方法論記事

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

DOI：

10.3791/62328

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2021年11月13日

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1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、蛍光レポーターと細胞分類を使用して、マクロファージおよびT細胞株におけるノックイン実験を簡素化します。これらの単純なノックイン実験、すなわちCRISPR/Cas9-およびDsRed2発現プラスミドと、免疫細胞内の Rosa26 遺伝子座に永久に統合されたEBFP2を発現する相同組換えドナープラスミドの2つのプラスミドが使用されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫系の機能ゲノミクス研究は、標的遺伝子の欠失と目的のタンパク質への要素の追加の両方を含む遺伝子操作を必要とする。細胞系モデルにおける遺伝子機能の同定は、細胞固有のメカニズムの遺伝子発見と探索に重要である。しかし、特に静止状態では、これらの細胞のトランスフェクション効率が低いため、CRISPR/Cas9を介したノックインを用いたT細胞やマクロファージ細胞株などの免疫細胞の遺伝子操作は困難である。免疫細胞の遺伝子を改変するために、薬物耐性選択およびウイルスベクターは、通常、CRIPSR/Cas9系を発現する細胞を濃縮するために使用され、必然的に細胞の望ましくない介入をもたらす。以前の研究では、エレクトロポレーション後に一時的に発現したCRISPR/Cas9に結合した二重蛍光レポーターを設計しました。この技術的なソリューションは、免疫細胞の迅速な遺伝子欠失につながります;しかし、薬剤耐性選択やウイルスベクターを使用しないT細胞やマクロファージなどの免疫細胞における遺伝子ノックインはさらに困難です。本稿では、細胞選別を用いて、ドナープラスミドと組み合わせて Rosa26 遺伝子座を標的とするCRISPR/Cas9構築物を一時的に発現する細胞の選択を支援することで、薬剤耐性濃縮のないT細胞とマクロファージの両方で遺伝子ノックインを達成できることを示す。一例として、現在のCovid-19大流行を担うSARS-Cov-2の受容体であるヒトACE2を、ノックイン実験を行ってRAW264.7マクロファージで発現させる方法を示す。このような遺伝子ノックイン細胞は、幅広く、機械研究に使用することができる。

概要

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免疫細胞は病原体に対する防御に不可欠です。感染者のクリアランスと組織恒常性の維持のためには、自然免疫と適応免疫の両方が必要です1,2.細胞株モデルは、哺乳類の免疫系の分子基礎を理解するための不可欠なツールです。それらは、ヒトT細胞活性化をモデル化するもののようなインビトロ機能アッセイにおいて用いられ、免疫応答を活性化または減衰させる遺伝的要因の機能を決定する際に3、4。哺乳類の免疫系は非常に異質であり、同様に重要な、膨大な数の分子が、所定の細胞型5、6の分化、移動、および機能を制御することに注意することが重要である。

クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR)/Cas9ゲノム編集ツールは、特定の細胞タイプの遺伝子操作を可能にし、遺伝子の機能的注釈を正確な方法7,8に容易にする。いくつかの公表されたプロトコルは、HEK293細胞におけるリボヌクレオタンパク質(RnPs)として知られているCas9ガイドRNA複合体の形態でCRISPR/Cas9の送達を説明している、ジュルカット細胞株、原発性T細胞9、10、マクロファージ11、12、13、幹細胞14、および他の15、16。これらのプロトコルにおいて、遺伝子タグ付けは、通常、内因性タンパク質17,18に蛍光タグを融合させることによって達成される。しかし、単一細胞選別に対応する二重蛍光レポーターを用いて、特に免疫細胞におけるノックイン実験19,20を容易にする試みがなされている。

