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概要

このプロトコルは、1回の実験で4つの薬剤の間で得ることができるすべての可能な組み合わせを研究する方法を説明します。この方法は、標準の96ウェルプレートマイクロ希釈アッセイと、結果を評価するための分数抑制濃度(FICs)の計算に基づいています。

Abstract

薬物併用療法の概念は、主に薬剤に対する耐性の急激な増加に伴って非常に重要になってきています。Qチェッカーボードとも呼ばれる4倍のチェッカーボードは、他のプロトコルと同じ結果を達成するために必要な時間と作業を最小限に抑えるために、1つの実験で4つの薬物の間で得ることができる可能な組み合わせの数を最大化することを目的としています。このプロトコルは、薬物を希釈し、いくつかの96ウェルプレートで一緒に組み合わせる単純なマイクロ希釈技術に基づいています。

96ウェルプレートの最初のセットでは、ミュラー・ヒントンスープが追加され、その後に最初に必要な薬物(例えば、Cefotaximeはここで)を連続的に希釈する。最初のステップが完了した後、別の96ウェルプレートのセットが第2の薬物(例えば、アミカチ)を希釈するために使用され、これは特定の量の薬物2を除去することによって移され、薬物1を含む96ウェルプレートの最初のセットの対応する井戸に入れられます。第3のステップは、第3の薬物(例えば、レボフロキサシン)の必要な濃度を、薬物1および2の組み合わせを含む初期セットの適切なプレートに添加することによって行われる。第4のステップは、第1セットの適切なプレートに第4の薬物(例えば、トリメトプリム-スルファメトキサゾール)の必要な濃度を加えることによって行われる。次に、 大腸菌 ESBL細菌接種を調製し、添加する。

この方法は、すべての可能な組み合わせを評価するために重要であり、さらに in vivo テストのためにテストされる可能性の広い範囲を有する。多くの焦点を必要とする疲れた技術であるにもかかわらず、結果は顕著であり、多くの組み合わせを単一の実験でテストできる時間を節約します。

Introduction

抗生物質^1,2の過剰使用や誤用による耐性の増加に伴い^、細菌感染を治療するための新薬や薬剤の開発が非常に重要になっています。新薬開発などの新しいアプローチは、抵抗危機を克服するために非常に重要です。しかし、製薬業界は新しい抗菌剤の開発には関心がありません。さらに、新薬が開発されれば、細菌はこれらの新薬^3,4に対する耐性を進化し、開発し続けるだろう。したがって、抵抗の問題は解決されず、細菌耐性を克服するために考慮され、研究されるべき別のアプローチの必要性を作る。

薬物の組み合わせは、主に多剤耐性病原体^5、6によって引き起こされる細菌感染症を治療するための非常に重要な概念である。それは治療の経過を減少させる、与えられた用量を減少させる;したがって、与えられた薬物の毒性を減少させ、抵抗性の発生率を低下させるのに役立ち、そしてある意味では、担保感受性^{5、7、8、9}の概念に記載されているように、与えられた薬剤に細菌を感作する。

1つの薬剤に対する耐性の開発は、単一の突然変異を必要とします;しかし、複数の経路を標的とする薬物の組み合わせに対する耐性の開発には、この組み合わせによって減速されるいくつかの独立した突然変異が必要である。併用療法を使用する間の抵抗の低下の一例は、結核菌¹⁰におけるリバンフィンに対する抵抗率の低下である。別の例は、ピペラシリンを単独で服用している患者において抵抗性株の出現率がカルボキシペニシリンとアミノグリコシド¹⁰との組み合わせを服用したものよりも高いことを示したGribbleららの研究である。研究は、進化する細菌におけるアミノグリコシドへの耐性の発達がこれらの株を様々な他の薬物に敏感にしたことを示^{している5。}β-ラクタム級薬物アモキシシリンとラクタマーゼ阻害剤のクラクタマーゼ阻害剤との組合せは、耐性菌株⁸の治療に成功を示した。

治療時間を短縮することは、薬物の組み合わせから生じる良い利点です。例えば、2週間のジェンタマイシンとペニシリンまたはセフトリアキシンを併用する療法は、ペニシリンまたはセフトリアキシン単独で与えられる同じ効力を与える^。併用薬は、サブICのような単独で与えられた場合に有効ではない薬物の低用量の使用を可能にする。スルホンアミドの例は、トリプルスルホンアミドの使用が最小限に抑えられるところに、より低い用量で、全用量で不溶性スルホンアミドを使用する場合に結晶形成または結晶化物である毒性を与^{えることができる。}

