~50 μmメッシュの接種ボックスと透明なプラスチックチャンバーからなる簡単な胞子分布システムを構築するためのプロトコルを提示します。これにより、うどんこ病胞子を植物に均一に接種できるため、研究中の植物の病害表現型を正確かつ再現性よく評価できます。
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方法論記事
シロイヌナズナなどのうどんこ病感染表現型を正確に評価するための簡便かつ柔軟な接種法
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
真菌病による作物の損失を減らすには、植物の免疫と真菌の病因を支配するメカニズムの理解を深める必要があり、特定の真菌病原体に感染したときの植物の病気の表現型を正確に決定する必要があります。しかし、うどんこ病などの培養不可能な生物栄養性真菌病原体による正確な疾患表現型は、達成が容易ではなく、研究プロジェクトの律速ステップになる可能性があります。ここでは、シロイヌナズナとうどんこ病の相互作用を例に、安全で効率的で操作しやすい疾患表現型システムを開発しました。このシステムは主に3つのコンポーネントで構成されています:(i)真菌胞子を植物のフラットに接種するための~50μmの細孔のステンレス鋼またはナイロンメッシュに取り付けられた取り外し可能な蓋を備えた木製の接種ボックス、(ii)内部で接種を行いながら胞子の脱出を最小限に抑えるための小さな前面開口部を備えた透明なプラスチックチャンバー。 (iii)均一かつ効果的な接種のための胞子の脱落および分布方法。 ここで説明するプロトコルには、接種ボックスとプラスチックチャンバーを低コストで作成するための手順とパラメーター、およびシステムを使用してうどんこ病胞子を均一に接種できるようにし、病気の表現型の精度と再現性を向上させる方法のビデオデモンストレーションが含まれています。
概要
うどんこ病は、多くの食用作物や観賞用植物の最も一般的で重要な病気の1つです1。うどんこ病の研究は非常に人気があり、Web of Scienceでは「うどんこ病」をキーワードにした検索結果として10,500件以上の出版物が掲載されています(2020年11月現在)。確かに、うどんこ病(Blumeria graminisに代表される)は、Molecular Plant Pathology2のジャーナルによってトップ10の真菌病原体の1つと考えられています。病害感受性の定量化は、病害抵抗性または感受性に寄与する植物遺伝子の特性評価、またはうどんこ病における候補エフェクター遺伝子の機能同定に必要なステップです。しかし、うどんこ病の胞子とは異なり、うどんこ病種の胞子(私たちの研究室での経験に基づくGolovinomyces cichoracearum UCSC1など)は、水懸濁プロセスを経た後、生存率の低下を示すため、他のほとんどの真菌性病原体と比較して、信頼性の高い病気の表現型ははるかに困難です3,4.特定のうどんこ病病原体を試験植物に不適切および/または不均一に接種すると、表現型の結果が不正確になる可能性があります。
う....
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プロトコル
1.メッシュで取り付けられた取り外し可能な上蓋を備えた標準的な接種ボックスを作る
- 50μmのナイロンメンブレンメッシュまたは48μmのステンレスメッシュ(推奨)のロールを店舗から購入してください。摩耗したメッシュを交換するために、14インチx26インチの複数の部分に切断するのに十分な量を注文してください。
- 1/4インチx 2フィートx4フィートの中密度繊維板または合板を1つ購入し、接種ボックスを作るために2つの24-1 / 2インチx 10を細かく切り、2つの12インチx 10を細かく切ります。4つの側面を支えるために8つのコーナークランプを使用してください。
メモ: エンクロージャの幅の広い側に面している場合、側面の左側の12 x 10は恒久的に取り付けられ、側面の右側の12 x 10は、4つの磁気キャッチによって所定の位置に保持される取り外し可能なドアです(図1A、B)。 - 左側の各内側の角に2つずつ、上から1インチ、下から1インチの位置にある4つの2インチコーナーブレースを配置し、マークを付けて穴を開けます。ネジを使用して、左短辺を2つの長辺(前面と背面)に恒久的に取り付けます。2つの長辺の間の内側の距離は、11-1 / 2インチではなく12インチである必要があります。
- コーナークランプを所定の位置に保ち、右側のドアを適切に位置合わせした状態で、4つ....
