方法論記事

単一細菌への重水素取り込みの誘導ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験

DOI：

10.3791/62398

⸱

2022年2月14日

 ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、D2O代謝の単一細胞刺激ラマン散乱イメージングによる2.5時間以内の迅速な抗菌剤感受性試験(AST)アッセイを提示します。この方法は、尿または全血環境の細菌に適用され、診療所での迅速な単一細胞表現型ASTに変化します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

薬剤耐性感染症の拡大を遅らせ、防止するために、病原体に対する抗菌効果を定量的に決定するための迅速な抗菌薬感受性試験(AST)が緊急に必要です。通常、長時間の培養に基づく従来の方法でASTを完了するには数日かかり、臨床サンプルでは直接機能しません。ここでは、酸化重水素(D2O)代謝取り込みの誘導ラマン散乱(SRS)イメージングによって可能になる迅速なAST法について報告する。バイオマスへのD2Oの代謝取り込みおよび単一細菌レベルでの抗生物質への曝露時の代謝活性阻害は、SRSイメージングによってモニターされる。抗生物質への曝露時の細菌の単一細胞代謝不活化濃度(SC-MIC)は、合計2.5時間のサンプル調製および検出後に得ることができます。さらに、この迅速なAST法は、尿や全血などの複雑な生物学的環境の細菌サンプルに直接適用できます。重水素取り込みのSRS代謝イメージングは、臨床における迅速な単一細胞表現型ASTに変革的です。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

薬剤耐性(AMR)は、感染症の効果的な治療に対する世界的な脅威として増大しています1。AMRは、抗生物質耐性菌との闘いのための対策を講じなければ、2050年までに年間1,000万人が死亡し、世界のGDPが100兆ドル減少すると予測されています1,2。これは、抗生物質耐性菌の出現を遅らせ、関連する死亡率を低下させるために、感染性細菌の抗生物質感受性試験(AST)のための迅速かつ革新的な診断方法の緊急の必要性を強調しています3。可能な限り最良の臨床転帰を確実にするためには、24時間以内に効果的な治療法を導入することが重要です。ただし、ディスク拡散法やブロス希釈法などの現在のゴールドスタンダード法では、通常、臨床サンプルのプレインキュベーション手順に少なくとも24時間、最小阻害濃度(MIC)結果を得るにはさらに16〜24時間かかります。全体として、これらの方法は時間がかかりすぎて、診療所での感染症治療の即時決定を導くことができず、抗菌薬耐性の出現と拡大につながります4。

迅速な検出のために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの技術5などの遺伝子型AST法が開発されています。このような技術は、迅速なAST結果を提供するために、特異的耐性遺伝子配列を測定する。それらは時間のかかる細胞培養に依存しません。ただし、耐性のある特定の既知の遺伝子配列のみがテストされます。したがって、その適用は、さまざまな細菌種またはさまざまな耐性メカニズムに限定されています。また、治療決定のためのMIC結果を提供することはできません6,7。さらに、これらの制限を克服するために、迅速なASTのための新しい表現型法が開発中であり、マイクロ流体デバイス9、10、11、12、13、光学デバイス14、15、16、核酸コピー数17、18、およびラマン分光法19を含む表現型ASTが含まれ、20、21、22、23、24。これらの方法はAST結果を導く時間を短縮しますが、それらのほとんどは細菌分離株にのみ適用でき、臨床検体に直接適用できず、それでも長時間のプレインキュベーションが必要です。

本研究では、SRSイメージングによる細胞代謝活性のモニタリングにより、尿中および全血中の細菌の感受性を迅速に決定する方法を提示します。水(H2O)は、生細胞における必須の生体分子合成プロセスの大部分に関与しています。水の同位体として、NADPHの酸化還元活性水素原子とD2OのD原子との間の酵素触媒H/D交換反応により、重水素を細胞内のバイオマスに取り込むことができる25,26。重水素化脂肪酸合成反応は、重水素標識NADPHによって媒介される。アミノ酸(AAs)の反応へのD2Oの取り込みは、重水素化タンパク質産生をもたらす26(図1)。このようにして、単一の微生物細胞内で新たに合成されたC−D結合含有生体分子は、検出される一般的な代謝活性マーカーとして採用することができる。de novo合成C-D結合を読み取るために、生体分子の特異的で定量的な化学情報を提供する汎用性の高い分析ツールであるラマン分光法は、抗菌剤感受性を決定し、テスト時間を数時間に大幅に短縮するために広く使用されています27,28,29,30.しかしながら、ラマン散乱プロセスの本質的に低い効率のために、自発ラマン分光法は低い検出感度を有する。そのため、自発ラマン分光法を用いてリアルタイムの画像結果を得ることは困難です。コヒーレント反ストークスラマン散乱(CARS)や誘導ラマン散乱(SRS)を含むコヒーレントラマン散乱(CRS)は、自発ラマン分光法よりも桁違いに大きな大きさを生成するコヒーレント光場により、高い検出感度に達し、単一細胞レベルで高速、特異的、定量的な化学イメージングを実現します31,32,33,34,35、36,37,38,39。