したがって、与えられた投与量と治療時間を減らすことは、最終的に体内の薬物の毒性を減少させる。併用薬物間の相互作用を評価する方法を開発するという考え方は非常に重要です。ある研究では、併用療法がアシネトバクターおよびP.緑素吸砂の耐性種の治療に対してより効果的であることを示^した。

併用して薬を与える
チェッカーボード法、タイムキル曲線法、Eテスト法¹³など、薬物の組み合わせを調べることができる方法は様々です。チェッカーボード法は、1つの実験自体で問題の2つの薬物の間のすべての可能な組み合わせを研究することができます。また、3つの薬剤¹⁴の組み合わせを研究するために開発された。現在、これを拡張して、主に多剤耐性病原体の治療のための4つの薬剤の組み合わせを研究しています。

タイムキル曲線アッセイは、通常、ある薬剤の殺菌効果を試験するために行われる。また、いくつかの薬物が特定の濃度で組み合わされる薬物の組み合わせの効果をテストするために使用されました。このプロトコルは、各カップに我々は、スープ、薬物の組み合わせ、および必要な細菌株を追加するいくつかの無菌チューブまたはカップの調製を必要とする。いくつかの時点で光学密度のインキュベーションと記録後、その結果を、使用された菌株の正常な成長率と比較して、増殖速度が増加したか、減少したか、または¹³を変化させなかったかを調べる。

E-test法は、通常、対象の薬物の勾配濃度を含むストリップが接種されたプレート上に置かれている最小の阻害濃度(MIC)を試験するために行われる。また、2つのストリップが彼らのMCS¹³で交差する垂直な方法でプレートに追加される2つの薬物の組み合わせをテストするために使用されました。

文献によれば、相乗効果を定義し、研究するためのゴールドスタンダードはありません。したがって、組み合わせを研究するために使用される方法のどれがより良く、どれがより良く、より信頼性の高い結果を主に¹³を生成するかを評価することは困難です。しかし、時間殺しの検定は、労働集約的で時間がかかり、高価な^15,16であり^、Eテスト法は2つの薬物の組み合わせを研究するために開発される。チェッカーボードは、テストされた2つの薬物間のすべての可能な組み合わせを研究することができ、これがこの技術が開発するために選択された理由です。

