pH感受性蛍光プローブでマークされたエキソキシティックイベントを検出する自動コンピュータビジョンソフトウェアを開発しました。ここでは、グラフィカルユーザーインターフェースとRStudioを使用して、融合イベントの検出、融合の時空間的パラメータの分析と表示、およびイベントを個別の融合モードに分類する方法を示します。
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この記事について
サマリー
要約
小胞SNAREタンパク質に結合したpH感受性GFP(pHluorin)のタイムラプスTIRF顕微鏡は、細胞培養における単一の小胞性エキサイトイベントを可視化する有効な方法である。このような事象の公平で効率的な同定と分析を行うために、MATLABでコンピュータビジョンベースのアプローチが開発され、実装されました。分析パイプラインは、細胞セグメンテーションとexocytic-イベント識別アルゴリズムで構成されています。コンピュータビジョンアプローチには、蛍光減衰の半減期およびΔF/Fピークを含む単一事象の複数のパラメータを調査するためのツールと、エキソサイトーシスの頻度の全細胞分析が含まれる。これらの融合のパラメータと他のパラメータは、異なる融合モードを区別する分類アプローチで使用されます。ここで新しく構築された GUI は、最初から最後まで分析パイプラインを実行します。R StudioでのリプリーのK関数のさらなる適応は、空間と時間の両方でクラスター化、分散、またはランダムな核融合事象の発生を区別するために使用されます。
概要
VAMP-pフルオリン構築物またはトランスフェリン受容体(TfR)-pHuji構築物は、側耳球菌の優れたマーカーであり、これらのpH感受性フルオロフォアは、小胞と形質膜1との間の融合孔口開口の直後に酸性小胞腔および蛍光の中で直ちに消光される。融合孔の開口部に続いて、蛍光は指数関数的に崩壊し、融合事象に関する情報を明らかにするいくつかの異質性がある。ここでは、exocytic イベントを自動的に検出して分析するグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) アプリケーションについて説明します。このアプリケーションは、pH感受性マーカー2によって明らかにされたexocyticイベントを自動的に検出し、分類目的3(図1A)に使用できる各イベントから特徴を生成することをユーザーに可能にする。また、リプリーのK関数を用いたエキサイトティックイベントクラスタリングの解析も説明する。
異なるエキソサイトモードへのエキサイトティックイベントの自動分類は最近報告されました 3.2つの排泄物症のモード、フルベシクル融合(FVF)およびキスアンドラン融合(KNR)のエキソサイトーシスは、以前に
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プロトコル
1. データセットとディレクトリを選択する
- 分析するデータセットを選択するには、[データセットの 検索] ボタン (図 2A、 赤のボックス 1) をクリックして、データが格納されているフォルダー (たとえば、RawData フォルダー) に移動します。データファイルは、データファイルをリストとして自動的に設定します。フォルダーには複数のデータセットを含めることができます。
- [ ディレクトリの選択 ] ボタンをクリックし、分析されたファイルが入金されるディレクトリ (たとえば Test) を選択します (図 2A、 赤いボックス 2) 。[分析] ボタンを押すと、フォルダと完成した解析ファイルのセットと中間の一時イメージがこのディレクトリに作成されます。ディレクトリが選択されていない場合は、エラーが発生します。
2. ピクセルサイズとフレームレートを設定する
- 適切なフレームレートと画像のピクセルサイズを、適切な「フレームレート」または「ピクセルサイズ」ボックスに入力します(図2A、
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結果
ここでGUI(図2A)をTIRF(全内部反射蛍光)顕微鏡を用いて3DIVで3つのVAMP2-pHluorin発現ニューロンからのエキソキシティックイベントを解析するために利用した。E15.5皮質ニューロンを単離し、続いてVAMP2-pHluorinを用いたトランスフェクションと、Winkle et al.、2016およびViesselmannら、2011 11、12に記載されているプロトコルを用いたメッキを行った。イメージングパラメータの方法論は、Urbinaら、 20182.簡単に言えば、TIRF顕微鏡を用いて、2分間100ms毎にニューロンの基底原形質膜を画像化した。図2、図3、図4は、エキサイトティック事象を分析するためのステップバ.......
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ディスカッション
exocytic検出および解析ソフトウェアを使用する場合、プログラムは入力としてファイル.tif可逆圧縮のみを受け入れることを考慮してください。.tifイメージ ファイルは、8 ビット、16 ビット、または 32 ビットのグレースケール (単一チャネル) イメージです。他の画像形式は、入力前にこれらのタイプのいずれかに変換する必要があります。参考として、ここで使用する例は 16 ビットのグレースケールイメージです。
自動検出プロセスに固有のタイムラプス画像セットは、自動背景減算とフォトブリーチ補正のために処理されます。背景の減算では、マスク ファイルのマスク領域の外側のピクセルは、画像全体のタイムラプスで平均化され、その平均値はイメージ セットから減算されます。フォトブリーチング補正では、ビデオの過程でマスク内のピクセルの平均蛍光に単一指数減衰フィットが適用され、補正された強度は次のように調整されます。
補正された強度 = (時間 t の強度) ÷ exp-k×t (k = 減衰定数)
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開示事項
著者らは開示するものは何も宣言しない。
謝辞
コードと GUI のテストに関して、Dustin Revell とレジナルド・エドワーズに感謝します。資金は、R01NS112326(SLG)、R35GM135160(SLG)、F31NS103586(FLU)を含む、この研究を支援する国立衛生研究所によって提供されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R コアチーム | ||
| https://www.r-project.org/ Rstudio | Rstudio、PBC | https://rstudio.com/ |
参考文献
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal orga....
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再版と許可