ここでは、我々の最新の研究40に基づいて、単一細胞レベルでの正常培地、尿、および全血環境における細菌のD2O取り込みのフェムト秒SRS C−Dイメージングによる代謝活性および抗菌感受性の迅速な決定のためのプロトコルを提示する。フェムト秒SRSイメージングは、2.5時間以内の単一細菌レベルでの抗生物質に対する単一細胞代謝不活化濃度(SC-MIC)のモニタリングを容易にします。SC-MICの結果は、ブロス微量希釈による標準的なMICテストによって検証されます。私たちの方法は、細菌尿路感染症(UTI)および血流感染(BSI)病原体の抗菌薬感受性を決定するために適用可能であり、従来の方法と比較してアッセイ時間が大幅に短縮され、単一細胞レベルでの臨床での迅速な表現型ASTの機会を開きます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト血液検体の使用は、ボストン大学のIRBおよび国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに準拠しています。具体的には、標本は銀行からのものであり、完全に非識別化されています。これらの標本は、ボストン大学の治験審査委員会(IRB)のオフィスではヒトの被験者とは見なされていません。

1.細菌および抗生物質原液の調製

  1. 抗生物質(硫酸ゲンタマイシンまたはアモキシシリン)ストック溶液を1 mg/mLの濃度で調製し、1.5 mLマイクロチューブ中の滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはジメチルスルホキシド(DMSO)溶媒に溶解します。硫酸ゲンタマイシンを滅菌PBS溶液に溶解し、アモキシシリンを滅菌DMSO溶媒に溶解します。その後、抗生物質溶液を示唆するように2〜8°Cで保存する。
  2. D2O含有カチオン調整ミューラーヒントンブロス(MHB)培地を作るには、220mgのMHBブロスベースを10mLのD2Oに加え、100%D2O含有培地を作る。200 nmの孔径のフィルターでろ過して溶液を滅菌します。
    注:このプロトコルは、以降のステップで培地溶液の製造と滅菌に常に使用してください。
  3. SRSイメージング用の細菌サンプルを調製するには、重水素を含まない通常のMHB培地2 mLを滅菌丸底培養チューブに加え、37°Cで予熱します。
  4. 滅菌ループを使用して、トリプシン大豆寒天プレート上の新鮮な培養物から1つの細菌(大腸菌 BW 25113または 緑膿菌 ATCC 47085)コロニーを選択します。次に、それを予熱した培地に懸濁し、穏やかにボルテックスして細菌懸濁液を調製します。
  5. 細菌を対数相に達するまで、毎分200回転(rpm)のシェーカーで37°Cでインキュベートします。

2.抗生物質の存在下でのD2O取り込み治療(図2a)

