ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ

サマリー

マイクロ流体チップ上のマウス胚組織の培養および操作のためのプロトコールが提供される。経路変調器のパルスを印加することにより、このシステムは、マウスのソミトジェネシスの機能的調査のためのシグナル伝達振動を外部的に制御するために使用することができる。

要約

発達中のマウス胚のプレソミティック中胚葉の周期的セグメンテーションは、シグナル伝達経路のネットワークによって制御される。シグナリング振動とグラジエントは、それぞれセグメント形成のタイミングと間隔を制御すると考えられています。関与するシグナル伝達経路は過去数十年にわたって広範囲に研究されてきたが、スミトジェネシスの制御におけるシグナル伝達振動の機能に関する直接的な証拠は欠けている。シグナリングダイナミクスの機能的調査を可能にするために、マイクロフルイディクスは、これらのダイナミクスの微妙な変調のための以前に確立されたツールです。このマイクロフルイディクスベースの同伴アプローチにより、内因性シグナル伝達振動は経路変調器のパルスによって同期される。これにより、例えば、振動周期や2つの振動経路間の位相関係の変調が可能になります。さらに、経路モジュレーターの空間的勾配を組織に沿って確立して、シグナル伝達勾配の特定の変化がソミトジェネシスにどのように影響するかを研究することができる。

現在のプロトコルは、マイクロ流体工学の初めての使用者のためのマイクロ流体アプローチを確立するのを助けることを意図している。マイクロ流体システムのセットアップに必要な基本原理と機器を説明し、チップ生成用の金型を3Dプリンタで簡便に作製できるチップ設計を提供します。最後に、マイクロ流体チップ上で初代マウス組織を培養する方法、および経路変調器の外部パルスにシグナル伝達振動を同伴させる方法が議論される。

このマイクロ流体系はまた、他の文脈 における シグナル伝達ダイナミクスおよび形態原体勾配の機能的調査のために、ガストルロイドおよびオルガノイドなどの他のイン ビボおよびインビトロ モデル系を保有するように適合させることもできる。

概要

発達は、シグナル伝達経路を介した細胞間通信によって制御される。組織の複雑な形成と空間と時間における適切な細胞分化を調整するシグナル伝達経路の数は限られています。この多数のプロセスを調節するために、信号経路のダイナミクス、信号の周波数や持続時間などの経時的な経路の変化に情報をエンコードすることができます^1,2。

ソミトジェネシスの間、ソミティック組織は、プレソミティック中胚葉(PSM)³から周期的にセグメント化される。PSMは、Wnt、線維芽細胞増殖因子(FGF)、およびレチノイン酸シグナル伝達の勾配によって空間的に組織化されている。WntおよびFGFシグナルが低い判定前部のPSMでは、細胞はソマイトへの分化のためにプライミングされる。分化は、転写活性化の波がこの決定前線に達すると起こる。PSM内では、Wnt、FGF、およびNotchシグナル伝達が振動する。隣接する細胞はわずかに位相がずれて振動し、その結果、Wnt、FGF、およびNotch経路の下流に振動転写活性化の波が後部から前部PSMに移動する。マウス胚では、転写波が約2時間ごとに決定前線に到達し、ソマイト形成を開始する。シグナル伝達経路を摂動または活性化することによってソミトジェネシスを研究することは、これらの経路の重要性を説明することができる4,5,6,7,8,9。しかし、細胞行動の制御におけるシグナル伝達ダイナミクスの機能を調べるためには、シグナル伝達経路を恒久的に活性化または阻害するのではなく、微妙に調節することが不可欠である。

セグメント化マウス胚内のシグナル伝達経路活性を時間的に調節するために、Sonnenらはマイクロ流体システム¹⁰を開発した。このシステムは、生物学的試料¹¹を含むチップのマイクロチャネル内の流体の流れの厳密な制御を可能にする。PSMの適切なセグメンテーションのためのシグナル伝達ダイナミクスの重要性を研究するために、このマイクロ流体セットアップは、 エクスビボでマウスセグメンテーションクロックのシグナル伝達ダイナミクスを調節するために利用される。経路活性化剤または阻害剤を培養チャンバ内に順次パルスすることにより、Wnt、FGF、およびNotchシグナル伝達のダイナミクスの外部制御が達成される¹⁰。例えば、個々の経路の周期や複数の振動シグナル伝達経路間の位相関係を修正することができる。動的シグナル伝達レポーターの付随するリアルタイムイメージングを用いて、分化およびソマイト形成に対する経路自体に対する同伴の影響を分析することができる。シグナル伝達ダイナミクスに対するこのレベルの制御を用いて、ソミトジェネシス中のWntシグナル伝達経路とノッチシグナル伝達経路の間の位相関係の重要性が強調された¹⁰。