免疫細胞における新しい遺伝的因子の機能を理解することを目的とした詳細な機械分析は、一般的に遺伝子の細胞型特異的な欠失、遺伝子救助実験、および理想的には、そのインターアクターの同定を必要とする。免疫細胞の遺伝子の遺伝的欠失の最適化方法は9、15、21に公表されているが、免疫応答を理解するために多目的な機能を持つノックイン対立遺伝子を導入する方法ははるかに少ない報告を受けている。したがって、このプロトコルでは、ヒトおよびマウスの両方の免疫細胞株において、目的のタンパク質(POI)を安全な港のLocus Rosa26で発現させる効率的で再現性の高いプロトコルを詳細に記述することを目指しています。CRISPR/Cas9(DsRed2)を発現するプラスミドを導入した細胞に対して、細胞選別で分離できる組換えDNAテンプレート(EBFP2)を用いて濃縮する2色レポーターシステムを設計しました。このプロトコルに従って、我々は、研究が不十分なタンパク質の機能解析のためにヒトT細胞株JurkatとマウスマクロファージRAW264.7の複数のノックインラインを得た。

一例として、このプロトコルでは、ヒトACE2(SARS-Cov-2の受容体)を安定的に発現するマクロファージRAW264.7マクロファージを安定的に得る方法を本プロトコルで示す。自然免疫細胞は、Covid-1923、24およびヒトACE2の病因に関与しているため、複製前に細胞へのウイルス侵入に必要な主要な受容体とみなされるため、ヒトACE2のノックインを伴うマクロファージは、マクロファージ内のウイルス増殖の機械化研究に有用なツールとして役立つ。また、ヒトROSA26遺伝子のノックイン例を、アミノ末でアフィニティツインストレップタグ(OST)と融合したRASGRP1タンパク質を発現させる例も紹介しています。T細胞は免疫療法における主要な標的細胞であり、癌25,26に対する応答性の操作に焦点を当てた研究が増えている。Rasgrp1はT細胞受容体の下流にある重要なシグナル伝達分子であることが知られており、そのインターアクターは27を十分に解明されていないので、OST-RASGRP1ノックインモデルは、T細胞の腫瘍および感染に対する応答を調節する界発体を同定するための基盤を提供する。これらのツールを組み合わせることで、Covid-19の研究やRasgrp1と相互作用する新しい分子の発見に使用できます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rosa26遺伝子座を標的としたsgRNAの設計とプラスミド構築

