エキソサイトーシスの自動検出と解析

Summary

pH感受性蛍光プローブでマークされたエキソキシティックイベントを検出する自動コンピュータビジョンソフトウェアを開発しました。ここでは、グラフィカルユーザーインターフェースとRStudioを使用して、融合イベントの検出、融合の時空間的パラメータの分析と表示、およびイベントを個別の融合モードに分類する方法を示します。

Abstract

小胞SNAREタンパク質に結合したpH感受性GFP(pHluorin)のタイムラプスTIRF顕微鏡は、細胞培養における単一の小胞性エキサイトイベントを可視化する有効な方法である。このような事象の公平で効率的な同定と分析を行うために、MATLABでコンピュータビジョンベースのアプローチが開発され、実装されました。分析パイプラインは、細胞セグメンテーションとexocytic-イベント識別アルゴリズムで構成されています。コンピュータビジョンアプローチには、蛍光減衰の半減期およびΔF/Fピークを含む単一事象の複数のパラメータを調査するためのツールと、エキソサイトーシスの頻度の全細胞分析が含まれる。これらの融合のパラメータと他のパラメータは、異なる融合モードを区別する分類アプローチで使用されます。ここで新しく構築された GUI は、最初から最後まで分析パイプラインを実行します。R StudioでのリプリーのK関数のさらなる適応は、空間と時間の両方でクラスター化、分散、またはランダムな核融合事象の発生を区別するために使用されます。

Introduction

VAMP-pフルオリン構築物またはトランスフェリン受容体(TfR)-pHuji構築物は、側耳球菌の優れたマーカーであり、これらのpH感受性フルオロフォアは、小胞と形質膜¹との間の融合孔口開口の直後に酸性小胞腔および蛍光の中で直ちに消光される。融合孔の開口部に続いて、蛍光は指数関数的に崩壊し、融合事象に関する情報を明らかにするいくつかの異質性がある。ここでは、exocytic イベントを自動的に検出して分析するグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) アプリケーションについて説明します。このアプリケーションは、pH感受性マーカー²によって明らかにされたexocyticイベントを自動的に検出し、分類目的³⁽図1A)に使用できる各イベントから特徴を生成することをユーザーに可能にする。また、リプリーのK関数を用いたエキサイトティックイベントクラスタリングの解析も説明する。

異なるエキソサイトモードへのエキサイトティックイベントの自動分類は最近報告^{されました 3}.2つの排泄物症のモード、フルベシクル融合(FVF)およびキスアンドラン融合(KNR)のエキソサイトーシスは、以前に^{4、5、6、7}を説明した。FVFの間に、融合細孔は拡張し、そして小胞は、形質膜に組み込まれる。KNRの間に、融合孔は一時的に開き^{、4、5、8、9、10}を再シールする。神経細胞化の4つのモードは、FVFに関連する2つ、KNRに関連する2つのニューロンの発達において同定された。この研究は、FVFとKNRの両方が、蛍光崩壊が始まる前に融解孔開口部または興奮性事象の後に直ちに蛍光減衰(FVFiおよびKNRi)に進む融合事象にさらに細分化できることを示している(図1B)。分類子は、各フュージョン イベントの exocytosis のモードを識別します。ここでは、この分析は、WindowsおよびMacベースのオペレーティングシステムでMATLABにインストールすることができるGUIに組み込まれています。すべての解析ファイルは、https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing または
https://github.com/GuptonLab。

Protocol

1. データセットとディレクトリを選択する

1. 分析するデータセットを選択するには、[データセットの 検索] ボタン (図 2A、 赤のボックス 1) をクリックして、データが格納されているフォルダー (たとえば、RawData フォルダー) に移動します。データファイルは、データファイルをリストとして自動的に設定します。フォルダーには複数のデータセットを含めることができます。
2. [ ディレクトリの選択 ] ボタンをクリックし、分析されたファイルが入金されるディレクトリ (たとえば Test) を選択します (図 2A、 赤いボックス 2) 。[分析] ボタンを押すと、フォルダと完成した解析ファイルのセットと中間の一時イメージがこのディレクトリに作成されます。ディレクトリが選択されていない場合は、エラーが発生します。

