シロイヌナズナなどのうどんこ病感染表現型を正確に評価するための簡便かつ柔軟な接種法

サマリー

~50 μmメッシュの接種ボックスと透明なプラスチックチャンバーからなる簡単な胞子分布システムを構築するためのプロトコルを提示します。これにより、うどんこ病胞子を植物に均一に接種できるため、研究中の植物の病害表現型を正確かつ再現性よく評価できます。

要約

真菌病による作物の損失を減らすには、植物の免疫と真菌の病因を支配するメカニズムの理解を深める必要があり、特定の真菌病原体に感染したときの植物の病気の表現型を正確に決定する必要があります。しかし、うどんこ病などの培養不可能な生物栄養性真菌病原体による正確な疾患表現型は、達成が容易ではなく、研究プロジェクトの律速ステップになる可能性があります。ここでは、シロイヌナズナとうどんこ病の相互作用を例に、安全で効率的で操作しやすい疾患表現型システムを開発しました。このシステムは主に3つのコンポーネントで構成されています:(i)真菌胞子を植物のフラットに接種するための~50μmの細孔のステンレス鋼またはナイロンメッシュに取り付けられた取り外し可能な蓋を備えた木製の接種ボックス、(ii)内部で接種を行いながら胞子の脱出を最小限に抑えるための小さな前面開口部を備えた透明なプラスチックチャンバー。 (iii)均一かつ効果的な接種のための胞子の脱落および分布方法。 ここで説明するプロトコルには、接種ボックスとプラスチックチャンバーを低コストで作成するための手順とパラメーター、およびシステムを使用してうどんこ病胞子を均一に接種できるようにし、病気の表現型の精度と再現性を向上させる方法のビデオデモンストレーションが含まれています。

概要

うどんこ病は、多くの食用作物や観賞用植物の最も一般的で重要な病気の1つです¹。うどんこ病の研究は非常に人気があり、Web of Scienceでは「うどんこ病」をキーワードにした検索結果として10,500件以上の出版物が掲載されています(2020年11月現在)。確かに、うどんこ病(Blumeria graminisに代表される)は、Molecular Plant Pathology²のジャーナルによってトップ10の真菌病原体の1つと考えられています。病害感受性の定量化は、病害抵抗性または感受性に寄与する植物遺伝子の特性評価、またはうどんこ病における候補エフェクター遺伝子の機能同定に必要なステップです。しかし、うどんこ病の胞子とは異なり、うどんこ病種の胞子(私たちの研究室での経験に基づくGolovinomyces cichoracearum UCSC1など)は、水懸濁プロセスを経た後、生存率の低下を示すため、他のほとんどの真菌性病原体と比較して、信頼性の高い病気の表現型ははるかに困難です^3,4.特定のうどんこ病病原体を試験植物に不適切および/または不均一に接種すると、表現型の結果が不正確になる可能性があります。

うどんこ病の研究では、多くの接種方法が報告されています。これらには、(i)感染した葉から試験植物⁵への胞子のブラッシング、(ii)試験植物⁶への胞子懸濁液の噴霧、(iii)塔⁷の下部にある植物への真空作動沈殿塔を使用した胞子の吹き付け、および(iv)ナイロンメッシュ膜と音ベースの振動の組み合わせ使用による胞子送達⁸.胞子ブラッシング(またはダスティング)法は、実行は簡単ですが、本質的に不均一であるため、定量的評価には正確ではない場合があります。胞子散布は便利で均一ですが、上記のように胞子の発芽が悪くなる可能性があります⁴。後者の2つ(すなわち、iii-iv)は、均一な接種を達成することができるはるかに改良された方法である。しかし、どちらも1回のイベントで接種する植物の数に関して接種能力を調整するのに柔軟性がなく、どちらの装置も自明ではなく、操作は真空および/または電源がある実験室エリアに限定されます。

私たちの研究室は、20年以上にわたって植物とうどんこ病の相互作用に取り組んできました^9,10。過去10年間、私たちは多くの接種方法をテストし、最近、シンプルで効果的なうどんこ病接種方法を開発しました。このメッシュベースの胞子ブラッシング法は、均一な接種を保証することができ、シンプルでスケーラブルであるため、うどんこ病を扱うすべての研究室で簡単に採用できるはずです。

