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方法論記事

交互の粘性慣性力噴射による インビトロ ヒドロゲルマイクロキャリアの3D印刷

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DOI:

10.3791/62252

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2021年4月21日

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この記事について

サマリー

ここでは、ヒドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、粘性慣性力を交互に駆動する穏やかな3D印刷技術を紹介します。自家製ノズルは柔軟性を提供し、異なる材料や直径を簡単に交換できます。直径50〜500μmの細胞結合マイクロ担体を取得し、さらなる培養のために回収することができる。

要約

マイクロキャリアは、直径60~250μm、比表面積の大きいビーズで、大規模細胞培養用担体として一般的に使用されています。マイクロキャリア培養技術は、細胞学的研究における主要な技術の1つとなっており、大規模な細胞増殖の分野で一般的に使用されている。マイクロキャリアはまた、 インビトロ 組織工学構築および臨床薬物スクリーニングにおいてますます重要な役割を果たすことが示されている。マイクロキャリアを調製するための現在の方法には、マイクロ流体チップおよびインクジェット印刷が含まれ、これらはしばしば複雑な流路設計、互換性のない二相界面、および固定ノズル形状に依存する。これらの方法は、複雑なノズル加工、不便なノズル交換、および複数のバイオインクに適用した場合の過度の押出力の課題に直面しています。本研究では、直径100~300μmのハイドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、交互粘性慣性力噴射と呼ばれる3Dプリンティング技術を適用した。その後、細胞をマイクロキャリア上に播種し、組織工学モジュールを形成した。既存の方法と比較して、この方法は、幅広い生物活性材料に対して、自由なノズル先端直径、柔軟なノズル切り替え、印刷パラメータの自由な制御、および穏やかな印刷条件を提供する。

概要

マイクロキャリアは、直径60~250μm、比表面積の大きいビーズで、細胞の大規模培養に一般的に使用されています1,2。それらの外表面は細胞に豊富な増殖部位を提供し、内部は空間的増殖のための支持構造を提供する。球状構造はまた、pH、O2、栄養素および代謝産物の濃度を含むパラメータの監視および制御において利便性を提供する。撹拌槽バイオリアクターと組み合わせて使用すると、マイクロキャリアは従来の培養物と比較して比較的少量でより高い細胞密度を達成することができ、それによって大規模培養を達成するための費用対効果の高い方法を提供する3。マイクロキャリア培養技術は、細胞学的研究における主要な技術の一つとなっており、幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞などの大規模増殖の分野では大きな進歩を遂げています4。また、理想的な薬物送達ビヒクルおよびボトムアップユニットであることも判明しており、臨床薬物スクリーニングおよびインビトロ組織工学修復においてますます重要な役割を果たしています5。

異なるシナリオにおける機械的特性要件を満たすために、マイクロキャリアの構築に使用するために複数のタイプのヒドロゲル材....

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プロトコル

1. 細胞培養

  1. 高グルコースダルベッコの改変最小必須培地(H-DMEM)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸溶液(NEAA)、1%ペニシリンGおよびストレプトマイシン、および1%グルタミンサプリメントでA549細胞の培養培地として補充する。
  2. A549細胞を37°CのCO2インキュベーターで5%のCO2で培養する
  3. 継代培養のために細胞を約80%のコンフルエントでトリプシンを用いて解離させる。
    1. 3 mLのトリプシンを使用して、T75培養フラスコ内の細胞を37°Cで3分間処理し、次いで6 mLの培養培地を加えてトリプシン処理を停止した。
    2. 培養液をピペットでピペットし、緩く接着した細胞を回収した。
    3. 72.5 x g で3分間遠心分離機。上清を除去し、3mLの新鮮な培地で再懸濁する。
    4. 1mLの細胞懸濁液を、10mLの新鮮な培地を含む新しいT75培養フラスコに移す。2日ごとに培養液を交換する。

2. ノズルの作製

  1. ガラス製マイクロピペットをメーカーの指示に従ってプーラーにロードします。マイクロジェットパイプの外径、内径、長さは、それぞれ1.5mm、1.1mm、100mmです。
  2. プーラーの引っ張....