パーソナライズされたチップ設計により、安定した勾配形成12,13,14,15、拍動の活性化/阻害10,16,17,18、局在摂動など、局所環境内の時空間摂動のための多数のオプションが可能になります^19,20.マイクロフルイディクスはまた、実験処理の自動化により、より再現性の高い読み出しとより高いスループットを可能にすることができます^21,22,23。現在のプロトコルは、マイクロフルイディクスと組織内の内因性シグナル伝達振動の同伴をすべての標準的なライフサイエンスラボにもたらすことを意図しています。クリーンルームやソフトリソグラフィー用機器など、チップ生成用の高度な機器がなくても、マイクロ流体チップを製造し、生物学的な問題に対処するために使用することができます。金型は、自由に入手可能なコンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して設計できます。マイクロ流体チップを生成するための金型は、通常、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で構成され、3Dプリンタで印刷することも、印刷会社に注文することもできます。このようにして、マイクロ流体チップは、高価な機器を必要とせずに1日以内に製造することができる²⁴。ここでは、チップ設計が提供され、これを用いて、2次元(2D)エクスビボ培養^物25におけるマウスセグメンテーションクロックの同伴のためのモールドを3Dプリンタで印刷することができる。

マイクロフルイディクスによって可能になったオンチップ培養と正確な摂動は、シグナル伝達経路が多細胞挙動を制御する方法の分子メカニズムを解明する上で優れた可能性を秘めています。シグナル伝達ダイナミクスと形態素勾配は、開発中の多くのプロセスに必要です。以前は、実験室では細胞、組織、生物全体をマイクロ流体チップで培養しており、主に2D細胞培養の時空間摂動のためのプロトコルが他の場所で提供されていた¹²、^26、27、^28、29。マイクロフルイディクスを適用して多細胞システムの局所環境を調節することで、高スループットと正確な時空間摂動のための新しい視点が開かれます。マイクロ流体学の分野は、現在、発生生物学者にとって非専門的で安価で、容易に適用可能なツールとなっているという点に達しています。

ここで、Notchシグナル阻害剤のパルスへのマウスセグメンテーションクロックの同伴のためのプロトコルが提供される。このような実験は、(1)マイクロ流体チップの生成、(2)チップのチューブおよびコーティングの調製、および(3)マイクロ流体実験自体(図1A)のステップからなる。脊椎動物モデルシステムを含む研究は、責任ある委員会からの事前の倫理的承認を必要とします。

プロトコル

ここで紹介する研究は、EMBL倫理委員会¹⁰ とオランダ動物研究委員会(dierenexperimentencommissie、DEC)によって承認されており、動物ケアに関するHubrechtガイドラインに従っています。

液体PDMSでの作業中は手袋を着用してください。表面と機器を覆います。こぼれたものは、固まると掃除が難しくなるので、すぐに取り除いてください。

1. チップの生成

注:マイクロ流体チップは、PDMS(ポリジメチルシロキサン)を金型に鋳造することによって生成されます。金型は、CADソフトウェア(uFlowや3DμF30など)を使用して設計できます。フリーデザインのリポジトリは、MIT (Metafluidics.org) によって提供されています。モールドは、3Dプリンタで印刷されるか、または所望のデザインを含むフォトマスクを用いたソフトリソグラフィーによって生成され得る(さらなる情報については、例えば、Qin et al., ²⁰¹⁰³¹を参照されたい)。ここでは、マウス胚組織のオンチップ培養用の3Dプリンタで印刷できる金型の設計を提供する(図1B,C,補足ファイル1,2)。低解像度の3Dプリンタで印刷できるように、以前に公開されたものと比較してデザインが変更されました¹⁰。気泡トラップのない金型と気泡トラップを備えた金型が用意されています(それぞれ補足ファイル1と2)。印刷手順は使用可能なプリンタに依存するため、印刷の詳細は説明しません。ただし、未重合の樹脂がすべて完全に除去されていることを確認する必要があります。マイクロ流体チャンバ内の小さな<200μmの穴から未重合樹脂を除去するために、溶剤で余分な洗浄を行う必要があることがよくあります。これらの穴はPDMSピラーを形成し、実験中にチップ内に胚組織をトラップします。PDMSは、安価で生体適合性があり、透明であり、自己蛍光が低いため、一般にマイクロ流体学に使用される。硬化後、PDMSチップを金型から切り出し、スライドガラス上に貼り合わせる。ガラスとPDMSチップの両方のプラズマ処理は、接触させると表面を活性化し、共有結合の形成を可能にします。