  1. 目的の挿入部位の周りの設計ガイドのRNA
    1. マウスRosa26の挿入部位 (以下、mRosa26と指定される) ノックイン実験がmRosa26の最初のイントロンに位置していることを確認します。このサイトは、以前の研究で使用されています28,29.ヒト細胞におけるノックイン実験の場合、挿入部位が、mRosa2630のヒト同族体として同定されたヒトROSA26遺伝子座(以下、hROSA26と呼ばれる)に存在することを確認する。
    2. マウスゲノム情報学(http://www.informatics.jax.org/)とEnsemblゲノムブラウザ(http://www.ensembl.org/index.html)から得られたマウスとヒト種のゲノム配列をそれぞれ使用します。所望の挿入部位を横取る各側のmRosa26 または hROSA26 軌跡のゲノム配列の50塩基対(bp)をコピーする。
    3. オンライン Web ツール CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31を使用して設計ガイド RNA .1.1.2 から入力シーケンスの 100 bp を貼り付けます。高い特異性スコア、高効率スコア、および低いオフターゲットアクティビティを持つ2つのガイドRNAを選択します。さらに、より高いDoenchスコアを持つRNAガイドを選択し、「非効率的」32としてラベル付けされたものを避ける。
      注: 代替 CRISPR デザイン ツールは貴重で、一般に公開されている、たとえば、ベンチリング CRISPR デザイン ツール (https://benchling.com/crispr) です。CRISPR/Cas9媒介性ノックイン変異細胞の周波数を増加するには、可能な場合は、目的の挿入部位に近い2つのガイドRNAを選択します。
    4. mRosa26遺伝子座の場合は、mR26-sg1 (5'- CTCCACTCtTCTAGAAGAT -3') および mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAGAGAC -3') として指定された 2 つの隣接するガイド RNA を使用します (図 1A)。hROSA26遺伝子座の場合、2つの隣接するガイドRNA、すなわちhR26-sg1(5'-GGCGATGAGCATCACGCG -3')およびhR26-sg2(5'-AATCGAGAGCGCGCGCgACA-3')を使用します(図1B)。
      注: mR26-sg1 および mR26-sg2 のゲノム編集活動と hR26-sg1 および hR26-sg2 のゲノム編集活動は、それぞれ RAW264.7 細胞およびジュルカット細胞で評価されました ( 補足ファイル、 図 S1を参照)。
  2. Rosa26遺伝子座を標的とするsgRNAを含むCRISPR発現ベクターのクローニング
    1. 1つのガイドRNAの前方および逆オリゴを合成する( 補足ファイルを参照)。
      注: U6プロモーターによって駆動される発現に役立つガイド配列の開始に'G'ヌクレオチドを追加することが好ましいです。例えば、前述のmR26-sg1をクローン化するために、フォワードオリゴはCACCGCTCCAGTTCTAGAAGAGAT及び逆オリゴがAAAACATCTTCTAGAAGACTGGAGCである。フォワードオリゴの追加Gと逆オリゴの補数は太字で示されています。
    2. ガイドRNAに対応する合成オリゴを、Zhangの研究室(https://www.addgene.org/crispr/zhang/)が開発したgRNAクローニングの一般的なプロトコルを使用して、前作21(図1C)で生成された全1個のCRISPR発現ベクターpX458-DsRed2にクローン合成オリゴを作製する。ただし、ゲル精製ステップをスキップし、PCR精製キットを使用して消化されたベクターを精製します(材料表を参照)。
      注: 以前のプロトコルでは、BbsI消化ベクターのゲル精製が行われました。ただし、この手順には時間がかかります。本プロトコルでは、消化された生成物をPCR精製キットを使用して精製し、下流のライゲーション反応に直接使用し、一般に同等の効率で正のコロニーを生成する。
    3. ライゲーション製品(ステップ1.2.2)の10 μLを、メーカーの指示に従って、大腸菌 DH5αコンピテントセルの50 μLに変換します。ランダムにアンピシリン(100 μg/mL)とLB寒天プレートから3コロニーを選び、一晩培養するためのアンピシリンでLB培地の3mLにそれぞれを接種します。
    4. サンガーシーケンシングに一晩細菌培養液の1 mLを使用し、残りを4°Cに保ち、構築物が正しいことが確認されるまで:pDsR-mR26-sg1およびpDsR-mR26-sg2は mRosa26 遺伝子座ノックイン、 hROSA26 遺伝子座の pDsR-hR26-sg1 および pDsR-hR26-sg2 を示す。
    5. トランスフェクショングレードのプラスミドを精製するためのマキシプレップキットで高濃度のプラスミドDNA(約2μg/μL)を調製します( 材料表を参照)。

2. 相同組換えテンプレートとしてのターゲットベクターの設計と構築

  1. 相同性指向の修復テンプレートを設計する
    1. CAGハイブリッドプロモーター、POIのcDNAのクローニングを許可するAscI制限部位、IRES-EBFP2レポーター、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化(bGH-polyA)シグナル(図1Bおよび補足ファイル)を含む、以前の研究29から最適化された発現カセットを使用してPOIを構成的に発現させる標的ベクトルを設計する。
    2. mRosa26またはhROSA26遺伝子座のゲノム配列と相同性を共有するデザイン相同性アーム(HA)。カセットの左側に所望の挿入部位から上流ゲノム配列に対応する5'HAの〜1kbを含む。同様に、発現カセットの右側に挿入部位から下流ゲノム配列に対応する3'HAの〜1kbを含む。
      注:式カセットは、CRISPR / Cas9切断部位34にできるだけ近くに挿入されます。CRISPR/Cas9による標的アレルの再切断を避けるために、標的ベクトル34,35にプロトススペース隣接モチーフ(PAM)配列(5'-NGG-3')にヌクレオチド変化を組み込む。
    3. ターゲットベクトルの線形化を可能にするために、5'HAのすぐ上流にあるユニークなEcoRIサイトと、3'HAのすぐ下流にあるユニークなBamHIサイトを挿入します。
    4. 市販ベンダーがターゲットベクターを合成し、それぞれmRosa26 および hROSA26ノックイン用 pKR26-iBFP および pKhR26-iBFP として指定します。
  2. 相同性指向の修復テンプレートとしてターゲットベクターを構築する
    1. POIを発現させるために、EnsemblゲノムブラウザからcDNA配列(コード配列)を取得し、最も長いタンパク質配列を有する転写産物を選択します。例えば、ヒト ACE2 遺伝子のcDNAはACE2-202 ENST0000427411.2であり、ヒト RASGRP1 遺伝子のcDNAはRASGRP1 ENSG00000172575である。
    2. 商用ベンダーの助けを借りてPOIのcDNAを合成します。また、PCR増幅を介してcDNAをクローン化することも可能です(ここでは説明しません)。cDNAの停止コドンの後に、CDNAのATG開始コドンと別のAscI制限部位(5'-GGCGCGCC-3')の直前に、AscI制限部位(斜体および太字)およびコザックコンセンサス翻訳開始部位(下線付き)を含むGGCGCGCCACC(5'-3')の配列を置く。
    3. AscIで合成された配列を消化し、制限消化後のDNA断片を精製するために設計されたPCR精製キットを使用して、製造業者の指示に従って精製する( 材料表を参照)。
    4. 精製されたcDNAインサートを、メーカーの指示に従ってT4 DNAリガーゼを使用して、AscI線形化されたバックボーンベクターpKR26-iBFPまたはpKhR26-iBFPにリゲートします。
    5. シーケンシングにより、最終的なターゲットベクトル pKR26-POI-iBFP または pKhR26-POI-iBFP を検証します。maxiprep を使用して、製造元のプロトコルに従って検証済みの構成を浄化します。
    6. EcoRI または BamHI を使用してターゲットベクターを消化し、製造者の指示に従って PCR 精製キットを使用して消化産物を精製します。線形化されたターゲットベクター(約0.8 μg/μL)を-20°Cでエレクトロポレーションまで保存します。

