膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

ナチュラルキラー(NK)細胞は、CD56を発現し、T細胞マーカーであるCD3 ^1,2の発現を欠くリンパ球の重要なサブセットです。従来のNK細胞は、ウイルス感染細胞やがん細胞の免疫監視を担う自然免疫細胞に分類される。T細胞とは異なり、NK細胞は、CD16または他の活性化受容体を使用して感染細胞または悪性細胞を認識し、抗原ペプチドと主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI分子との間の複合体の形成を必要としない^3,4。再発または難治性のCD19陽性がん(非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病[CLL])を治療するためにキメラ抗原受容体(CAR)-NK細胞を使用する最近の臨床研究では、CAR-NK細胞の優れた安全性の利点が示されました⁵。たとえば、CAR-NK細胞注入は、移植片対宿主病(GVHD)、神経毒性、心毒性、およびサイトカイン放出症候群(CRS⁾6,7,8,9,10に関連しています。しかし、ヒトNK細胞を増殖させる従来の方法では、強力な殺ダニ剤とテロメア不足を伴う網羅的な表現型を示し、養子免疫療法に十分な数の機能的なNK細胞を得る上で大きな課題となっています¹¹。

これらの課題を克服するために、MHCクラスI分子³の発現が低いヒトBリンパ芽球様細胞株である721.221(以下、221)細胞株を用いて、未分画末梢血単核細胞(PBMC)または臍帯血(CB)から直接初代NK細胞を増殖させる方法を開発した。以前の研究では、NK細胞増殖におけるIL-21の重要性が示されました。したがって、721.221細胞株のバージョン(今から221-mIL-21)を発現する遺伝子操作された膜結合IL-21が開発されました¹¹、^12、13、^14、15。その結果、221-mIL-21フィーダー細胞増殖初代NK細胞は、約2〜3週間にわたって高いNK細胞純度を維持しながら平均>40,000倍に増殖したことが示されました。このプロトコルの適用に関する追加情報は、Yangら¹⁶に見出すことができる。

このプロトコルは、PBNK、CBNK、組織由来NK、およびCAR-NK細胞のエクス ビボでの新規増殖の段階的な手順を実証することを目的としています。

このプロトコルのヒト組織および血液関連の作業は、ラトガース大学治験審査委員会(IRB)のガイドラインに従います。

1.図1に示すように、肝臓組織からのNK細胞増殖(0日目)。

注:初期細胞数と生存率は、臓器摘出からの時間と初期組織サンプル量と強く相関しています。しかし、組織を30 mLのハンクスバランス塩溶液(HBSS)に入れ、氷上または冷蔵庫で4°Cで一晩保持した場合、NK細胞は24時間後まで高純度および生存率で増殖することができます。