  1. 波長600nmの光度計で光学濃度(OD)を測定して細菌濃度を確認します。
  2. 重水素を含まない通常のMHB培地を使用して細菌溶液を希釈し、最終細胞濃度8 x 105 CFU / mLに到達します。穏やかに渦を流して細菌細胞を混合します。
  3. 7本の1.5 mLマイクロチューブに300 μLの細菌溶液を調製し、1本の1.5 mLマイクロチューブに600 μLの細菌溶液を調製します。
  4. 抗生物質(ゲンタマイシンまたはアモキシシリン)ストック溶液(1 mg/mL)を600 μLの細菌溶液を含むマイクロチューブに4.8 μL加え、抗生物質の最終濃度を8 μg/mLにします。
  5. 抗生物質含有細菌溶液8 μg/mLから300 μLの溶液を取り出し、さらに300 μLの細菌溶液に加えて、2倍希釈した抗生物質(4 μg/mL)含有細菌溶液を作ります。
  6. 試験抗生物質、ゲンタマイシン、またはアモキシシリンの2倍の段階希釈を、最低濃度(0.25 μg/mL)のマイクロチューブに達するまで繰り返し、チューブから300 μLを廃棄します。ゲンタマイシンとアモキシシリンの両方について、連続濃度は0.25μg/ mL〜8μg/ mLの範囲です。
    1. ブランクコントロールのために抗生物質を含まない1本のチューブを残します。これは、抗生物質治療なしでD2O治療で細菌代謝活性を検査するためのポジティブコントロールになります。
    2. ネガティブコントロールのために、抗生物質とD2Oを含まないチューブを1本残します。
  7. 細菌アリコートを特定の抗生物質(ゲンタマイシンまたはアモキシシリン)含有MHB培地と1時間インキュベートします。
  8. インキュベーション中に、ステップ2.6で調製した抗生物質と同じ濃度勾配を有する100%D2O含有培地で抗生物質の段階希釈を調製する。ゲンタマイシンとアモキシシリンの両方について、連続濃度は0.25μg/ mL〜8μg/ mLの範囲です。
  9. 1時間の抗生物質処理後、700μLの段階希釈抗生物質および100%D2O含有MHB培地を、それぞれ同じ抗生物質濃度(ステップ2.6で調製)の抗生物質前処理細菌300μLに加える。
    1. 例えば、抗生物質前処理細菌300 μLに700 μLの100%D2O含有MHB培地(抗生物質8 μg/mLを含む)を追加します。同様にして、次の濃度の対応するチューブに移し、数回上下にピペッティングしてホモジナイズする。
    2. ブランクコントロールとして、抗生物質を含まない100%D2O含有MHB培地700 μLを抗生物質を含まない細菌300 μL(ステップ2.6.1で調製)に追加します。
    3. インキュベーションシェーカーで37°C、200rpmでさらに30分間インキュベートします。
      注:このステップでは、試験用培地中のD2Oの最終濃度は70%です。
  10. まず、抗生物質1 mLおよびD2O処理細菌サンプルを6200 x g で4°Cで5分間遠心分離し、次に精製水で2回洗浄します。最後に、サンプルを10%ホルマリン溶液に固定し、4°Cで保存します。

3.尿環境における細菌の調製(図2b)

  1. 対数段階で 大腸菌 BW 25113を調製するには、1.4および1.5の手順に従います。
  2. 波長600nmの光度計でODを測定して細菌濃度を確認します。
  3. 臨床UTIサンプル14、18、41を模倣するには、 大腸菌 溶液を10 mLの非同定尿にスパイクして、最終細胞濃度106 CFU / mLに到達します。
  4. 5 μmフィルターを使用して 大腸菌 添加尿をろ過し、300 μLアリコートの細菌溶液を7つの1.5 mLマイクロチューブに分割し、600 μLの細菌溶液を1つの1.5 mLマイクロチューブに分割します。
  5. 抗生物質の存在下でD2O取り込み処理を行い、2.4から2.10までの前の工程で説明したようにサンプル収集を行う。

4.血液環境中の細菌の調製(図2c)

  1. 緑 膿 菌ATCC 47085を対数相で調製するには、1.4および1.5の手順に従います。
  2. 臨床血流感染サンプル42,43を模倣するために、1mLの非同定ヒト血液中の緑膿菌をスパイクして、107 CFU / mLの濃度に達する。
  3. 9mLの滅菌精製水を加えて血液を溶解します。
  4. 緑 膿 菌のスパイク血液を5μmのフィルターでろ過します。その後、6200 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、細菌を1 mL容量に回収します。 9 mLの予熱した通常のMHBをバクテリア溶液に加え、穏やかにボルテックスします。細菌の最終濃度は106 CFU / mLです
  5. 緑 膿 菌を添加した血液溶液を300 μLアリコートで7本の1.5 mLマイクロチューブに分割し、600 μLの細菌溶液を1本の1.5 mLマイクロチューブに分割します。
  6. 抗生物質の存在下でD2O取り込み処理を行い、2.4から2.10までの前の工程で説明したようにサンプル収集を行う。