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結果

さまざまな収束速度と直径のプリントヘッドが製造され、複数のタイプの材料の印刷が実現しました。引っ張り強度の増加に伴って得られたノズルを 図1Bに示す。ノズルは、リザーバ(III)、収縮(II)、およびプリントヘッド(I)の3つの領域に分割された。リザーバはノズルの未処理部分であり、液体が静圧を提供し、印刷用のバイオインク入力を行った。収縮領域は、下向きの駆動力を生成するための主要な部分でした。引っ張り強度はプリントヘッドに大きな影響を与え、引っ張り強度が伸びると収束率が低くなりました。プリントヘッドが狭く長くなると、印刷中の表面張力が上昇し、離散的な微小液滴の形成がより困難になったが、その後の操作でより小さな直径の先端の切断が容易になった。その後、針鍛造装置を用いて、プリントヘッドを指定された直径で切断した(図1C)。100、120、150、および200μmを含む様々な直径のチップは、様々な インビトロ マイクロ組織の要件を満たす、異なるサイズのマイクロキャリアを生成するために利用可能であった。

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ディスカッション

ここで説明するプロトコールは、マルチタイプのヒドロゲルマイクロキャリアの調製およびその後の細胞播種のための指示を提供する。マイクロ流体チップおよびインクジェット印刷方法と比較して、マイクロキャリアを構築するためのAVIFJアプローチは、より大きな柔軟性および生体適合性を提供する。独立したノズルにより、ガラスマイクロピペットを含む幅広い軽量ノズルをこれらの印刷システムで使用できます。高度に制御可能な処理により、リザーバの体積、内径、プリントヘッドの形状などのパラメータを自由に調整できます。さらに、使い捨てノズルは、複数の材料間で切り替えるための滅菌を容易にし、繰り返し使用による潜在的な汚染を回避します。最後に、厳しい力や熱条件の代わりに、小さくて急速な変位が印刷プロセス中にノズルに直接作用し、印刷されたバイオインクの元の物理的および化学的特性を最大限に維持します。この機能は、生体材料アプリケーションにとって非常に魅力的です。

正しいサイズのマイクロキャリアの製造を成功させるための最も重要なステップは、1)適切な直径の先端を有するノズルを準備すること、および2)印刷されたバイオインクの.......

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開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、北京自然科学財団(3212007)、清華大学イニシアチブ科学研究プログラム(20197050024)、清華大学春風基金(20201080760)、中国国家自然科学財団(51805294)、中国国家重点研究開発プログラム(2018YFA0703004)、および111プロジェクト(B17026)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
A549細胞ATCCCCL-185ヒト非小細胞肺がん細胞株
明視野顕微鏡オリンパスDP70
共焦点顕微鏡ニコンTI-FL
ウシ胎児血清、FBSBI04-001-1ACS
ゼラチンSIGMAG1890
ガラスマイクロピペットサッター器械b150-110-10
GlutaMAXGIBCO35050-061
H-DMEMGIBCO11960-044Dulbeccoの変更されたワシ媒体
西洋ワサビのペルオキシダーゼの粉SIGMAP6782
疎水性の代理店3MPN7026製造業者の指示に従い、希釈後の
使用 Micro-forge装置narishigeMF-900
非必須アミノ酸、NEAAGIBCO11140-050非必須アミノ酸
ペニシリンG、ストレプトマイシンGIBCO15140-122
ペトリ皿SIGMAP5731-500EA
プーラーサッター装置P-1000
アルギン酸ナトリウムSIGMAA0682
トリプシンGIBCO25200-056
SIGMAC3867からのI型コラーゲン溶液
ラットテール

参考文献

  1. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
  2. Li, B., et al.

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