2. ピクセルサイズとフレームレートを設定する

1. 適切なフレームレートと画像のピクセルサイズを、適切な「フレームレート」または「ピクセルサイズ」ボックスに入力します(図2A、緑のボックス)。値が指定されていない場合 (デフォルトの "0" に設定されている場合)、プログラムは、ファイルに関連付けられたメタデータを検索して、フレームレートとピクセルサイズを探します。これらの値が見つからない場合、プログラムは、測定用にピクセル単位、タイム ポイントのフレーム単位にデフォルト設定されます。
   注: この例では、フレームレートは 100 で、ピクセル サイズは 0.08 です。

3. マスクを選択または作成する

1. [ マスク メーカー] ボタンを使用して、ファイル データセット リストのデータのセル マスクを自動的に作成します (図 2A、青いボックス)。 マスクメーカー ボタンを使用すると、選択したディレクトリにMaskFilesという名前の新しいフォルダが作成されます。「実行インジケーター」は、実行中に黄色に変わり、完了すると緑色に戻ります。
   注: データ ファイル リストの各ファイルのマスクは、イメージ ファイルの最初の 10 フレーム (イメージ ファイル内に 10 個未満の場合はすべてのフレームから) 作成され、適切な命名スキーム (下記を参照) を使用して MaskFiles フォルダに保存されます。
2. マスクファイルが自動的に「マスクファイル」リストに入力されるようにします。ユーザーは、直接分析に進むことができます。
   注: マスク ファイルを常に視覚的にチェックし、対象地域全体をキャプチャすることを確認します。選択すると、データ ファイルの最初のフレームとマスク ファイルが UI に表示されます。(図2B)マスクメーカーは、低信号対ノイズの場合にエラーを生成する可能性があるため、マスクファイルが適切であることを検証することは、品質管理にとって重要です。
3. マスクメーカーを使用する代わりに、画像のノイズへの信号が不十分な場合は、ImageJで手動でマスクを作成します。
   1. まず、ImageJ で生画像ファイルを開きます (図 3A)。
   2. [ ポリゴン選択 ]ボタンをクリックし、セルの周りにマスクを描きます。終了したら、最後のポイントをダブルクリックしてポリゴンを完成させます。
   3. 完了したら、[ 編集] |選択|マスクを作成 する (図 3B)。新しい反転マスクは、ポリゴンの描画に基づいて作成されます。マスクを、選択したディレクトリの指定された MaskFiles フォルダに保存します。マスク ファイルの命名スキームは、対応する個別のデータ ファイルの後に「_mask_file」を続ける必要があります。たとえば、データ ファイルの名前が "VAMP2_488_WT_1.tif" の場合、対応するマスク ファイルの名前は "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" にする必要があります。
   4. [マスクファイルの検索]ボタンを使用して、保存されたカスタム マスク ファイルの選択したフォルダに移動します。マスクは、マスクファイルをリストとして設定します。
      注: 分析を実行する前に、すべてのデータ ファイルにマスクを設定することが重要です。

4. 分析と特徴抽出

1. ディレクトリを選択し、[データ ファイル] リストと [マスク ファイル] リストにデータを入力したら、[ 分析 ] ボタン (図 4A)をクリックします。exocytic イベントの分類が必要な場合は、手順 5 に進みます。
   注: [分析 ] ボタンをクリックすると、データを分析するための一連の自動タスクが実行されます。選択したディレクトリに個別のフォルダを作成し、分析データをデポジットします。実行中に"実行インジケータ"は緑から黄色に変わります(図4A、赤いボックス)。解析が終了すると、緑に戻ります。
2. DataFiles フォルダ (図 4B) を検索し、各データ ファイルに従って名前を付けて、分析ファイルの完全なセット (および後で分類で使用する機能抽出ファイル) を検索します (図 4C)。
   注: これらの解析ファイルの説明は、以下の「代表的な結果」セクションに記載されています。

5. エキソキシイベントの分類

1. 自動検出と exocytic イベントの同時分類を実行するには、[分析] ボタンをクリックする前に[分類] チェックボックスをオンにします。exocytic イベントごとに、各クラスに対して確率スコアを 0 ~ 1 の間で割り当てます。exocytic イベントは、そのクラスの確率スコアが 0.5 >場合、4 つのクラスの 1 つとして分類されます。
   注: 分析が完了すると、選択したディレクトリ内に新しいデータ ファイル フォルダが表示されます。フォルダには、各画像ファイルに対応する解析ファイルが含まれます。