1. 無菌手術器具を使用して組織および切片からリンパ球を取得するために、生存可能な組織領域を特定します。
2. 組織を30 mLのHBSS(カルシウムまたはマグネシウムなし)に入れ、分離の準備ができるまで氷上に保ちます。
3. バイオセーフティキャビネット内の滅菌かみそりの刃またははさみと鉗子を使用して、組織を<0.5cmの立方体にミンチします。
4. 10x ストックをHBSSで希釈して、1x コラゲナーゼ IV 溶液 (1 mg/mL) を調製します (10x コラゲナーゼ IV: 10 mg/mL または ~200 U/mL)。
5. ミンチ組織片を組織解離管に入れます。チューブに4 g以下の組織を満たし、組織片を~10 mLの1xコラゲナーゼIVに浸します。
   注:DNase Iの使用は、NKの生存率と収量をわずかに低下させる可能性があるため、お勧めしません。使用する特定の組織解離管については、 材料表 を参照してください。
6. 組織解離管を組織解離管に入れ、37°Cでブレンドして組織を完全にミンチします。
   注意: 肝臓組織の場合、これには30分以上かかる場合があります。より砕けやすい組織の場合、約15分で十分な場合があります。特定の組織解離剤チューブおよび使用される組織解離剤については、 材料表 を参照してください。
7. 組織解離チューブを取り外し、5 mLシリンジのバックエンドを使用して40 μmナイロンセルストレーナーを通して粉砕します。溶離液を回収し、大きな未消化の断片を廃棄します。
8. 溶離液を400 x g で室温で5分間スピンダウンします。上澄み液を吸引する。
9. 細胞ペレットを30%ポリビニルピロリドン(PVP)コーティングシリカに再懸濁して、最終的なリンパ球画分を汚染する脂肪細胞を除去します。
   1. 1x PVP被覆シリカを調製するには、10x PBS中のPVP被覆シリカの9:1希釈を使用します。
      注意: 使用される特定のPVPコーティングシリカについては、 材料表 を参照してください。
   2. 30%PVPコーティングシリカを調製するには、PVPコーティングシリカ1xをPBS / HBSSで希釈します。
10. セルペレットを400 x g で室温で5分間スピンダウンします。上澄み液を吸引する。
11. 細胞ペレットを9 mLのR-10培地に再懸濁します。
    注:R-10メディアの構成については、 材料表 を参照してください。
12. 細胞懸濁液を4 mLのFicollまたはリンパ球分離培地に注意深く重ねて、赤血球および多形核細胞からリンパ球を分離します。
13. 加速とブレーキをオフまたは最低設定で室温で400 x g で23分間遠心分離することにより、層を分離します。上層から中層を注意深くデカントし、組織浸潤リンパ球を含む間期を採取します。
14. 細胞を10 mLの培地ですすぎ、細胞計数、フローサイトメトリー、細胞の分注と凍結、または一次NK増殖プロトコルに進みます。

2. 図2に示すように、PBMC(またはCBまたは臓器組織)からの初代NK細胞増殖(0日目)。

1. 凍結したPBMCと凍結したフィーダーセルを解凍し、37°Cの水浴中で照射した。
2. PBMCと100ガンマ線照射(Gy照射)221-mIL-21細胞を、10 mLのR-10培地で400 x g で5分間遠心分離して洗浄します。
3. フローサイトメトリー用にPBMCの1 x 10⁶ 細胞を保存します。
   注:初期のNK細胞の純度は、NK細胞の増殖率を計算する上で重要な要素です。
4. 細胞を1 mLのR-10培地に再懸濁します。トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
5. PBMCの5x 10 6セルと100 Gy照射221-mIL-21セルの10 x 10 6セルを特別な⁶ウェルプレートで混合します(材料の表を参照)。
6. ヒトIL-2(200 U / mL)およびヒトIL-15(5 ng / mL)を添加した30 mLのR-10培地を追加します( 材料の表を参照)。
7. 特殊な6ウェルプレートを5%_CO2で37°Cでインキュベートします。
8. 培地をヒトIL-2(200 U/mL)およびヒトIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地に交換し、3〜4日ごとにNK細胞を維持します。
   注:培地交換のたびにさらに拡張できるように、ウェルあたり20 x 10⁶ セル未満に維持してください。最良の生存率を得るには、各ウェルの合計細胞数が100 x 10⁶ 細胞を超えないようにしてください。
9. 総細胞数、生存率を記録し、3〜4日毎にフローサイトメトリーを行い、NK細胞増殖率を算出した。

3. 図2に示すように、293T細胞の付着( 2日目)。

1. 処理した100 mmプレートあたり1.8 x 10⁶ 293T細胞を11 mLのD-10培地で分割します。
   注意: D-10メディアの構成については、 材料表 を参照してください。
2. 293T細胞を5%_CO2で37°Cでインキュベートします。

4. レトロウイルストランスフェクション(3日目)

1. 1.7 mLチューブ中で、470 μLの還元血清培地と30 μLのトランスフェクション試薬を混合します。
   注:使用する特定の還元血清培地およびトランスフェクション試薬については、 材料表 を参照してください。
2. 別の1.7 mLチューブに、SFGベクター中の2.5 μgのpRDFプラスミド、3.75 μgのPegpam3プラスミド、および2.5 μgのCARコンストラクトを還元血清培地に加え、最終容量が500 μLになるようにします。
3. 手順4.1と4.2の溶液を滴下して混合します。
4. チューブを室温で15分間インキュベートします。
5. ステップ4.4の混合物を1日目に293T細胞プレートに滴下して加えます。
6. プレートを5%CO2で37°Cで48〜₇₂ 時間インキュベートします。