Protocol

1. 準備手順 蒸留水1Lに25gのMHスープを加えて混ぜ合わせて、ミュラー・ヒントンスープ(MHB)を準備します。121°Cで2.5時間オートクレーブ。次に、オートクレーブされた培地を室温または冷蔵庫に保管します。 4象限ストリーキング法を用いて寒天培地上で問題の細菌(大腸菌 ESBL)をサブ培養し、37°Cで一晩インキュベートする。 滅菌ループを使用して、1コロニーを取り、近い平行筋を行うことによって、マッコンキー寒天プレートの前半にそれを広げます。 ループを使用して、第1象限からバクテリアをストリークして第2象限に広げる。 2 番目の象限から、3 番目の象限のストリークを平行な近い縞を使用して延長します。 第4象限の中央に細菌を広げ、第3象限からストリークする。 2. パネルの準備 4つの96ウェルプレートを隣り合わせて正方形にします。テープを使用して、底をテープでつなぎます。 この手順を繰り返して、4 枚のプレートを含む 4 つのパネルを取得し、A1、A2、A3、および A4 という名前を付けます。 4つのパネルの16個の96ウェルプレートの列2と列11の間の井戸にMHスープの50 μLを加えます。 4つのパネルの16 96ウェルプレートで負のコントロールとして役立つウェルH12にMHスープの200 μLを加えます。 4つのパネルの16 96ウェルプレートで正の制御井戸として機能する井戸A1とH1にMHスープの150 μLを追加します。 3. 薬物1、セフォタキシム、連続希釈 円錐形の管に、生殖不能dH2Oの15 mLを加える。 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 15 mL)/C1. 注:当社の場合、セフォタキシムストックソリューションは105 μg/mL、C2 は256 μg/mLです。したがって、V1 = 38.4 μL。 15 mLの無菌dH2Oから計算された容積を取り除き、薬剤を加える。 調製した薬物溶液のピペット50μLは、H12を除くカラム11およびカラム12の各ウェルに入る。 列 11 から 50 μL を取り出して列 10 の対応するウェルに入れてシリアル希釈を開始し、10 から 2 列目から取り出した 50 μL が廃棄される列 2 まで続きます。 4 つのパネルのすべての 16 96 ウェル プレートについて、手順 3.4 と 3.5 を繰り返します。 4. 薬物2、アムカシン、連続希釈 円錐形の管に、生殖不能dH2Oの10 mLを加える。 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 10 mL)/C1. 注:当社の場合、アミカシンストックソリューションは103 μg/mL、C2 は64 μg/mLです。したがって、V1 = 64 μL。 10 mLの無菌dH2Oから計算された容積を取り除き、薬剤を加える。 8つの別々の96ウェルプレートを取ります。 各プレートに、行 G と B の間のウェルに MHB の 100 μL を追加します。 前に調製した薬物2溶液の100μLを行Gのウェルに加える。 各ウェルから100 μLを取って行Gから行Bに連続して希釈し、最後に行Bのウェルから100 μLを捨てます。 8枚のプレートを準備するために、ステップ4.5、4.6、および4.7を繰り返します。 5. 4つのパネルへの薬物2の移入 ピペット50μLの薬物2は、行GとBの間のウェルから、4枚のパネルの各プレートの対応するウェルに入る。1つの準備された96ウェルプレートには、1つのパネル内の2つのプレートに十分な100 μLの薬物2が含まれています。 6. 薬物3、レボフロキサシン、追加 4つの異なる円錐形の管に、生殖不能dH2Oの14 mLを加える。 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 14 mL)/C1. 注:当社の場合、レボフロキサシンは5 x 103 μg/mLのストック溶液から4つの異なる濃度で調製されます。C1 = 2 μg/mL、V1 = 5.6 μLC2 = 4 μg/mL、V1 = 11.2 μLC3 = 8 μg/mL、 V1 = 22.4 μLC4 = 16 μg/mL、 V1 = 44.8 μL 各チューブから14mLの無菌dH2Oから計算された体積を取り除き、薬剤を加えます。 3番目の薬剤の必要な濃度を準備した後、50 μLを取り、C1が4つのパネルの4つのP1プレートに対応する各パネルの対応するプレートのBとGと列2と列12の間の対応する井戸に追加し、C2は4つのパネルの4つのP2プレートに対応します、C3は4つのパネルの4つのP3版に対応し、C4は4つのパネルの4つのP4版に対応する。 7. ドラッグ4、トリメトプリム-スルファムトキサゾール、追加 円錐形の管に、生殖不能dH2Oの14 mLを加える。 式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 14 mL)/C1. 注:当社の場合、トリメトプリム-スルファメトキサゾールは、48 x 103 μg/mLのストック溶液から4つの異なる濃度で調製されます。C1 = 512 μg/mL、V1 = 149.33 μLC2 = 1024 μg/mL、 V1 = 298.66 μLC3 = 2048 μg/mL, V1 = 597.33 μLC4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194.66 μL 各チューブの14mLの無菌dH2Oから計算された体積を取り除き、薬剤を加えます。 第4の薬剤の必要な濃度を調製した後、50μLを取り、C1がパネル1に対応し、C2がパネル2に対応し、C2がパネル3に対応し、C4がパネル4に対応する対応する4つのプレートの4つのプレートのBとGと列の間の対応する井戸に加える。 8. 細菌性菌の調製と添加 滅菌ループを使用して、以前にプレート上で培養した細菌分離物 大腸菌 ESBLの1コロニーを滅菌MHBおよび渦の2mLに移す。 密度計を使用して0.5マクファーランドでなければならない濁度を確認してください。 滅菌尿カップに80 mLの無菌MHスープを加えます。 0.5マクファーランド内液から尿カップに細菌接種を加え、C 1 V1= C2V2に続く尿カップに V1 = (106 x 80 mL) / 10 8 =800 μL. 管内管内溶液106CFU/mLのピペット50μLは、H12を除く各ウェルに、これは滅菌制御が良好である。 パネルを一晩で37°Cでインキュベートします。 インキュベーション後、50 μLのヨウドテトラゾリウムを加えて、ウェルの成長を記録します。 9. FIC テンプレートのプロトコル (補足ファイル) パネルAの黄色い細胞に薬物1(セフォタキシム)の最高濃度を書く。 パネルBの黄色の細胞に薬物2(アミカシン)の最高濃度を書く。 パネルCの黄色の細胞に薬物3(レボフロキサシン)の最高濃度を書く。 パネルDに薬物4(トリメトプリム-スルファメトキサゾール)の最高濃度を書く。 赤で成長している井戸を強調することによって、レッドライン(成長/成長なしインターフェイス)をトレースします。 薬物1(ATB1)の表に薬物1のMICを書く。 薬物2(ATB2)の表に薬物2のMICを書く。 薬物3の表に薬物3のMICを書く(ATB3)。 薬物4(ATB4)の表に薬物4のMICを書く。 ATB1 の FIC を計算するには 成長/成長なしインターフェイスのウェルを決定します。 表 ATB1 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル A の左側にある黄色のセルを最初に選択したウェルにドラッグします。 井戸 1 が FIC1 に対応し、ウェル 2 が FIC2 に対応する、など、選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.10.2 を繰り返します。 ATB2 の FIC を計算するには 表 ATB2 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル B の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。 事前に選択したすべてのウェルについて、ステップ 9.11.1 を繰り返します。 ATB3 の FIC を計算するには 表 ATB3 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル C の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。 事前に選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.12.1 を繰り返します。 ATB4 の FIC を計算するには 表 ATB4 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル D の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。 事前に選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.13.1 を繰り返します。 ATB1+2+3+4 というラベルのテーブルで、各 ATB の FIC1 を自動的に合計します。他の FICs(FIC2、FIC3 など)でも同じことが起こります。 FIC を含み、黄色で強調表示されているセルで、それをダブルクリックし、テーブル ATB1+2+3+4 から合計された ΣFICs を選択します。 9 枚のプレートを表す 9 枚のシートのそれぞれに対して、これらの手順を繰り返します。注: シート FIC all では、テーブルは得られた値の解釈と最終的な合計 FIC を示します。 10. 4つの薬物のマイクロ希釈アッセイを用いたMICの決定 各試験薬の略称で4つの異なる行にラベルを付けます。例えば、セフォタキシム用CTX、アミカシンのAMK、レボフロキサシンのLEVO、トリメトプリムスルファメトキサゾールのSXTが挙げられない。 ピペット200 μLの無菌ミュラーヒントンスープは、使用された各行でウェル番号1とウェル番号12にスープします。まあナンバー12はネガティブコントロールとしてうまく機能します。 ピペット100μLの無菌ミュラーヒントンは、各使用列のウェル2〜11にスープを入れる。 C1V1=C2V2を用いて添加する各薬剤の体積を計算する。したがって、V1=(C 2 x 4 x V2)/C1.V2はウェルの最終容積で、C1はストック溶液の濃度、C2は最初の井戸に必要な初期濃度です。注: ここでは、次の項目を使用します。セフォタキシム:C1 = 105 μg/mL、そこで104 μg/mL、C2 = 256 μg/mLに希釈します。したがって、V1 = 20.48 μLアミカシン: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL;したがって、V1 = 51.2 μLレボフロキサシン:C1 = 5 x 103 μg/mL、そこで5 x 102 μg/mL、C2 = 16 μg/mLに希釈します。したがって、V1 = 25.6 μLトリメトプリム-スルファムトキサゾール:C1 = 48 x 103 μg/mL、C2 = 4096 μg/mL;したがって、V1 = 68.26 μL ピペットは、200 μLのスープから同じ体積を除去した後、対応する行の第1ウェルの各薬物に必要な体積を、薬剤の添加後に200μLの総体積を得た。 ウェル1からウェル2に100 μLを取り除いて連続希釈し、ウェル10から取り出した100μLが廃棄されるウェル10に達するまで。井戸11は正のコントロールとしてうまく機能していることに注意してください。 ピペット100 μLの106 は、ネガティブコントロールとして役立つ十分な番号12を除き、使用される各行の各ウェルに細菌接種を調製した。 一晩で37°Cでインキュベートする。