3. マクロファージとT細胞株のエレクトロポレーション

  1. エレクトロポレーションのための細胞培養を準備する
    1. ジュルカットT細胞の完全な成長培地として10%胎児ウシ血清(FBS)を補充ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640を準備します。RAW264.7マクロファージを培養するための10%FBSでダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)を準備します。細胞の選別前にトランスフェクション後の培養に使用された媒体を除き、100 U/mLペニシリンと100 μg/mLストレプトマイシン(ペン/ストレップ)を使用して、すべての完全な成長培地を補います。
    2. サプライヤーの指示に従ってRAW264.7およびJurkat T細胞のサブカルリングを実行します ( 資料表を参照)。RAW264.7細胞をサブカルテリングする場合は、トリプシン-EDTA溶液(0.25%)を使用して細胞を取り外します。RAW264.7およびJurkat細胞の凍結保存媒体として10%(v/v)DMSOを添加したFBSを使用してください。
    3. 250×gで、RAW264.7マクロファージの場合は5分間、ジュルカットT細胞では8分間90×gの細胞を収集します。その後、5~10mLのDPBS×(Ca2+またはMg2+イオンを使用しない)で洗浄します。DPBS を削除します。
    4. 2 mLの1×DPBSを用いて細胞ペレットを再懸濁する。細胞の10 μLを使用し、0.2%のトリパンブルーの等しい体積と混合して、細胞数と生存率を推定します。
      注:細胞培養がトランスフェクションの日に>90%生存率を有することを確認してください。
    5. 1回のノックイン実験では、5回繰り返しの10 μL核の先端でエレクトロポレーションを行います。2.0 × 106 細胞に必要な体積を計算し、遠心分離によって細胞をペレットします。ステップ3.1.3で説明したように、1×DPBSで細胞ペレットを再度洗浄する。
      注:10 μL核の切除チップを使用する場合、4.0 ×105個の細胞がエレクトロポレーションごとに必要となります。したがって、1回のノックイン実験のために少なくとも2.0×106細胞を調製する。
    6. ペン/ストレップなしで完全な成長培地(ステップ3.1.1で準備される)の0.5 mLと24ウェルプレートを準備し、37°Cインキュベーターでプリウォーム。
  2. CRISPR/Cas9成分のエレクトロポレーションとターゲティングベクター
    1. エレクトロポレーションシステムをオンにします。以前の研究で最適化されたエレクトロポレーションパラメータを使用します 21: 1,400 V / 20 ms/2 パルス RAW264.7 マクロファージと 1350 V/20 ms/2 パルス Jurkat T 細胞のパルス.
    2. ピペットによるサンプル損失を考慮し、各CRISPR/Cas9ベクターの2.5 μg、2.4μgの線形ターゲリングベクター、およびリサスペンションバッファRを含む無菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに55 μLエレクトロポレーション混合物を調製します。
      注:時間を節約するために、エレクトロポレーション混合物は遠心分離の間に準備することができます(ステップ3.1.5)。
    3. ステップ3.2.2から55 μLエレクトロポレーション混合物中に2.0×106細胞(ステップ3.1.5で調製)を再懸濁します。
    4. ピペットを用いた10 μL核の核の先端を使用してステップ3.2.3から細胞/エレクトロポレーション混合物を吸引する。
      注:ピペッティング中に、エレクトロポレーションの障害を引き起こす可能性のある気泡の導入は避けてください。
    5. エレクトロポレーションキットから3 mLのバッファEを充填したチューブにサンプルを追加します。
    6. ステップ 3.2.1 で説明したように、2 つのセルタイプのエレクトロポレーション パラメータを適用します。
    7. ステップ3.1.6からプリウォームされた媒体と24ウェルプレートの1つの井戸にサンプルを移します。
    8. 他の 4 つの繰り返し、およびターゲットベクトルのみおよび CRISPR 発現ベクトルのみのコントロールに対して、手順 3.2.4 ~ 3.2.7 を繰り返します。
      注:別の細胞タイプ/プラスミドDNAに切り替えるときに核切除チップとチューブを交換してください。
    9. 48-72時間のトランスフェクト細胞を培養し、フローサイトメトリー分析または蛍光活性化細胞選別(FACS)の前にCRISPR/Cas9成分のエレクトロポレーションおよび発現後の回復を可能にする。トランスフェクション後24時間で赤色チャネルを搭載した蛍光顕微鏡を用いてDsRed2の発現を調べてください。
      注:DsRed2蛍光セルを監視する利点は、エレクトロポレーションの効率を推定することができ、さらなる細胞分類に対する適合性を予測できることです。