プロトコル

1.メッシュで取り付けられた取り外し可能な上蓋を備えた標準的な接種ボックスを作る

1. 50μmのナイロンメンブレンメッシュまたは48μmのステンレスメッシュ(推奨)のロールを店舗から購入してください。摩耗したメッシュを交換するために、14インチx26インチの複数の部分に切断するのに十分な量を注文してください。
2. 1/4インチx 2フィートx4フィートの中密度繊維板または合板を1つ購入し、接種ボックスを作るために2つの24-1 / 2インチx 10を細かく切り、2つの12インチx 10を細かく切ります。4つの側面を支えるために8つのコーナークランプを使用してください。
   メモ: エンクロージャの幅の広い側に面している場合、側面の左側の12 x 10は恒久的に取り付けられ、側面の右側の12 x 10は、4つの磁気キャッチによって所定の位置に保持される取り外し可能なドアです(図1A、B)。
3. 左側の各内側の角に2つずつ、上から1インチ、下から1インチの位置にある4つの2インチコーナーブレースを配置し、マークを付けて穴を開けます。ネジを使用して、左短辺を2つの長辺(前面と背面)に恒久的に取り付けます。2つの長辺の間の内側の距離は、11-1 / 2インチではなく12インチである必要があります。
4. コーナークランプを所定の位置に保ち、右側のドアを適切に位置合わせした状態で、4つの磁気キャッチの位置をマークしてドリルで穴を開け、右側の取り外し可能なドアを所定の位置に保持します。ドアにボタンノブを取り付けます。ドアの上部が上蓋の下に引っ掛かります(図1A、B)。
5. メッシュで取り外し可能な上蓋を作るには、長い木製の正方形のダボを26インチと12-3 / 4インチの2セットにカットします。ボックスの周りに収まるように4つのピースを接着して釘付けします-スクリーンメッシュがこのフレームに取り付けられるため、フレームの内側の寸法はボックスの外側の寸法より少し大きくなります。
6. スクリーンメッシュを14インチx26インチ弱にカットします。鋭いエッジを防ぐために、画面がフレームを超えて突き出ないようにしてください。フレーム上の画面を引き伸ばすのを手伝ってください。メッシュをフレームでクランプで保持し(図1C)、右側のステープルが付いたホッチキスガンを使用して、スクリーンをフレームに固定します。
7. 2セットの短い木製の正方形のダボ(21インチと9インチ)を切り取り、ネジを使用して、4つの短い木製の正方形のダボを使用してフレームに沿ってメッシュをしっかりと挟みます(図1C、D)。

2.接種室を作る

1. 透明なアクリルシートとハードウェアアイテムを適切な店舗から購入します。 図2Cに示すように箱の前面側アクリルシートの開口部窓に7インチ×20を切り出す。
2. 図2Aに示すように、8つのコーナークランプを使用して、左側と右側、前面(窓付き)と背面のアクリルシートをボックスに組み立てます。チャンバーの内部測定値がトップシートの寸法と等しいことを確認してください。
   注意: 右側はサポート用であり、前面または背面のシートには取り付けられません。わざと他のシートより1/2短くなっています。この右側は、図2C、Dに示すように、下部の直角ヒンジと上部の2つの磁気キャッチによって所定の位置に保持される「ドローダウン」「フラップ」ドアになります。
3. コーナーブレースを使用してパネルを固定します(図2B、C)。ブレースを所定の位置に保持し、シャーピーマーカーでマークを付け、中央にパンチしてから、穴を開けます。
   注意: アクリルの穴あけは他の穴あけとは異なり、無理に押し込んだり、ドリルの反対側の穴の側面にひびが入ったりする可能性があります。リベットまたはネジを使用してください。ネジを締めすぎないでください、またはアクリルは時間とともに割れる可能性があります。
4. エンクロージャーの背面を回し、4 つのコーナークランプを取り外して、トップシートを所定の位置に配置します。マークを付けてドリルします。
5. 3/4インチのアングルブレースで作られた直角ヒンジを取り付けます。ヒンジロッドとしてナイロン保持ロックナットを使用してください。締め付けないで、ドアがこのヒンジで回転するように隙間を空けてください。
6. マーク、センターパンチ、ドリル、および#6-32x3 / 4 "なべ頭ネジで2つの磁気ドアマグネットを取り付けます。次に、キャッチプレートを#6-32x3 / 8インチのフラットヘッドネジで取り付けます( 図2C、Dを参照)。