1. モノマーと触媒を9:1の比率(w:w)で混合して必要量のPDMSを調製し、重合を誘導する。使い捨ての道具を使って、プラスチック製のカップやフォークなどを混ぜる。混合が適切に達成されていることを確認してください。
2. PDMS混合物をデシケーターに入れ、約30分間真空を適用してPDMS混合物から空気を除去する。デシケーター内の真空により、PDMS混合物から空気が除去されます。
   メモ:PDMSが流れ落ちる場合に備えて、デシケータの内側を組織で覆ってください。
3. PDMS混合物をチップモールドに注ぎます(約3〜5mmのPDMS層で十分です)。
4. PDMSで満たされた金型をデシケーターに戻し、真空をかけて残りの気泡を除去します。金型のすべての小さな構造から空気が除去されていることを確認してください。
5. 金型を65°C(金型材質によっては低い方)のオーブンに一晩入れて硬化させる。メスを使って型からチップを切り取ります。硬化したPDMSを、後で接着できるように、設計の周囲に十分なスペース(1〜2cm)で金型から切り取ります。取り出し時にチップが割れないように、PDMSを完全に切断してください。PDMSチップを慎重に持ち上げ、まずメスの鈍い端で、可能であれば手で持ち上げます。
6. パンチ入口および出口孔は、マイクロ流体チャンバの内側から出発して1mm生検パンチを使用した。
7. PDMSチップを圧縮空気で短時間清掃し、両面に粘着テープを貼ってPDMSやほこりの詰まった部分を取り除き、さらに使用するまで清潔に保ちます。
   注:チップは、さらに使用するまでこのように保持することができます。
8. スライドガラスを圧縮空気で拭きます。壊れないように注意してください。PDMSチップから粘着テープを取り外します。
9. プラズマオーブンを用いてチップをスライドガラスに接着する。以下の手順は、空気プラズマ用に最適化されています。
   注:ラボのプラズマオーブンのマニュアルを参照し、特定の実験の手順を最適化してください。
   1. チップとスライドガラスをプラズマオーブンに入れ、接合する側面を上に向けて置きます。
   2. プラズマオーブンに蓋をし、真空をかけながら所定の位置に保持し、真空が確立されるまで待ちます。
   3. ガスボタンを押して ガス をオンにし、約1分間待ちます(圧力は約0.37mbarでなければなりません)。
   4. ジェネレーターを押してプラズマを生成します(電源:9.0、時間:1分)。
   5. 終了したら、ポンプとガスをオフにします。換気してドアを開けます。
   6. 活性化された表面を互いに配置し、均等に圧力を加えることによって、チップをガラスに接着する。ガラスが割れないように注意してください。
      注:プラズマ処理が機能したことを確認するために、水テストを実行できます。ガラスの表面に水滴を置きます。プラズマ処理がうまくいけば、水滴を形成するのではなく、すぐに水が広がるはずです。
10. 接合したチップを65°Cのオーブンに5分間置く。
11. チップの露出側を粘着テープで密封し、ほこりが入口に入らないようにします。
    メモ:チップは使用時まで保管することができます。それまではテープで開口部を閉じる必要があります。

2. マイクロ流体実験の準備

注:マイクロ流体実験を実行するには、次の準備手順が必要です:まず、マイクロ流体実験を実行すると、入口から出口への流体の流れが作成されます。チップ内の穴は、入口からの圧力蓄積のために出口として機能します。したがって、使用しないすべての穴は閉じる必要があります。たとえば、チップに組織をロードするために使用される穴などです。これらが閉じていない場合、組織は流体とともに流出する可能性があります。これらの穴を閉じるために、PDMS充填チューブが使用されます。PDMS充填チューブは無期限に保管できるため、マイクロ流体実験ごとに個別に準備する必要はありませんが、より大きなバッチで作成できます。第2に、マイクロ流体実験の開始前に、実験に必要なチューブ、PDMS充填チューブ、およびチップを調製し、UV滅菌する。最後に、チップをフィブロネクチンでコーティングして、胚組織をガラス²⁵に付着させる必要があります。

