
| HLA-DR 抗体 | Elabscience | E-AB-F1111C | フローサイトメトリー |
| Lowenstein-Jensen 培地 | 南京 Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | 結核菌 |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC培養 |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle Tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | 蛍光ウェスタンブロッティング | |
| OptiPrepエレクトロポレーションバッファー | Sigma | D3911 | 遺伝子トランスフェクション |
| プロテアーゼ阻害剤 カクテル | Sigma | P8340 | プロテイナーゼ阻害剤 |
| RNase A | Qiagen | 158924 | RNAの除去 |
| Sabouraud 寒天プレート | 南京Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | 菌類培養 |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| ロータリー細胞培養システム (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D 培養 |
| 超遠心分離機 | Beckman | Optima XPN-100 | エクソソーム遠心分離機 |
参考文献
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B.
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再版と許可