Representative Results

図2A は、セフォタキシムとアミカシンをレボフロキサシンおよびトリメトプリム-スルファメトキサゾールの特異的濃度と組み合わせた結果を表す。図の左側には、図の右側に薬物の濃度を模式的に提示した4つのプレートが見られます。矢印は、成長/成長なしインターフェイスのウェルを表します。色付きの井戸は成長を含む井戸です。第4版は組合せを含む象限の成長…

Discussion

4倍のチェッカーボード法は、そのプロトコルのチェッカーボードと3次元チェッカーボードに似ています。ただし、実験中のエラーを避けるために、特定の重要な手順を考慮する必要があります。

試験された分離株に対して各薬物のMICをテストし、プレートで連続希釈する必要がある薬物1および薬物2の希釈を開始するために必要な濃度を知るためにプロトコルを開始し?…

Materials

1000 µL tips	Citotest	4330000402
200 µL tips	Citotest	4330-0013-17
50 mL centrifuge tube	corning	430828	For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube	Falcon	352058	For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes	JRZ Plastilab		As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates	corning	3596	For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole	By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France	10177403	Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain	Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon		Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar	BIO-RAD	64169508	For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Muller-Hinton Broth	BIO-RAD	69444	For making bacterial media
Multichannel Pipette	Thermo Scientific	GJ54761	For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)	sanofi aventis	221937/2009	Drug 3