6. リプリーのK値を用いたエキソサイトーシスの時空間解析

1. 別の「神経突」と「相馬」マスクファイルを作成します。まず、空状から相馬をセグメント化します。神経突起から相馬をセグメント化する公平な方法はないため、ユーザーはコンディショニング実験に目をつぶり、最良の判断を使用する必要があります。明らかな神経突起の拡張子を持たない楕円体が推奨されます。
2. 画像J/フィジーを開きます。
3. マスクファイルをドラッグアンドドロップするか、 ファイル| マスク ファイルを開いて選択します。
4. カラーピッカーツールを使用して、マスクの背景にある黒いピクセルをクリックして、カラーを黒に設定します。
5. 多角形選択ツールまたはフリーハンドを使用して、相馬の周囲に輪郭を描き、それをニューライトから分離します。これには、手動での意思決定が必要です。
6. [編集] | 選択|マスクを作成します。新しい画像が開き、丸で囲まれた相馬が画像の残りの部分からセグメント化されます。これにより、相馬マスクファイルが作成されます。
7. 描画領域を移動せずに、元のマスク ファイルのヘッダーをクリックします。
8. [編集] | 円を描いた相馬を埋めるために記入し、神経突起だけがマスクのままになるようにします。
9. 別のノイライトとマスクファイルが取得されたら、両方のマスクファイルを 保存 します。
10. Matlabで「neurite_2D_network」を開きます。
11. MATLAB で、すべての解析データを含むディレクトリに移動します。
12. パス「マスク名」をノイライトマスクの名前に変更します。すなわち、「MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif」。
13. 「csv_file_name」をファイル fluorescent_traces.csvがある場所、つまり「MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv」に変更します。
14. [ 実行 ]をクリックして、ノイライトマスクファイルをスケルトン化します。これにより、neurite マスク ファイルのスケルトン化されたバージョンが作成され、マスクファイル フォルダの下に CSV ファイルとして保存されます。
15. 次に、ソーマの CSV ファイルを生成します。Matlabで「CSV_mask_creator.m」を開きます。
16. 相馬マスクの名前に「マスク名」のパスを入れて、すなわち、「マスクファイル/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. 作成する csv ファイル名に "書き込みマトリックス" を変更します。つまり、「マスクファイル/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv」
18. [ ファイルを実行 ]をクリックします。これにより、新しいVAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv ファイルが作成されます。
19. マスクファイルごとに6.14を繰り返します。

7. RStudio のセットアップ

1. Rstudio を開き、ripleys_k_analysis開きます。R ファイル。
2. ツール |にアクセスして、RStudio でパッケージ "spatstat" をインストールします。 パッケージをインストール し、「spatstat」と入力し、「 インストール」をクリックします。
   注: この操作は、Rstudio インストールごとに 1 回だけ実行する必要があります。
3. 各セッションの開始時に、ライブラリ・スパットスタットを実行します。
4. この場合は、"neuron_mask" と "neuron_datapoints" という 2 つの主な変数に注意してください。ニューロンマスクは、実行するマスクファイルのセット、すなわちソーママスクファイルを指しています。
   注: Neurite マスク ファイルとは別に、すべての相馬マスク ファイルを同時に実行し、その逆も同様です。
5. 分析する各ニューロンのマスクファイルの.csvを読み込みます。
6. 追加のneuron_mask_n+1をコピーして、複数のファイルを一度に実行します。これにより、セクション 8 で説明したスクリプトを使用して、リプリーの分析を集計できます。
7. 次に、2 番目の変数 "neuron_datapoints" を確認します。
8. を読んでください。exocytic イベントの x、y、t 位置、および 2D ネットワークの X,Y 位置の neurite 固有のファイルを含む解析プログラムによって生成された「X_fluorescent_traces.csv」ファイル(すべてのextracted_Rファイルを含む)。これは「neuron_datapoints」の位置に入ります。
9. RStudio で コードの選択|実行領域|すべてのを実行します。これにより、グループ化されたリプリーのK値や密度プロットなど、いくつかのプロットが生成されます。
10. [エクスポート] に行ってプロットを 保存|イメージを|として保存 適切なイメージ形式とディレクトリを選択し、適切なファイル名を入力して、[ 保存] をクリックします。
    注: ヒートマップのプロット関数は、スクリプト内で「plot(density(soma_data,0.4)」を使用して呼び出されます。ここでの数字"0.4"は、密度関数の平滑化を表します。ユーザーデータに適した方法で変更できますが、異なるヒートマップ間で比較を行う場合は、それらの間で同じ数にする必要があります。
11. Rstudio からイメージをエクスポートまたは保存します。ヒートマップをさらに編集する必要がある場合は、適切なファイルタイプ(SVG またはEPS)を選択します。