3.フラットでの植物への接種

1. 接種材料として新鮮なうどんこ病胞子を準備します(例:シロイヌナズナうどんこ病ゴロビノマイセスシコラセアラムUCSC1)。シロイヌナズナ免疫不全のpad4-1変異植物¹¹を成長室(22°C、相対湿度65%、6〜8週間)できれいに育て、pad4-1植物の1つまたは半分の平らな植物を接種して、十分な新鮮なうどんこ病胞子を構築します(図3A)。
2. 標準11インチx21インチx2.5フラットで感染表現型を決定するための植物を育てます。
   注:短日(8時間明、16時間暗、22°C)で6〜8週間栽培した シロイヌナズナ は、うどんこ病の感染検査に適しています。
3. 接種後8〜10日で感染した植物からの新鮮なうどんこ病胞子(dpi)が利用可能になったら、感染試験のために植物のフラットを接種室内の接種ボックスに移動します(図1B、2C)。
4. 重度に感染した シロイヌ ナズナの葉(または葉/ロゼットのサイズと接種レベルに応じて4〜6枚の感染したロゼット)を15〜20枚切り、凝縮水がある場合は葉を乾かします。
5. 片手で1〜2枚の葉または長い鉗子でロゼットをつかみ、葉を逆さまに向けます。次に、チャンバーの開口部に両手を入れ、接種ボックスに取り付けられたメッシュの上に葉/ロゼットをゆっくりと動かしながら、はさみで鉗子の腕をそっと叩きます(図3B)。すべての葉またはロゼットが使用されるまでこれを繰り返します。
   注:成熟した胞子は、感染した葉の分生子柄から簡単に外れます。メッシュ上の胞子をできるだけ均等に取り除くようにしてください。
6. 1つまたは2つの細かいファンブレンダーブラシを使用して、メッシュを通して胞子をそっと磨きます(図3C)。接種ボックスの底にある植物への胞子の均一な分布を最大化するために、メッシュの表面全体を異なる方向に4回以上ブラッシングするようにしてください(図3D)。ブラシでメッシュを数回軽くたたいて、メッシュに詰まっている胞子を振り落とします。
7. 胞子を30分間落ち着かせます。その後、接種植物を収容したフラットを接種箱から出す。フラットをプラスチックドームで覆い、成長チャンバー(22°C、相対湿度65%)に入れます。疾患表現型は、5、または8〜12 dpi ¹²で実行できます。

4.より小さな接種ボックスで植物に接種する

注:接種する植物が少ない場合でも、標準の接種ボックスを使用できます。必ず箱の真ん中に植物を置いてください。植物を覆うメッシュの領域で胞子を取り除き、ブラシをかけ、接種材料を節約しながらすべての植物が確実に接種されるようにします。代わりに、好ましくは、より小さな接種ボックスを使用することができる(以下に記載されるように)。

1. 段ボール箱を接種箱に変換します。箱の上面と下面を取り外し、必要に応じて角をテープで固定し、接着またはホチキス止めで適切なサイズの50μmメッシュを上部に取り付けるだけです(図4A、B)。
2. 植物を含むフラットを接種チャンバー内に移動し、植物を覆うためにフラットの上に小さな接種ボックスを置きます。
3. 上記のように胞子を取り除き、ブラシをかけます。

5.切り離した葉をペトリ皿に接種する

注:(i)新鮮なうどんこ病の胞子が非常に限られている場合、および/または(ii)感染細胞における病気の表現型および/またはタンパク質細胞内局在を評価する必要がある間、植物を清潔に保つ必要がある場合、剥離した葉はMS寒天プレートの感染に使用できます。

1. ペトリ皿より少しだけ大きいミニ接種ボックスを作ります。
2. 1/2強度のムラシゲおよびスクーグ(MS)培地寒天(1.5%)プレートを準備します。必要に応じてチアベンダゾール(40 mg/L)を添加して金型汚染を減らします。プレートは、使用するまで冷蔵庫で4°Cで保管してください。
3. テストする個々の植物ごとに、葉柄の根元から1つまたは2つの完全に拡張した葉を切り取ります。剥離した葉の葉柄を~30°の角度で寒天培地に挿入します。
   注意: 各プレートには、葉のサイズと使用するプレートに応じて、20〜40枚の葉を含めることができます(図4C)。
4. 上記のように接種室内に葉を接種する。蓋付きのプレートを成長チャンバーに移動します。
5. 葉の小さな部分を切り取り、特定の時点でのタンパク質の細胞内局在を確認します。
6. 感染表現型を評価するには、葉を4または5dpiの新鮮な無菌MS寒天プレートに移します。葉を新鮮な寒天培地に挿入する前に、葉柄の付け根を切ります。病気の表現型を8または9 dpiで評価します。