4. 推定ノックイン細胞を分離する細胞の並べ替え

  1. FACSの選別前に、トランスフェクトされた細胞を完全な増殖培地で1回洗ってください。ステップ3.1.3に記載した遠心分離によるペレット細胞を、ペレットを500μLの新鮮培地で再懸濁した。
  2. 85 μmノズルと低流量のセルソーター(バイオセーフティキャビネットに設置)を設定します。ソートのための「単一セル」モードを選択し、96ウェルマイクロプレートのカバーに20〜30セルをソートすることによって、単一セルの並べ替え効率と精度をテストします。各ウェルの中央に局在する1つの液滴は、機器の適切なセットアップを示します。
  3. ステップ4.1から無菌FACSチューブに細胞懸濁液を移し、SYTOXレッドデッドセル染色を1nMの最終濃度に加えます。
  4. 細胞ソーター上のサンプルを分析します。SYTOX RedおよびEBFP2は405 nmレーザーで励起され、それぞれV450/BV421およびAPCチャネルによって検出される。DsRed2は488 nmレーザーで励起され、PEチャネルによって検出される。スペクトル補正のコントロールとして、トランスフェクトされていない細胞と EBFP2-および DsRed2- 単一陽性細胞を使用します。
  5. 10個の単一細胞を、温め込んだ完全成長培地のウェルあたり150 μLを含む96ウェルマイクロプレートの各ウェルにソートします。ユルカットT細胞や平底マイクロプレートなどの懸濁液細胞株を、付着性RAW264.7マクロファージ用の平底マイクロプレートを培養するために、丸底マイクロプレートを使用します。
    注:ウェルあたり10細胞のソートは、細胞の生存率を改善し、播種する必要がある96ウェルマイクロプレートの数と、フローサイトメトリーとジェノタイピングによってスクリーニングする必要があるサンプルの数を最小限に抑えるために最適化された戦略です。ウェルごとに 1 つのセルだけを並べ替える場合、正しく編集されたセルを取得する可能性を高めるために、より多くのマイクロプレートのシードが必要です。