1. PDMS充填チューブを作る。
   1. ±1 mのチューブを取ります。複数のチューブを取ることによって、より多くのチューブをPDMSで充填することができる。
   2. モノマーと触媒を9:1の比率(w:w)で混合して必要量のPDMSを調製し、重合を誘導する。
      メモ: プラスチック製のカップやフォークなど、使い捨ての工具を使用して混合します。適切に混ぜる。
   3. PDMS混合物をデシケーターに入れ、約30分間真空を適用してPDMS混合物から空気を除去する。
      メモ:PDMSが流れ落ちる場合に備えて、デシケータの内側を組織で覆ってください。
   4. 3 mL シリンジに PDMS を充填します。混合物中の気泡の形成を防ぐために慎重に充填する。
   5. 鉗子を使用して、22G針の先端をチューブに挿入します。
      メモ:チューブや指を針で穿刺しないように注意してください。
   6. チューブをPDMS充填シリンジに針を介して取り付けます。シリンジポンプを使用してチューブを充填し、流量は約500 μL/hです。ポンプの破損を防ぐために、高すぎる圧力をかけないように注意してください。
   7. チューブがPDMSで完全に満たされたら、15cmの皿に入れ、室温で(少なくとも一晩)硬化させます。
2. 実験用のチューブとチップを準備します。
   注:実験には、まず出口あたり約50cmのチューブ、2番目の入口あたり約2〜3mのチューブが必要です(正確なサイズは、後で使用するポンプ、インキュベーター、顕微鏡の空間構成によって異なります)。実験中に培養培地を_CO2 で平衡化するために、入口チューブは長くする必要があります。
   1. チューブを45°の角度で切断して、尖った端部を作成します。これにより、チューブをチップの穴に挿入することが容易になります。各入口チューブに針を 1 本取り付けます。ステップ 2.1.5 を参照してください。
   2. PDMS充填チューブを±1cmのプラグに切断します。尖った端が作成されるように45°の角度でカットします。これにより、チューブをチップの穴に挿入することが容易になります。チューブに取り付けられていない各穴を埋めるのに十分なプラグが必要です。
   3. チップから粘着テープを取り外します。
   4. 針が付いたチューブ、チップ、プラグをすべて皿に入れ、UV光に±15分間さらして滅菌します。UV滅菌の可能性のある任意の細胞培養フードを使用することができます。
3. フィブロネクチンによるチップのコーティング。
   注:後部PSMの2D エクスビボ 培養物の培養の場合、チップをフィブロネクチンでコーティングする。
   1. 室温でPBS + 1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むビーカーにチップを置きます。チップがPBSで完全に覆われていることを確認してください。チップをPBSでフラッシュし、P200ピペットで空気を除去します。
      注:チップへの空気の侵入を防ぐために、チップのさらなる取り扱いはすべて、実験の開始までこのビーカーで行われます。チップのスライドガラスを割らないように注意してください。
   2. PBS中の1:20フィブロネクチン2mLを準備し、ビーカーに充填する。
   3. チップの各チャンバーに3mLのシリンジをロードする。鉗子の場合は、22 G 針を出口チューブに挿入します。フィブロネクチンを含むシリンジに針を取り付ける。
   4. シリンジをシリンジポンプに接続します。チューブに空気が残らなくなるまで、チューブを洗い流します。
   5. コンセントチューブをチップのコンセントに取り付けます。チューブを底まで押してください。チップをコーティングするために低流量を設定します。他のすべての開口部は開いたままにしておくことができます。シリンジポンプを少なくとも2時間稼働させ、一晩実行することもできます。
   6. ポンプを停止します。針の直後にチューブを切り落とします。残りのチューブは、後の実験中に出口として機能します。

3. マイクロフルイディクス実験

注:ここでは、Notchシグナル阻害剤DAPTのパルスを適用することによる2D エキソビボ 培養におけるマウスセグメンテーションクロックの同伴のためのプロトコルが提示される。マウスセグメンテーションクロック(137分²⁵)の自然周期に近い130分の周期でパルスを印加すると、効率的な同伴が可能になります。培地の100分と2μM DAPTの30分のパルスが印加されます(図2A)。チップ内の薬物の存在は、蛍光色素を用いてモニターされる。この色素と蛍光シグナル伝達レポーターの励起スペクトルと発光スペクトルは、蛍光リアルタイムイメージング中のブリードスルーを防ぐのに十分なほど異なっていなければなりません。Notchシグナル伝達レポーターLuVeLu5(ルナティックフリンジ^- ヴィーナス-ルナティックフリンジ)のような黄色蛍光タンパク質をシグナル伝達レポーターとして使用する場合、色素カスケードブルーを適用することができる。蛍光色素とレポーターの他の可能な組み合わせを同定するために、自由に利用可能なスペクトルビューアを使用することができる。同伴の効果は、動的シグナル伝達^{レポーター5、10、32}のリアルタイムイメージングによって検出することができる。各チップには2つのインキュベーションチャンバがあります。これにより、薬物パルス(DAPT)と制御パルス(DMSO)を直接比較することができます。

