このプロトコールは、臨床的に利用可能なプラットフォームを用いて 、インビボで キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作されたT細胞を非侵襲的に追跡するための方法論を記載している。
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方法論記事
[18F]テトラフルオロホウ酸陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影によるキメラ抗原受容体T細胞の動的イメージング
この記事について
サマリー
要約
キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作されたT細胞は、B細胞悪性腫瘍または多発性骨髄腫(MM)患者に対する重要な臨床試験において前例のない結果を示している。しかし、多くの障害が有効性を制限し、腫瘍部位への不十分なトラフィッキングおよび浸潤、ならびにインビボでの持続性の欠如のために、CAR T細胞療法の広範な使用を禁止している。さらに、サイトカイン放出症候群や神経毒性などの生命を脅かす毒性が大きな懸念事項です。CAR T細胞の効率的で高感度なイメージングおよび追跡は、T細胞のトラフィッキング、拡張、およびインビボ特性評価の評価を可能にし、CAR T細胞療法の現在の限界を克服するための戦略の開発を可能にします。本稿では、CAR T細胞にヨウ化ナトリウムシンポーター(NIS)を組み込むための方法論と、前臨床モデルにおける[18F]テトラフルオロホウ酸-陽電子放射断層撮影法([18F]TFB-PET)を用いたCAR T細胞イメージングについて述べる。このプロトコールに記載された方法は、本研究に用いたものに加えて、他のCAR構築物および標的遺伝子にも適用することができる。
概要
キメラ抗原受容体T(CAR T)細胞療法は、血液学的悪性腫瘍において急速に出現し、治癒可能なアプローチである1,2,3,4,5,6。CD19特異的CAR T(CART19)またはB細胞成熟抗原(BCMA)CAR T細胞療法の後に異常な臨床転帰が報告された2。これにより、米国食品医薬品局(FDA)は、攻撃的なB細胞リンパ腫(axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4、tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3、およびlisocabtagene maraleucel)7、急性リンパ芽球性白血病(Tisa-Cel)5,8、マントル細胞リンパ腫(brexucabtagene autoleuce)9、および....
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プロトコル
このプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会、施設バイオセーフティ委員会、およびメイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに準拠しています。
1. NIS+ BCMA-CAR Tセル生産
注:このプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB 17-008762)および施設バイオセーフティ委員会(IBC Bios00000006.04)のガイドラインに従います。
- BCMA-CAR、NIS、およびルシフェラーゼ-グリーン蛍光タンパク質(GFP)をコードするレンチウイルスの産生。
注:第2世代のBCMA-CAR構築物をde novo(材料表を参照)合成し、伸長因子-1α(EF-1α)プロモータの制御下で第3世代レンチウイルスベクターにクローニングした。BCMA-CAR構築物(C11D5.3-41BBz)には、4-1BB共刺激および抗ヒトBCMA抗体クローンC11D5.333,34に由来する一本鎖可変断片(scFv)が含まれていた。NISはEF-1αプロモーターの制御下にあり、自己切断ペプチド(P2A)を介してピューロマイシン耐性遺伝子に結合する。ルシフェラーゼ-GFPをコー....