5. 陽性ノックイン細胞のスクリーニングと検証

  1. フローサイトメトリーによる候補ノックイン細胞のスクリーニング
    1. ステップ4.5から10〜15日間細胞をインキュベートし、蒸発によって失われた液体を置き換えるために3日ごとに完全な成長培地を加える。Jurkat T細胞の場合、丸底96ウェルプレートで成長した細胞を平底プレートに移して細胞増殖を最適化します。
    2. さらに拡張するために、拡張されたソートされたセルを48ウェルプレートに移します。
    3. 細胞が合流に近い場合は、培養の半分を使用して、フローサイトメトリーによるEBFP2発現をスクリーニングする(図3)。通常、コンフルエント成長後の48ウェルプレートの培養の半分は、105細胞×0.5〜10個 に相当し、フローサイトメトリーによる1つのサンプルの分析に十分である。
    4. 残りの細胞を24ウェルプレートに移してさらに増殖させます。
    5. さらなるジェノタイピング実験のために、EBFP2陽性細胞の高い割合を有する候補細胞集団を保持する。
      注:96ウェルマイクロプレートの各ウェルに10個の細胞が分類されるため、ノックイン遺伝子を発現しない細胞でノックイン細胞が増殖する可能性があります。したがって、EBFP2陽性細胞を陰細胞から分離するために細胞ソーティングの追加ラウンドを行うことが正常である。
  2. PCRとシーケンシングによる候補ノックイン細胞のスクリーニング
    1. 2×105候補 セルを収集します。DNA準備キットを使用してゲノムDNAを抽出します(「 材料表」を参照)。
    2. 正確な相同性指向修復(HDR)が、候補のノックイン細胞のゲノム内のランダムな部位ではなく、mRosa26 遺伝子座で起こったことを確認するために、HAの両側に及ぶプライマーを用いてPCRを行う(図4)。ターゲットベクターの外側のゲノム領域にあるプライマー(外部オリゴ)と、ターゲティングベクター(内部オリゴ)の内側に配置された別のプライマーを選択します。
      注: hROSA26 軌跡で HDR を検証する場合も同様の設計が使用されています。PCRプライマーは、POI配列の挿入を検出するために容易に設計することもできる。また、野生型とノックインアリール型遺伝子型は、3プライマーPCRを用いて同時に検出することができる( 補足ファイル、 図S2を参照)。
    3. 高速クローニングキットを使用してポジティブ PCR 製品をクローン化します( 資料表を参照)。反応混合物をDH5αのコンピテントセルに変換します。
    4. ランダムに変換ごとに8〜10個の細菌コロニーを選び、サンガーシーケンシングによってステップ5.2.3からPCR産物を配列します。
  3. 免疫ブロット解析と親和性精製による陽性ノックイン細胞の検証
    注:候補細胞は、POIの挿入の検証、またはタンパク質とタンパク質相互作用の研究のためのアフィニティー精製(AP)のための免疫ブロット分析を受ける。
    1. 抗体メーカーの指示に従って免疫ブロット分析を行います。一次抗体および二次抗体の使用については、 資料表 を参照してください。
    2. OST タグ付き POI を発現するノックイン セルのライセートを、製造元の指示に従ってストレップ タクチン セファローズビーズを使用して AP に適用します ( 資料表を参照)。
    3. イメージャーを使用して化学発光を検出します。

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結果

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mRosa26遺伝子座でのノックイン実験を行うプロトコルに従って、マウスRAW264.7マクロファージを用いて、SARS-Cov-2ウイルスの受容体であるヒトACE2を発現させる標的ベクターを設計した(図2A)。同様の設計を用いて、OST タグ付き RASGRP1融合タンパク質のノックインを持つヒト Jurkat T 細胞を生成しました (図 2C)。3つのプラスミドのトランスフェクション後、そのうちの2つはCRISPR/ Cas9(DsRed2;pDSR-mR26-sg1およびpDsR-mR26-sg2 mRosa26ノックイン用)の発現に使用された。 pDsR-hR26-sg1およびpDsR-hR26-sg2は、相同組換え用DNAテンプレートとして用いられる(EBFP2)、2つの蛍光レポーターを発現する二重陽性細胞を96ウェルプレートに選別した。単一細胞のソートモードを用いてソートされたRAW264.7細胞のうち、0.91%がDsRed2+EBFP2+であったが...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