結果

ここでは、準備、操作、調整が容易な新しいうどんこ病胞子接種方法を紹介します。 図1 は、50μmのメンブレンメッシュで取り付けられた取り外し可能な蓋のメーカーに重点を置いた標準接種ボックスの組み立てを示しています。 図2 は、接種室の組み立てを示す。 図3 は、このシステムを使用した接種プロセスの主要なステップを示しています。 図4 は、MS寒天培地上の平らな植物全体またはより少ない植物、または剥離した葉に接種するために使用できる他の接種ボックスを示しています。最後に、 図5 は、胞子分布または植物感染表現型によって反映される接種均一性を実証するデータを提供する。

ディスカッション

メッシュボックスベースの接種方法は、他の接種方法に比べていくつかの利点があります。まず、 図5に示すように、適切に操作すれば胞子の均一な分布を実現できます。第二に、~50μmのメッシュの使用に加えて、感染した葉の穏やかな振とうによる胞子除去は、ソース植物に存在するアザミウマまたは他の植物感染昆虫による植物感染を減らすことができます。第三に、プラスチックチャンバー内の植物や分離葉に異なるサイズの接種ボックスを使用すると(どちらも75%エタノールを噴霧することで簡単に洗浄できます)、接種材料をより効果的に利用し、相互汚染を減らすことができます。我々は、接種プロセス全体を通して、接種室から逃げる真菌胞子がないか、ほとんどいないことを発見した。

高品質の接種ボックスは、均一な接種を確実にするための鍵です。標準接種ボックスは、シロイヌナズナの若くて成熟した植物(図1)、イチゴ、アザミアザミ、ベンサミアナ(図示せず)の苗の接種に使用できることがわかりました。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
48 µmステンレス鋼の格子網スクリーン;サイズ:24 "X 48"	Amazon	NA	接種ボックスの蓋を作るため
#6-32 x ¾" 小ネジ、平ワッシャー、ナット	ホームデポ	NA	接種室を作るため
#6-32 亜鉛メッキナイロンロックナット(4個入り)	ホームデポ	NA	接種室を作るため
#6-32x3/8"プラス皿小ネジ、平ワッシャー、ナット	ホームデポ	NA	用 マグネットドアキャッチプレート
#8-32x1 / 2 "小ネジ、平ワッシャー、ナットホーム	デポ	NA	コーナーブレースとドアヒンジを固定するため
0.250厚の透明な押し出しアクリルフィルムマスクシート。 サイズ:17½「X 20」	専門のプラスチック	SACR.250CEF	接種チャンバーを作るための
0.250厚の透明な押し出しアクリルフィルムマスクシート。サイズ:18 "X 20"	プロフェッショナルプラスチック	SACR.250CEF	接種チャンバーを作るため
0.250 厚さの透明な押し出しアクリルフィルムマスクシート。サイズ:18 "X 30"	専門のプラスチック	SACR.250CEF	接種チャンバーを作るための
0.250厚の透明な押し出しアクリルフィルムマスクシート。サイズ:20 "X 29 ½「	専門のプラスチック	SACR.250CEF	種チャンバーを作るため
1-5 / 8 "キャビネットドア磁気キャッチホワイト	ホームデポ	モデル #P110-W	種チャンバーを作るため
2 "スチール亜鉛メッキコーナーブレース(8パック)	ホームデポ	モデル #13611	接種ボックス&チャンバーの製作に
3 "コーナークランプ	港貨物ツール	SKU 63653、1852、60589	接種チャンバー3
/4 " スチール亜鉛メッキコーナーブレース(4パック)	ホームデポ	モデル#13542	接種ボックス&チャンバーを作るため
4-7 / 8 "亜鉛メッキ軽量ドアプルハンドル	ホームデポ	モデル#15184	接種ボックス
ファインファンブレンダーを作るためブラシ	マイケルズストア	M10472846	接種用
ケレハー3/4 "x 3/4" x 36 "木製の正方形のダボ	ホームデポ	NA	接種ボックスの蓋を作るため
中密度ファイバーボード(1/4 "x 2' x 4 ');	ホームデポ	モデル#1508104	接種ボックスを作るための
500µで丸いガラスカバースリップ。エムグリッド	イビディ USA Inc.	10816	胞子密度の決定用