5.レトロネクチンプレートコーティング(3日目)

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でレトロネクチンタンパク質を最終濃度50〜100 μg / mLに希釈します。
2. 500 μLの希釈レトロネクチンを未処理の24ウェルプレートの各ウェル(CARコンストラクトあたり5ウェル)に追加します。パラフィルムを使用してプレートを密封し、プレートを4°Cで一晩インキュベートします。

6.形質導入(4日目)

1. レトロネクチンプレートを2103 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。
2. 24ウェルプレートの各ウェルを1 mLのR-10培地でブロックします。
3. プレートを5%_CO2 で37°Cで1時間インキュベートします。
4. レトロネクチンプレートがブロックされている間、遠心分離機を32°Cに予熱します。
5. トランスフェクトされた293T細胞を0.45 μmフィルターでろ過し、レトロウイルス上清を収集します。
6. ろ過したレトロウイルス上清2 mLを各ウェルに分注します。
7. 24ウェルプレートを2103 x g で32°Cで2時間遠心分離します。
8. プレート遠心分離中に、0日目から増殖PBNK細胞を回収し、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
   注:IL-2(200 U / mL)およびIL-15(5 ng / mL)を添加したR-10培地を追加して、PBNK細胞を引き続き増殖させます。
9. IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地で、増殖したPBNK細胞を2.5 x 10 5-5 x 10 5細胞/mL(ウェルあたり^0.5 x 10 6-1 x^{10 6}細胞)に希釈します。
   注:総細胞数、生存率を記録し、5 x 10⁵ 増殖PBNK細胞はNK細胞増殖率を決定する上で重要であるため、フローサイトメトリー用に保存してください。
10. 遠心分離後、各ウェルからレトロウイルス上清を部分的に吸引する。
    注:完全に吸引しないでください、すなわち、ウェルあたり約100μLのレトロウイルス上清を残すと、形質導入効率が低下します。
11. ステップ6.8から希釈した増殖PBNK細胞2mLを各ウェルに分注する。
12. プレートを600 x g で32°Cで10分間遠心分離します。 プレートを5%CO₂ で37°Cで48〜72時間インキュベートします。
    注意: プレートをパラフィルムしないでください。

7. 図2に示すように、CAR-NK細胞収集(6日目または7日目)。

1. 24ウェルプレートから細胞を静かに回収し、50 mLの遠沈管に移します。
   注:気泡を生成しないようにしてください, これは細胞の生存率の低下をもたらすので.
2. チューブを400 x g で5分間遠心分離します。
3. ペレットを1 mLのR-10培地で再懸濁し、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
   注:フローサイトメトリー用に5 x 10⁵ 細胞を保存して、形質導入効率を測定します。
4. 再懸濁した細胞を、IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加した30 mLのR-10培地を含む特別な6ウェルプレートに移します。
5. 特殊な6ウェルプレートを5%_CO2で37°Cでインキュベートします。
6. IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地を交換して、3〜4日ごとにNK細胞を維持します。
   注:ウェルあたり20 x 10⁶ セル未満に維持し、各変更でさらに拡張します。最良の生存率を得るには、各ウェルの合計細胞数が100 x 10⁶ 細胞を超えないようにしてください。
7. 総細胞数、生存率を記録し、3〜4日毎にフローサイトメトリーを行い、NK細胞増殖率を算出した。
8. 適切なインビトロまたはインビボアッセイに細胞を使用してください。
   注: ex vivo で増殖したPBNK細胞およびCAR-NK細胞は、37°Cのインキュベーターで約4週間培養できます。
9. フローサイトメトリーにより、7日目、11日目、14日目、18日目、および21日目のNK細胞数と純度を調べます。