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結果
ここでは、準備、操作、調整が容易な新しいうどんこ病胞子接種方法を紹介します。 図1 は、50μmのメンブレンメッシュで取り付けられた取り外し可能な蓋のメーカーに重点を置いた標準接種ボックスの組み立てを示しています。 図2 は、接種室の組み立てを示す。 図3 は、このシステムを使用した接種プロセスの主要なステップを示しています。 図4 は、MS寒天培地上の平らな植物全体またはより少ない植物、または剥離した葉に接種するために使用できる他の接種ボックスを示しています。最後に、 図5 は、胞子分布または植物感染表現型によって反映される接種均一性を実証するデータを提供する。
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ディスカッション
メッシュボックスベースの接種方法は、他の接種方法に比べていくつかの利点があります。まず、 図5に示すように、適切に操作すれば胞子の均一な分布を実現できます。第二に、~50μmのメッシュの使用に加えて、感染した葉の穏やかな振とうによる胞子除去は、ソース植物に存在するアザミウマまたは他の植物感染昆虫による植物感染を減らすことができます。第三に、プラスチックチャンバー内の植物や分離葉に異なるサイズの接種ボックスを使用すると(どちらも75%エタノールを噴霧することで簡単に洗浄できます)、接種材料をより効果的に利用し、相互汚染を減らすことができます。我々は、接種プロセス全体を通して、接種室から逃げる真菌胞子がないか、ほとんどいないことを発見した。
高品質の接種ボックスは、均一な接種を確実にするための鍵です。標準接種ボックスは、シロイヌナズナの若くて成熟した植物(図1)、イチゴ、アザミアザミ、ベンサミアナ(図示せず)の苗の接種に使用できることがわかりました。.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、国立科学財団(IOS-1901566)によってS.シャオに支援されました。著者らは、植物成長施設のメンテナンスについてF.コーカーとC.フックス、および接種ボックスとチャンバーの製造に関連する技術的支援を提供してくれたホルヘサモラに感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 48 µmステンレス鋼の格子網スクリーン;サイズ:24 "X 48" | Amazon | NA | 接種ボックスの蓋を作るため |
| #6-32 x ¾" 小ネジ、平ワッシャー、ナット | ホームデポ | NA | 接種室を作るため |
| #6-32 亜鉛メッキナイロンロックナット(4個入り) | ホームデポ | NA | 接種室を作るため |
| #6-32x3/8"プラス皿小ネジ、平ワッシャー、ナット | ホームデポ | NA | 用 マグネットドアキャッチプレート |
| #8-32x1 / 2 "小ネジ、平ワッシャー、ナットホーム | デポ | NA | コーナーブレースとドアヒンジを固定するため |
| 0.250厚の透明な押し出しアクリルフィルムマスクシート。 サイズ:17½「X 20」 | 専門のプラスチック | SACR.250CEF | 接種チャンバーを作るための |
| 0.250厚の透明な押し出しアクリルフィルムマスクシート。サイズ:18 "X 20" | プロフェッショナルプラスチック | SACR.250CEF | 接種チャンバーを作るため |
| 0.250 厚さの透明な押し出しアクリルフィルムマスクシート。サイズ:18 "X 30" | 専門のプラスチック | SACR.250CEF | 接種チャンバーを作るための |
| 0.250厚の透明な押し出しアクリルフィルムマスクシート。サイズ:20 "X 29 ½「 | 専門のプラスチック | SACR.250CEF | 種チャンバーを作るため |
| 1-5 / 8 "キャビネットドア磁気キャッチホワイト | ホームデポ | モデル #P110-W | 種チャンバーを作るため |
| 2 "スチール亜鉛メッキコーナーブレース(8パック) | ホームデポ | モデル #13611 | 接種ボックス&チャンバーの製作に |
| 3 "コーナークランプ | 港貨物ツール | SKU 63653、1852、60589 | 接種チャンバー3 |
| /4 " スチール亜鉛メッキコーナーブレース(4パック) | ホームデポ | モデル#13542 | 接種ボックス&チャンバーを作るため |
| 4-7 / 8 "亜鉛メッキ軽量ドアプルハンドル | ホームデポ | モデル#15184 | 接種ボックス |
| ファインファンブレンダーを作るためブラシ | マイケルズストア | M10472846 | 接種用 |
| ケレハー3/4 "x 3/4" x 36 "木製の正方形のダボ | ホームデポ | NA | 接種ボックスの蓋を作るため |
| 中密度ファイバーボード(1/4 "x 2' x 4 '); | ホームデポ | モデル#1508104 | 接種ボックスを作るための |
| 500µで丸いガラスカバースリップ。エムグリッド | イビディ USA Inc. | 10816 | 胞子密度の決定用 |
参考文献
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology.
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