1. 培地と脱気を作る。
   1. 実験当日に、50 mLの培養液を調製した(0.5 mMグルコース、2 mMグルタミン、および1% BSAを添加したDMEM-F12、マウス尾芽培養の詳細については²⁵参照)。
   2. 実験用の培地を充填した注射器を用意する。ビーカーで培養培地を調製する:Notchシグナル伝達振動を同伴させるために、1.2μLのDMSO+ 10μMカスケードブルーを含む6mLの培地を調製する。2 μM DAPT + 10 μM カスケードブルーを含む 6 mL の培養液;それぞれ6mLの培地を含む2本のチューブ。シリンジあたり少なくとも6mLの培地を使用してください。シリンジに媒体をロードする。薬物とDMSOを含む注射器に必ずラベルを貼ってください。
   3. PBS内のチップおよび媒体を含むシリンジをデシケーター内で脱気する。先端を上に向けてシリンジをビーカーに入れ、上部に空気が逃げることができるようにします。チップが浮いてもまだ泡で満たされていることがあります。これらは後で削除されます。
   4. P200ピペットを使用してチップからほとんどの気泡を洗い流す/吸い上げてみてください。空気が残っている場合は、次の実験中に除去されます。
   5. ポンプにシリンジを取り付け、シリンジに入口チューブを取り付けます。ノッチシグナリングを同伴させるには、2つのシリンジポンプを使用し、1つは媒体シリンジを運び、もう1つは薬物/ DMSOシリンジを運ぶ。実験開始まで、これをより高い流量(0.5 mL/h)で実行し、チューブから気泡を除去します。ポンプ内のシリンジの詳細(直径)を適切に設定するように注意してください。
2. チップへの組織の装填。
   1. マウス胚組織を解剖する。尾の最も後部の先端(尾芽)を解剖する。解剖した組織を培養液+25μM HEPESに入れる。
   2. P200 を使用して Hepes の培養液 + 25 μM HEPESでチップをフラッシュし、PBS を除去します。
   3. P200ピペットを使用して組織をチップにロードします(図1C)。チップに気泡を混入させないようにしてください。
      メモ: 効率的な読み込みには、ある程度の練習が必要です。組織が適切に配向していない場合は、慎重に吸い出してもう一度洗い流すことで、組織を回すことができるかもしれません。しかし、これはしばしば迅速な細胞死をもたらす。
   4. 各組織ローディングステップの後、PDMS充填チューブ片を使用して、対応する組織ローディング入口を閉じます。プラグが鈍いピンセットを使用してチップの底部まで十分に押し下げられていることを確認します。
   5. すべてのサンプルがロードされたら、鈍い鉗子を使用して、PDMSで満たされたチューブで未使用の入口/出口を閉じます。
3. マイクロ流体セットアップの組み立て。
   1. マイクロ流体ポンプの流量を下げます。60-100 μL/hはマウス胚の尾芽によく作用します。より高い流速では、細胞死が観察された - おそらく細胞剪断が高すぎるためである。複数のポンプの累積流量は、所定の時間にマイクロ流体チャンバあたり60〜100μL/hを超えてはなりません。
   2. チューブをマイクロ流体チップに取り付けます。チップ内に気泡が入らなくてもこれを行います(これは、チューブの端に媒体の滴が存在することを確認することによって達成できます)。フィブロネクチンコーティングからの出口は依然として存在する(2.3参照)。
   3. すべてのチューブがチップに取り付けられたら、ビーカーから取り出して適切に乾燥させ、皿に入れ、これを約1.5mの入口チューブと一緒にインキュベーター(37°C、20%_O2、5%_CO2)に入れて一晩培養します。チューブはガス透過性です。これにより、培地中のO2と_CO2の平衡化が可能になります。あるいは、同時蛍光リアルタイムイメージングのために、チップと約1.5mの入口チューブを顕微鏡に直接配置します。標準の96ウェルプレートホルダーに収まるチップ用のホルダーは、補足ファイル3に記載されています。
      注:インキュベーション中は湿度が十分に高いことを確認してください。必要に応じて、湿った組織をイメージングチャンバーまたはインキュベーターに追加して、マイクロフルイディクスセットアップでの蒸発を防ぎます。顕微鏡インキュベーター内の湿度が低すぎると、チューブおよびマイクロ流体チップ内に気泡が形成される。チップとチューブが置かれた閉じたイメージングボックスを使用することができます。このようなイメージングボックスを作る最も簡単な方法は、チップの上に大きな蓋を置き、ウェットティッシュを追加することで、完全に閉じる必要はありません。ポンプとチップの高低差が大きすぎないことを確認し、必要に応じて重力による気泡の発生を防ぐためにゆっくりと高さを変えてください。
   4. セットアップが最終的な位置に置かれた後、すべてのポンプを20 μL/hの流量で20分間流します。チャンバとポンプの高さが移動している可能性が高いため、チューブ内の正しい圧力を再確立するために必要です。
   5. 薬剤ポンプの電源を切り、実験/リアルタイムイメージングの開始まで、培地ポンプのみを60 μL/hで稼働させます。
4. 実験の開始。
   1. 実験用に計画されたポンピングプログラムを開始します。Notchシグナル伝達を同伴させるには、100分間の培地パルスと30分間の薬物パルスのポンピングプログラムを使用し、実験が終了するまで、通常は24時間繰り返す。
      メモ:任意のプログラム可能なマイクロ流体ポンプを使用できます。最も簡単なフォーマットでは、ポンプを手動でプログラムして起動することができます。あるいは、ポンプは、コンピュータソフトウェアによって制御することができる。
   2. リアルタイムイメージングを行う場合は、30分以上経過してからイメージングを開始してください。これにより、チップの温度をインキュベーター内の温度に調整し、イメージング中のドリフトが強すぎるのを防ぐことができます。オートフォーカスはまだ有益です。
   3. 倒立顕微鏡を用いてチップのスライドガラスを介して標準的な共焦点イメージングを行う。10 分のイメージング間隔を使用して、130 分の周期でシグナリング振動を十分に検出します。
   4. 期間を短くする場合は、十分なサンプリングを行うために間隔を短くします。カスケードブルーを検出するための低解像度イメージングトラックを含めて、チップ上の薬物の存在を視覚化します。
   5. 金星レポーターの励起には、波長960nmの515nmレーザーまたは2光子レーザーを使用してください。
   6. 20倍の平面目標(解像度512 x 512ピクセル、1.38 μm/ピクセル)を介して、距離8 μmの6~8平面のzスタックを取得します。電動ステージを使用して、1回の実験で複数のサンプルをイメージングします。
   7. カスケードブルーを405 nmレーザーで励起し、10分ごとに1つのzプレーンを集録します(解像度32 x 32ピクセル、22.14 μm/ピクセル)。
      注:イメージングおよび画像解析の詳細については、代表的な結果を参照し、参考文献¹⁰を参照してください。