実験では、ヒトのJurkat T細胞とマウスRAW264.7マクロファージを例に、構築設計からノックイン細胞スクリーニング、検証まで、免疫細胞のノックイン編集を行う方法を実証しました。T細胞およびマクロファージ細胞株は両方トランスフェクション36、37に耐性である。しかし、CRISPR/Cas9送達の低効率の問題は、蛍光レポーターの助けを借りて細胞の選別と組み合わせることで克服することができます。このプロトコルは、遺伝子救助実験やタンパク質とタンパク質相互作用実験に適していますが、書き起こし因子の結合部位などの調節DNA配列の研究には適用できません。

デュアル蛍光レポーターがCRISPR/Cas9ノックイン編集を支援
我々は、免疫細胞におけるCRISPR/Cas9ベクターの独立したセットを一過性に発現させるために二重蛍光レポーターシステムを適用し、これまでの研究21

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新郷医科大学のフローサイトメトリーコア施設に感謝します。このような技術の開発は、LZ、81471595、および32070898に81601360のNSFC助成金によって支えられてきました。この作品は河南教育委員会第21IRTSTHN030の財団によっても支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Amersham Imager 600Ge Healthcare化学発光
アンピシリン、ナトリウム塩MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1MerckMABS1461.0 μg/mL of working concentration
AscINew England BioLabsR0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAbCell Signaling Technology8457at 1/1000 dilution
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Automated Cell CounterNexcelom Bioscience
大腸菌DH5αコンピテントセル宝9057
DMSO (ジメチルスルホキシド)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood &ティッシュキットQiagen69506細胞培養試薬
DPBS (10X)、カルシウムなし、マグネシウムなしThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucoseHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™バイオセーフティキャビネットを装備したBDバイオサイエンス
FACSカントフローサイトメーターBDバイオサイエンスファ
ルコン5mlポリスチレン丸底試験管BDバイオサイエンス352003
シ胎児血清(FBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック10099141
FlowJoバージョン10.7BDバイオサイエンス
GAPDH (D16H11) XP ウサギ mAb細胞シグナル伝達技術51741/1000 希釈
ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、HRPサーモフィッシャー サイエンティフィック314301/5000 希釈
Immobilon ECL Ultra Western HRP 基質ミリポアWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF メンブレンミリポアISEQ00010
JurkatATCC TIB-152https://www.atcc.org/
硫酸カナマイシンMP Biomedicals 194531
LB 寒天粉末ThermoFisher Scientific22700041
マルチチャンネルピペット (30-300 μL)エッペンドルフ、または類似の
ネオントランスフェクションシステムThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kitThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL コニカル滅菌遠心チューブThermoFisher Scientific339651
OneTaq®ホットスタートクイックロード®2X Master MixNew England BioLabs(M0489)高GC%テンプレート
PageRuler染色済みタンパク質ラダー用、10〜180 kDaモフィッシャーサイエンティフィック26616
ピペットチップ0.1-20µlエッペンドルフ、または類似の0030 075.005
ピペットチップ 2-200µlエッペンドルフ、または類似の0030 075.021
ピペットチップ 50-1000µlEppendorf、または類似の0030 075.064
プラスミド Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR 精製キットQiagen28104制限消化からプラスミドを精製
Q5 ホットスタート ハイフィデリティ 2X マスターミックスニューイングランドバイオラボM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]Abcamab108252at 1/1000 dilution
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beadsIBA Lifesciences2-1201-010
ペニシリン-ストレプトマイシンThermoFisher Scientific15140122
SYTOX™633 nm または 635 nm 励起用ThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA リガーゼNew England BioLabsM0202S
T4 ポリヌクレオチドキナーゼNew England BioLabsM0201S
トリパンブルー溶液、0.4%ThermoFisher Scientific15250061
トリプシン-EDTA 溶液 (0.25%)、フェノールレッドThermoFisherScientific25200056
ZOE 蛍光セルイメージャーBio-Rad
1.5 mL マイクロチューブ、PCR-クリーンEppendorf、または類似のもの 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated MicroplatesCorning3599
96 ウェル クリア ラウンドボトム TC 処理マイクロプレートCorning3799
フュージョンウサー

参考文献

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