221-mIL-21フィーダー細胞法を用いた組織浸潤NK細胞単離およびPBNK細胞増殖の概略ワークフローを図1および図2に示します。増殖したPBNK細胞をフローサイトメトリーのために3または4日ごとに回収し、細胞を抗ヒトCD56および抗ヒトCD3で染色することによってNK細胞純度を決定した。膨張系の再現性を示すために、2つの異なるドナーを用いて実験を繰り返した(図3)。221-mIL-21によって拡大されたPBNK細胞は、ほぼ5×10から4倍に拡大することが示された(図3A)。さらに、NK細胞の純度は、21日間の増殖を通して約85%と高度に維持された(図3B)。221-mIL-21フィーダー細胞増殖系を用いて、NK細胞の純度は、ドナーとは無関係に一貫して85%〜95%の範囲であった(データ示さず)。221-mIL-21増殖系の頑健性を実証するために、PBMCは増殖前に抗CD56および抗CD3について染色され、NK細胞で7.09%の細胞純度と高い割合のT細胞を示しました(図4A)。PBMCを221-mIL-21と共培養してNK細胞を増殖させた。NK純度は、4日目のCAR-NK形質導入の前にチェックされました(図4A)。CAR-NK細胞を回収し、抗CD56、抗CD3、抗hIgG(H+L)F(ab')2について染色したところ、NK細胞集団が高く(7日目に86.9%)、CAR導入効率が約70%と高かった(図4)。より高い形質導入効率(最大95%)も、レトロウイルスパッケージングシステムを使用して観察されました。全体として、これらのデータは、221-mIL-21フィーダー細胞がNK細胞を正常に増殖させ、NK細胞の純度をex vivoで維持できることを示しています。

図1:固体ヒト臓器サンプルからのNK細胞増殖の図。 簡単に言えば、得られたヒト肝臓サンプルは、機械的消化のために小さな立方体にミンチされる。次に、解離した細胞をPVPコーティングシリカとリンパ球分離培地を使用して単離します。さらに、NK細胞は、図2に記載の拡張プロトコルを用いて増殖される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PBMCからのCAR-NK細胞生成の概略ワークフロー。 簡単に説明すると、221-mIL21フィーダー細胞を、IL-2およびIL-15を添加したPBMCと共培養する前に0日目に100Gyで照射した。並行して、293T細胞をレトロウイルスパッケージングシステムでトランスフェクトしてCARレトロウイルスを産生し、IL-2およびIL-15の存在下で増殖PBNK細胞に形質導入しました。初代CAR-NK細胞を7日目に回収し、21日間増殖を続けた。この図はYangら16から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:PBNK細胞の動的タイムラプス増殖 。 (A)22日間の時間経過中のPBNKの倍拡大。細胞を、フローサイトメトリーのために指示された日に抗CD56および抗CD3で染色した。NK細胞の総数は、全細胞数にNK細胞の純度を乗じることにより求めた。拡大率は以下のようにして生成した:(NK細胞数)Tn/(NK細胞数)T0、ここでNK細胞数=(NK細胞純度の割合)×(全細胞数)、T0 は時刻0日目におけるNK細胞数、Tnは時刻nにおけるNK細胞数である。 (B)22日間の経時変化におけるNK細胞純度。NK細胞増殖を2つの異なるドナーで2回繰り返した。エラーバー±SEMを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:CAR-NK細胞の代表的なフローサイトメトリー解析。 (A)18日間のコース中のCAR-NK細胞のNK細胞純度の動的タイムラプスを示す代表的なドットプロット。フローサイトメトリー分析は、示された時点で細胞を抗CD56および抗CD3で染色することによって評価した。0日目はPBNKの事前拡張を示します。4日目は、PBNKの増殖後およびCAR-NK細胞の形質導入前を示します。7日目は、CAR-NK細胞の形質導入後を示す。(B)レトロウイルスパッケージングシステムを用いたCAR-NK細胞の形質導入効率を示す代表的なドットプロット。フローサイトメトリーでは、細胞を抗CD56、抗CD3、および抗hIgG(H+L)F(ab')2で染色しました。(C)18日目のCD56+CD3-、CD56-CD3+、CD56+CD3+、およびCD56-CD3-を含む様々なサブセットにおけるCAR発現を示す代表的なドットプロット。細胞をフローサイトメトリーのために抗CD56、抗CD3、および抗hIgG(H+L)F(ab')2(CAR発現を示す)で染色した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者は競合する利益を宣言しません。