結果

このプロトコルを用いて、マイクロフルイディクスを用いてマウスセグメンテーションクロックのシグナリング発振の外部同伴のための方法が提示される。Notchシグナル阻害剤のパルスを印加することにより、独立した胚培養におけるシグナル伝達振動が互いに同期する¹⁰。このシステムを適用してセグメンテーションクロックの機能を研究するための前提条件は、シグナリングダイナミクスとセグメンテーションがまだオンチップに存在することです。WntおよびNotchシグナル伝達ダイナミクスの両方が、一定の培地流にもかかわらず維持され、物理的境界形成が末梢2D培養において持続し、前部^PSM10を表すことが以前に示された。

外部薬物パルスへのシグナル伝達振動の同伴を確認するために、例えば、黄色蛍光タンパク質Venusを発現するNotchシグナル伝達レポーターLuVeLu5のリアルタイムイメージングが、マイクロ流体実験中に行われる。チップ上の2D培養物の向きを制御することは困難であるため、前部組織におけるシグナル伝達振動が解析される。2D培養の周辺を再現性よく検出することができる。オンチップの組織切片の向きは自由に制御することができず、チップの内面全体がフィブロネクチンでコーティングされます。したがって、培養物がチップの側面または天井に付着することが時折起こる。サンプルが視野外(x、y、z方向)に移動する場合、またはテールの後端が下を向いて付着する場合、一般にこれらのサンプルは除外されます。

さらなる分析のために、そのような同伴実験の複数が組み合わされる。独立した実験は、色素カスケードブルーによって可視化された薬物パルスのタイミングを約400nmで使用して、互いに整列させることができる。同期を解析して視覚化するには、定量化された振動のトレンドを下げて(図2B、D)、平均として表示し、振動の標準偏差または位相を計算することができます。これにより、独立した後胚培養物の振動同士および外用薬剤パルスとの間の位相関係の解析が可能になる(図2C、E)。Pythonベースのプログラム^pyBOAT33は、このようなシグナリング振動の周期、位相、振幅を決定するための簡単でユーザーフレンドリーなツールです。同伴を確認するために、例えば、内因性シグナル伝達振動の周期を決定することができる。周期が130分のパルスを印加すると、Notchシグナリング振動も130分の周期を示します(図2F)¹⁰。さらに、カスケードブルーパルスを使用して、異なるシグナリングレポーターによる独立した実験を互いに整列させることができます。このようにして、複数のシグナリングレポーターの振動間の位相関係を間接的に決定することができます¹⁰。

したがって、提示されたマイクロ流体系は、発達中のマウス胚のエクスビボ培養におけるシグナル伝達振動の制御を可能にする。セグメント形成と分化のためのマーカーのイメージングと組み合わせて、このシステムは、セグメンテーションクロックのシグナル伝達経路がどのように相互作用し、それらがソマイト形成をどのように制御するかを解剖するために適用することができるようになった。

図1:マイクロフルイディクスプロトコルの概略概要(A)チップモールドは、コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して設計できます。マウスセミトジェネシスのエクスビボモデルにおいてシグナル伝達振動を同伴するチップ設計が提供される。金型は、例えば、3D印刷によって生成することも、注文することもできます。マイクロ流体チップは、PDMSの成形によって製造される。硬化したPDMSチップを切り出し、プラズマオーブンを用いてスライドガラスに共有結合で接着する。チップ内のガラス表面はフィブロネクチンでコーティングされ、解剖された組織が付着することを可能にする。胚組織は、ローディングインレットを介してチップにロードされ、その後閉じられる。異なる媒体条件のポンプがチップの入口に取り付けられ、フロープログラムが初期化されます。組織は、実験中に共焦点顕微鏡を用いて画像化することができる。(Kymographs adapted from Sonnen et al., 201810.クリエイティブ・コモンズ表示CC BY-NC-ND 4.0に従ってセルから転載および修正されました。(b)マウス後胚組織のオンチップ培養のための鋳型設計の模式図。マイクロ流体チャネルの高さは500μmであり、後胚性マウス尾部の培養に十分である。この金型を印刷するファイルは補足ファイル 1 に提供され、代替ファイルは補足ファイル 2 に示されています。(C) PDMSピラーで囲まれたE10.5断面マウステールの明視野画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マイクロ流体実験からの代表的な結果。シグナル伝達経路モジュレーターのパルスは、マウス胚のエクスビボ培養に適用され、シグナル伝達振動は、動的シグナル伝達レポーター(例えば、Notchシグナル伝達レポーターLuVeLu5およびWntシグナル伝達レポーターAxin2T2A10)のリアルタイムイメージングによって視覚化され得る。破線は、時間の経過に伴う解析に使用される領域を示します。(B-F)LuVeLuレポーター振動は、Notchシグナル阻害剤DAPTの周期パルスによって同伴される。(B、D)DAPTまたはDMSO制御を用いた巻き込み時の前方PSMにおけるNotchシグナル伝達振動の定量化。(C,E)ノッチ信号発振の位相と外部DAPT/DMSOパルスのタイミングとの間の位相-位相関係プロット。同伴の場合、安定した位相関係が確立される。(F)DMSOおよびDAPTパルスで同伴されたサンプルを比較するレポーター振動の平均周期およびSEMの定量化。(Sonnenet al.、201810から適応された図。Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0に従ってセルから転載および修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