8. リプリーの分析

注:Ripleys_k_analysis。Rファイルも自動的にリプリーのk値プロットを生成しました。スクリプト全体を実行すると、以下に示す関数が自動的に実行されますが、スクリプトの各部分を個別に実行したり、解析を変更したりする場合は、詳細に説明します。

1. まず、各セルにエンベロープ関数を実行します。この関数は完全な空間乱数 (CSR) をシミュレートし、興奮性イベント ポイント パターンの Ripley の K 値をテストしました。
   Data_envelope_1 = エンベロープ (soma_data_1、ケスト、nsim = 19、セーブファン = TRUE)
   Data_envelope_2 = エンベロープ(soma_data_2、ケスト、nsim = 19、セーブファン = 真)
2. 次に、これらのエンベロープをプールし、グループの CSR の 1 つの見積もりを作成します。
   Pool_csr = プール(Data_envelope_1、Data_envelop_2,...)
   次に、すべてのデータポイントに対してリプリーのK関数を実行します。
   Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1、比率 = 真)
   Data_ripleys_k_2 = ケスト(soma_data_2、比率 = 真)
3. 完了したら、リプリーの K 値をプールし、次のコマンドで信頼区間をブートストラップします。
   データ プール = プール(Data_ripleys_k_1、Data_ripleys_k_2,...)
4. 次のコマンドでブートストラップ:
   Final_Ripleys_K = varblock(楽しい = ケスト、Data_pool)
5. データをプロットします。
6. ハード統計的な違いが必要な場合は、スパットスタットパッケージに学生化順列テストが含まれ、ポイントパターンのグループ間の違いをテストします。
   Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test、exocytic_events ~グループ、nperm = np)。

Results

ここでGUI(図2A)をTIRF(全内部反射蛍光)顕微鏡を用いて3DIVで3つのVAMP2-pHluorin発現ニューロンからのエキソキシティックイベントを解析するために利用した。E15.5皮質ニューロンを単離し、続いてVAMP2-pHluorinを用いたトランスフェクションと、Winkle et al.、2016およびViesselmannら^{、2011 11、12}に記載されているプロトコルを用いたメッキを行った。イメージングパラメータの方法論は、Urbinaら、 2018^2.簡単に言えば、TIRF顕微鏡を用いて、2分間100ms毎にニューロンの基底原形質膜を画像化した。図2、図3、図4は、エキサイトティック事象を分析するためのステップバ...

Discussion

exocytic検出および解析ソフトウェアを使用する場合、プログラムは入力としてファイル.tif可逆圧縮のみを受け入れることを考慮してください。.tifイメージ ファイルは、8 ビット、16 ビット、または 32 ビットのグレースケール (単一チャネル) イメージです。他の画像形式は、入力前にこれらのタイプのいずれかに変換する必要があります。参考として、ここで使用する例は 16 ビットのグレースケールイメージです。

自動検出プロセスに固有のタイムラプス画像セットは、自動背景減算とフォトブリーチ補正のために処理されます。背景の減算では、マスク ファイルのマスク領域の外側のピクセルは、画像全体のタイムラプスで平均化され、その平均値はイメージ セットから減算されます。フォトブリーチング補正では、ビデオの過程でマスク内のピクセルの平均蛍光に単一指数減衰フィットが適用され、補正された強度は次のように調整されます。

補正された強度 = (時間 t の強度) ÷ exp-k×t (k = 減衰定数)

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R	R コアチーム
https://www.r-project.org/ Rstudio	Rstudio、PBC		https://rstudio.com/