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結果
図 1 は、NIS+BCMA-CAR T セルを生成するステップを表しています。0日目に、PBMCを単離し、次いで陰性選択によってT細胞を単離する。次に、抗CD3/CD28ビーズでT細胞を刺激する。1日目に、NISおよびBCMA-CARレンチウイルスの両方でT細胞を形質導入する。3日目、4日目、および5日目に、T細胞を数え、培地を投与して濃度を1.0×106/mLになるように調整した。NIS形質導入T細胞の場合、1μg/mLのピューロマイシンを加えてNIS+ 細胞を選択します。6日目に、磁石に細胞を1分間入れてビーズを取り除きます。次いで、チューブから脱ビーズ化した細胞を新しいフラスコに入れる。細胞のアリコート(例えば、50,000細胞)を採取し、抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いてT細胞の表面上のNISおよびCARの発現を確認する。8日目に、T細胞を計数し、10×106 / mLの濃度で凍結培地で凍結保存した。
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ディスカッション
本稿では、NISをCAR T細胞に組み込んで、[18F]TFB-PETを介してインビボで注入したCAR T細胞をイメージングするための方法論について説明する。概念実証として、NIS+BCMA-CAR T細胞は二重形質導入によって作製された。我々は最近、NISをCAR T細胞に組み込んでも、生体内でのCAR T細胞の機能や有効性を損なうことはなく、CAR T細胞の輸送と拡大を可能にすることを報告しました30。CAR T細胞療法が現在のB細胞悪性腫瘍を超えてCLLの用途に拡大し続けるにつれて、注入された養子T細胞の非侵襲的なin vivoイメージングおよびモニタリングを可能にするツールの必要性が高まります。T細胞の動的イメージングは、養子T細胞トラフィッキングの検証を可能にし、潜在的に有効性および毒性の早期検出を可能にする。
NISは、臨床試験で細胞やウイルスを画像化する高感度モダリティとして調査され、検証されています
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開示事項
SSKは、ノバルティス(メイヨークリニック、ペンシルベニア大学、ノバルティス間の契約を通じて)とメッタフォージ(メイヨークリニックを通じて)にライセンス供与されたCAR免疫療法の特許の発明者です。RS、MJC、およびSSKは、Humanigenにライセンス供与されているCAR免疫療法の分野における特許の発明者です。SSKは、カイト、ギリアド、ジュノ、セルジーン、ノバルティス、フマニゲン、モルフォシス、トレロ、スネシス、リーラブス、レンティゲンから研究資金を受けています。図は BioRender.com で作成されました。
謝辞
この研究は、Mayo Clinic K2Rパイプライン(SSK)、Mayo Clinic Center for Individualized Medicine(SSK)、Predolin Foundation(RS)を通じて部分的に支援されました。図 1、2、および 4 は、BioRender.com を使用して作成しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 22ゲージニードル | Covidien | 8881250206 | |
| 28ゲージインスリンシリンジ | BD | 329461 | |
| 96ウェルプレート | Corning | 3595 | |
| Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL抗体は、NIS |
| Anti-human BCMA、clone 19F2、PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow抗体 |
| 抗ヒトCD45、クローンHI30、BV421 | BioLegend | 304032 | Flow抗体 |
| 抗マウスCD45、クローン30-F11、APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow抗体 |
| 抗ウサギIgG | R&D | F0110 | NIS染色用二次抗体 |
| BCMA-CAR コンストラクト、第2世代 | IDT、アイオワ | ||
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B5-R3-V5 | ベックマン・コールター | C04652 | フローサイトメーター |
| ジメチルスルホキシド | ミリポアシグマ | D2650-100ML | |
| 使い捨てシリンジ ルアーロックチップ付き | BD | 309646 | |
| D-ルシフェリン、カリウムソルト | ゴールドバイオテクノロジー | LUCK-1G | |
| D-PBS (ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水) | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | ネガティブセレクション磁気ビーズ; 17951RF にはヒントと緩衝液 |
| ウシ胎児血清 | ミリポアシグマ | F8067 | |
| ヤギ抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| Inveon Multiple Modality PET/CTスキャナー | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
| イソフルラン液体 | ピラマル救命救急 | 66794-017-10 | |
| IVIS Lumina S5 イメージング システム | PerkinElmer | CLS148588 | |
| IVIS®Spectrum In Vivoイメージングシステム | PerkinElmer | ||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, 滅菌済み | Thermo Scientific | 450-0020 | |
| Nalgene Rapid-Flow 500 mL 真空フィルター、0.45 uM、滅菌済み | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| NOD.CG-PRKDCSCID Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
| OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
| pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | レンチウイルスベクター コードルシフェラーゼ-GFP |
| ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
| プール型ヒトAB血清血漿由来 | 革新的研究 | IPLA-SERAB-H-100ML | |
| ピューロマイシン二塩酸塩 | MP Biomedicals, Inc. | ||
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | 全自動セルセパレーター |
| RPMI (ロズウェルパーク記念研究所 (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | 密度勾配分離チューブ |
| アジ化ナトリウム、5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| T175フラスコ | Corning | 353112 | |
| Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
参考文献
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Raje, N., et al.
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再版と許可
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