問題	推奨される解決策
PDMSはガラスに接着しません。	- PDMSとガラスの両方がきれいであることを確認してください。
	- チャンバーの周りに接着するのに十分なPDMSがあることを確認してください。
	- プラズマオーブンの設定を最適化します。
私のチップに気泡があります。	- ポンプがオンになっているかどうかを確認してください。
	- チップに組織をロードする前にチップを脱気してください。
	・実験開始前に培地を脱気する。
	- インキュベーションチャンバ内の湿度が十分に高いことを確認してください。
組織は実験の開始時に死ぬ。	- チップのロードと組み立て時にHEPESを媒体に追加してください。
	- ローディング中に組織を頻繁に出し入れしないでください。
	- 流量が高すぎないことを確認してください。
組織はイメージング中に死ぬ。	- イメージングから光毒性がないことを確認してください
	- 汚染がないことを確認してください。
	- 流量は高すぎないようにしてください。
イメージング中にフォーカスが変わります。	- イメージング中にオートフォーカスを使用して、イメージングスライドのドリフトを調整します。
	- チップを顕微鏡内の温度に少なくとも30分間平衡化させます。
アウトレット/インレットがデタッチされます。	- すべてのチューブを底まで完全に押し下げます。
チップのガラスが割れます。	- より注意してください、ガラスは非常に壊れやすいです。
	- 薄いガラスは、イメージングにのみ必要です。撮像を行わない場合は、通常のより厚いスライドガラスを使用することができる。
	- ブレークがチップの外側にある場合は、問題ない可能性があります。チップへのガラスシールが破れてしまうと液体が漏れて空気が入ってきます。
チップに汚染があります。	- 培養液に抗生物質を加える。
	-すべての機器とチューブを滅菌します。
	- 迅速かつクリーンに動作します。

表1:トラブルシューティング

補足ファイル1: 3Dプリンタで金型を印刷するためのSTLファイル。この鋳型は、後胚組織のオンチップ培養用のマイクロ流体チップを生成するために使用される( 図1に示す設計)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2: 3Dプリンタでモールドを印刷するためのSTLファイルは、後胚組織のオンチップ培養用のマイクロ流体チップを生成する。 補足ファイル 1および 図1に示す設計とは対照的に、この設計には、少量の空気がメインマイクロ流体チャンバに入るのを防ぐために、すべての入口にバブルトラップが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3: チップを顕微鏡に配置するためのホルダーを生成するための設計ファイル。このホルダーは96ウェルプレートの寸法を持ち、ほとんどの顕微鏡の標準ホルダーに収まるはずです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

シグナル伝達ダイナミクスが多細胞系をどのように制御するかは、この分野で長年の問題でした。機能調査は、これらのダイナミクスを微妙に変調してこれを可能にする必要があるため、重要な課題を提起し^ます11。経路摂動に対するこのような時間的制御は、原理的には光遺伝学を用いて達成することができ、これはまた、高い空間的制御を可能にする³⁴。しかし、光遺伝学は、問題の各シグナル伝達経路の解析のための洗練された遺伝的ツールの確立を必要とする。ここで説明する現在のプロトコルは、あらゆるシグナル伝達経路の摂動のための非常に汎用性の高いツールを提供します。マイクロフルイディクス実験により、時間的に制御された薬物パルスを適用して、組織培養におけるシグナル伝達経路のダイナミクスを機能的に調査することができます。ここでは、 ex vivo 培養におけるソミトジェネシスの研究に焦点を当てていますが、プロトコルは他のモデル系に適合するように適合させることができます。

プロトコルの特定のステップは、マイクロ流体実験を成功させるために重要です(表1に要約)。主なポイントは、以下のとおりです。実験の過程で培地の流れのために、組織培養はせん断応力を経験する。モデルシステムを連続的な流れにさらすと、細胞ストレスが発生し、極端な場合にはせん断効果による細胞死を引き起こす可能性があります。マウスの尾芽のエクスビボ組織培養および現在のチップ設計では、60 μL/h(最大100 μL/h)の流量が最小限のせん断効果でうまく機能することが見出された。同じチップに対して複数のポンプを同時にオンにする場合は、総流量が増加しないように、個々のポンプの流量を適宜調整する必要があります。現在のプロトコルを他のモデルシステムやチップ設計に適合させると、流量を最適化する必要があります。あるいは、培地を連続的にフラッシュするのではなく、チップ³⁵上の培地を定期的に変更することができる。このようなセットアップは、マウスのソミトジェネシスにおけるシグナル伝達振動の制御にも適用することができる(未発表、データは示さず)。さらに、組織培養物が直接流体の流れにさらされるのではなく、薬物が隣接するチャネルからの拡散によって組織に到達するというセットアップも想定され得る。このようなシステムは、ESC分化のin vitroモデルに成長因子の勾配を適用するために首尾よく使用されている^14,36。