5. 単一細菌におけるD2O代謝取り込みのSRSイメージング

  1. 固定菌液1 mLを精製水で洗浄し、6200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を取り除きます。細菌溶液を約20μLに濃縮する。
  2. ポリL-リジンコーティングされたカバーグラスに細菌溶液を堆積させます。SRSイメージング用のサンプルをサンドイッチして密封します。
  3. SRS顕微鏡を用いて2168cm-1のC-D 振動周波数で細菌を画像化。
    1. コンピュータの制御ソフトウェアを使用して、ポンプ波長を852nmに入力および調整します。
    2. パワーメーターを使用してレーザー出力を測定します。レーザー出力の前の半波長板を調整して、サンプルのポンプレーザーの出力を~8 mWに、サンプルのストークスレーザーの出力を~40 mWに設定します。
      注:SRS顕微鏡では、繰り返し周波数が80MHzの調整可能なフェムト秒レーザーがポンプ(680〜1300 nm)とストークス(1045 nm)励起レーザーを提供します。
  4. 反射ミラーのネジを調整することにより、ポンプとストークスビームを空間的に位置合わせし、2つのビームをレーザースキャン用の2Dガルボミラーシステムを備えた直立顕微鏡に向けます。
    1. 60倍の水浸対物レンズを使用して、ポンプとストークスレーザーをサンプルに集中させます。
    2. オイルコンデンサーを使用して、サンプルから順方向に信号を収集します。
    3. バンドパスフィルターを使用して、ストークスレーザーをフォトダイオードに向ける前にフィルターで除去します。
    4. ロックインアンプで誘導ラマン信号を抽出し、フォトダイオードで信号を検出します。
  5. ソフトウェアのコントロールパネルで、各SRS画像に200 x 200ピクセルと30μsのピクセル滞留時間を設定します。1枚の画像の合計取得時間は~1.2秒です。ステップサイズを150nmに設定し、画像サイズを約30×30μm2にします。各サンプルについて少なくとも 3 つの視野を画像化する。

6. 画像処理とデータ解析(図3)

  1. 平均C-D信号強度を得るには、ImageJソフトウェアでSRS画像を開いて処理します。
  2. まず、SRS画像を画像|をクリックして、色が反転した8ビットタイプの画像に変換します タイプ|8 ビット、次に 編集| ImageJソフトウェアのボタンを反転します。
  3. 次に、[プロセス]をクリックしてガウスぼかしで画像をフィルタリング します|フィルター|ガウスぼ かしボタンを選択し、 シグマ(半径) を1に設定します。
  4. 画像のしきい値調整を使用して、細菌領域を選択します。[ 画像|]|を調整する 選択した細菌のサイズが元のSRS画像のものと一致することを確認するためのしきい値。サイズのしきい値を調整して粒子を決定し、小さな粒子を排除します。[ 適用] をクリックします。
  5. 分析|の適用粒子分析ボタンを使用して、細菌の領域にラベルを付けて決定します。
  6. ROIマネージャーの[すべて表示]ボタンをクリックして、元の未処理のSRS画像にラベルを付け、同じ領域の細菌にラベルを付け、ROIマネージャーの[測定]ボタンをクリックして各データポイントの平均強度を決定します。
  7. 元のSRS画像の背景領域を丸で囲み、背景の平均強度を測定します。各細菌の平均C−D強度は、バックグラウンドシグナル強度を差し引くことによって得られる。

7. SC-MICによる抗菌薬感受性の定量

注:SC-MICを決定するための0.60のカットオフ値は、さまざまな濃度の薬物曝露時の細菌の代謝活性および代謝阻害条件のSRS C-D強度の統計分析に従って確立されます40。抗生物質感受性群と抗生物質耐性群のC-D強度は正規分布に適合した。

  1. レシーバの動作特性(ROC)曲線をプロットし、カットオフスレッショルドを0.60で評価します。このカットオフ値に基づいて、抗生物質の有効性の指標としてのSC−MICを定義して、代謝的に不活性および代謝的に活性な群を決定することができる。
  2. SRSイメージングデータを定量的に分析するために、連続希釈抗生物質濃度で処理した各細菌群のC−Dシグナル強度のヒストグラムをプロットします。色付きのデータポイントは、さまざまな個々の細菌を表します。
  3. 抗生物質治療群のC-D強度を、抗生物質治療なしの対照群の平均強度に正規化します。0.60のカットオフ値を使用して、C-D領域とさまざまな濃度の抗生物質でのSRSシグナル強度を定量することにより、さまざまな細菌と抗生物質の組み合わせのSC-MIC結果を決定します。
  4. SC-MICの読み出しを検証し、従来のブロス微量希釈アッセイを使用して測定したMICと比較します。
  5. 臨床検査基準研究所(CLSI)によると、テストされた各細菌株のSRS代謝イメージング結果に基づく感受性カテゴリは、「感受性」、「耐性」、または「中間」と解釈されます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重水素の取り込みに対するインキュベーション時間の影響は、C-D(2070〜2250 cm-1)およびC-H(2,800〜3,100 cm-1)領域での自発的ラマン顕微鏡法によって測定されます(図4a)。70%D2O含有培地で培養した緑膿菌のタイムラプス単一細胞ラマンスペクトルは、0〜180分のインキュベーション時間にわたってCD/CH強度の増加を示しています(図4b)。 単一微生物細胞におけるC-D存在量の増加は、D2Oが細胞内の重水素化生体分子に取り込まれることを明らかにしています。