マイクロ流体実験の大きな課題の1つは、実験中にチップ上で気泡が発生することです。チップまたはチューブ内の気泡は、チップ上の均一な液体の流れを妨げ、その場所から胚培養物を除去することにつながる可能性がある。気泡の存在を防ぐためには、プロトコルの様々なステップが不可欠である。まず、シリンジ内の培養液およびマイクロ流体チップ自体を、デシケーターを用いて脱気しなければならない(ステップ3.1.3)。第2に、サンプルをローディングインレットにロードするときは、サンプルと一緒にチップに空気を配管しないように注意する必要があります(ステップ3.2.3)。第三に、チューブに媒体を充填するときは、チップを取り付ける前にすべての気泡を汲み出す必要があります(ステップ3.3.2)。さもなければ、これらの気泡は実験中にメインチップに押し込まれます。最後に、実験の間、培地は、半透チューブのために画像化チャンバまたはインキュベーター内で平衡化される。チューブの透過性はまた、媒体の蒸発を可能にするので、チューブ内の新しい気泡の形成を防ぐために、実験中に湿度が調節されていることを確認してください。

一般に、マイクロフルイディクスは、研究者の特定の質問に適応できる非常に汎用性の高いツールです。現在の設計アプローチでは、チップあたり最大 12 個のex vivo 培養物を並列にイメージングできます。この数は、主に実験ごとの胚の数と、各胚培養物を十分な解像度で画像化するのにかかる時間によって制限されます。1回の実験で複数の条件を比較する必要がある場合は、1枚のスライドガラスに複数のチップを取り付けることができます。複数の組織外植体を並行してイメージングするのに理想的なチップ設計が提供されていますが、パーソナライズされた設計により、サンプル数の制限を克服して高スループット分析を可能にし、1回の実験でより多くの条件の組み合わせを増やすことができます^16,17。マイクロフルイディクスはチップ上で培養できるモデルに限定されており、オンチップ培養はモデルシステムごとに個別に最適化する必要があります^27,37,38。

過去5〜10年間、マイクロフルイディクスは、ハイスループットアプローチの可能性とシグナル伝達ダイナミクスとグラジエントの微妙な変調のために、さまざまな生物学的問題に対処するために適用されてきました。今日、マイクロフルイディクスは、実験室が容易に確立できる、簡単に適用でき、安価で汎用性の高いツールとなっています。ここで、現在のプロトコルは、特定のアプリケーション、すなわち、ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達ダイナミクスを研究するために最適化される。組織生物学における個々の研究課題に合うようにこのプロトコルと設計を適応させるのは簡単です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 mLシリンジ	ベクトン、ディキンソン、および会社	300912
184 シリコン エラストマー硬化剤	SYLGARD	1673921
184 シリコン エラストマー PDMS	シルガード	1673921
3 ml シリンジ	ベクトン、ディキンソン、および会社	309657
粘着テープ			スコッチマジックテープまたは類似のもの
鈍い先端の鉗子 Bochem 18/10 ステンレス鋼	フィッシャーサイエンティフィック	10663341
ウシ血清 アルブミン 凍結乾燥 pH~7	Biowest	P6154
圧縮空気システム
結晶化皿	VWR	10754-7	滅菌済み
D-(+)-グルコース 45%	シグマ	G8769
デシケーター	VWR	467-0104
使い捨てカップ	Duni	173 941
使い捨てフォーク	ステープル	511514
解剖装置
DMEM/F12	細胞培養技術	カスタム	DMEM/F-12、フェノールレッドなし、L-グルタミンなし、グルコース
なし フィブロネクチン	シグマ	F1141-5MG
フローフードBioVanguard Greenline	CleanAir by Baker	511514	UV光源用
ガラススライドNo 1.5H高精度、70x70 mm	Marienfeld	107999098
HEPESバッファー	Gibco	15630-056
L-グルタミン	Gibco	25030024
顕微鏡	ライカ	ライカ SP8 MP
針 22G	ベクトン、ディキンソン、会社	z412139-100EA
オーブン	VWR	390-09
PBS0
ニシリンストレプトマイシン	Gibco	15070063
プラズマオーブンフェムト	ディーナー電子
パンチ&オスラッシュ; 1mm	ユニコア	WB100073
スケール	ザルトリウス	エントリス
シリンジポンプ	WPI	AL-4000
チューブ & オスラッシュ; 1mm	APT	AWG24T
真空ポンプ	VWR	181-0308