50%を超えるD2O標識は、23時間のインキュベーション期間中の細菌代謝に有意に影響を及ぼす27。25時間のインキュベーション期間中にD2O標識濃度が70%を超えると細菌増殖阻害を観察し...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

迅速なASTは、サンプルからSC-MIC結果までの2.5時間以内のシングルセルSRS代謝イメージングを使用して、抗生物質治療に対する細菌代謝活性の応答を評価することによって得ることができます。細菌の代謝活性および抗菌感受性の応答は、C−D結合のSRSイメージングを用いて生体分子合成のためのD2Oの代謝取り込みをモニターすることによって検出することができる。水は生細胞に遍在しているため、SRS代謝イメージングは迅速なASTのための普遍的な方法を提供します。ラピッドAST法は、尿や全血などの複雑な生物学的環境にある細菌を単一の細菌レベルで検出するために適用できます。SC-MICは、尿および血液中の細菌の1.5時間培養後に決定することができ、UTIおよびBSI診断のパラダイムを時間のかかる培養依存の手順から培養に依存しない in situ アプローチにシフトするための変革的であると考えられています。したがって、従来のブロス微量希釈法と比較して診断時間が大幅に短縮され、臨床翻訳への道が開かれ、正確な治療のための適切な抗菌剤を時間通りに特定できるようになります。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業は、NIH R01AI141439からJ.-X.CおよびM.S、およびR35GM136223からJ.-X.C.のサポートを受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
音響光学変調グーチ&HousegoR15180-1.06-LTD変調ストークス レーザービーム
アモキシシリンシグマ アルドリッチA8523-5G
バンドパスフィルタークロマHQ825/150mフォトダイオードの前にストークスレーザービームを遮断
塩化カルシウムシグマアルドリッチC1016-100G陽イオン調整
陽イオン調整 ミューラー・ヒントン ブロスフィッシャーサイエンティフィックB12322ブロス希釈法による微生物の抗菌感受性試験
遠心分離機Thermo Scientific75002542
カバー メガネVWR16004-318
スナップキャップ付き培養チューブフィッシャーブランド149569B
ダプトマイシンアクロスA0386346
酸化151882抗生物質を溶解する有機溶媒
酸化重水素-d6Sigma Aldrich156914SRSイメージングシステムを校正するための標準物質としての有機溶媒
大腸菌 BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf ポリプロピレン微量遠心チューブ 1.5 mLフィッシャーブランド05-408-129
硫酸ゲンタマイシンSigma AldrichG4918
親水性ポリフッ化ビニリデンフィルターMillipore-SigmaSLSV025NB孔径5 & micro;m
ImageJソフトウェアNIHバージョン:2.0.0-rc-69/1.52t画像処理と分析
インキュベーションオービタルシェーカーを37°Cに設定。CVWR97009-890
接種ループシグマBR452201-1000EA
InSight DeepSee フェムト秒パルスレーザースペクトル物理学モデル: 洞察 X3SRSイメージング用の1045nmの調整可能なレーザー光源と固定レーザー光源
ロックインアンプチューリッヒ機器HF2LISRS信号を復調
オイルコンデンサーオリンパスU-AACNA 1.4
緑膿菌 ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
Photodiode浜松S3994-01検出器
ポリプロピレン円錐管 15 mLFalcon14-959-53A
ポリプロピレンフィルターThermo Scientific726-2520孔径 0.2 & マイクロ;m
滅菌ペトリ皿コーニング07-202-031
シリンジ 10 mLフィッシャーブランド14955459
UV/Vis 分光光度計ベックマン・コールターモデルDU 530波長600nmでの光学密度の測定
ボルテックスミキサーVWR97043-562
水対物レンズオリンパスUPLANAPO/IR60×、NA 1.2
重水素

参考文献

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