NAFLD/NASHラットモデルにおける超音波および剪断波エラストグラフィーイメージングの応用

サマリー

このプロトコルは、非アルコール性脂肪性肝疾患のげっ歯類モデルにおける肝臓組織の変化を非侵襲的に観察し、定量化するための強化された超音波技術の使用を記述する。

要約

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、肝脂肪蓄積(脂肪化)および線維症につながる炎症を特徴とする非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)のスペクトル内の状態である。ヒトNASH/NAFLDを密接に再現する前臨床モデルは、医薬品開発に不可欠です。肝臓生検は現在、クリニックでNAFLD/ NASHの進行と診断を測定するためのゴールドスタンダードですが、前臨床空間では、研究中の複数のタイムポイントでの肝臓サンプル全体の収集または肝臓の生検のいずれかが、疾患段階を評価するために組織学的分析に必要です。

肝臓生検の中期研究は侵襲的で労働集約的な手順であり、肝臓サンプルを収集して疾患レベルを評価すると、研究に必要な研究動物の数が増加します。したがって、これらの前臨床モデルでNASH/NAFLDを検出するための信頼性の高い、翻訳可能な非侵襲的なイメージングバイオマーカーが必要です。非侵襲的超音波ベースのB-モード画像および剪断波エラストグラフィー(SWE)は、肝線維症と同様に、ステアトーシスを測定するために使用することができる。NASHの前臨床げっ歯類モデルにおけるSWEの有用性を評価するために、動物はプロNASHダイエットに置かれ、非侵襲的な超音波Bモードおよび剪断波エラストグラフィーイメージングを受け、肝腎(HR)指数および肝臓弾力性を測定し、それぞれ肝臓脂肪蓄積と組織剛性の両方の進行を測定した。

HR指数と弾性数を、スティーアトーシスおよび線維症の組織学的マーカーと比較した。結果は、HR指数とオイルレッドO(ORO)染色の割合、ならびに弾力性とピクロシリウスレッド(PSR)肝臓の染色との間に強い相関関係を示した。古典的な ex vivo 法とin vivo イメージング結果との間の強い相関関係は、NAFLD/NASHの前臨床モデルにおける疾患表現型および進行を評価するために剪断波エラストグラフィー/超音波ベースのイメージングが使用できることを示す証拠を提供する。

概要

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、肝臓における脂肪の過剰な蓄積を特徴とする代謝状態であり、最近報告された世界的な有病率25%1で急速に世界的な肝臓の病気になりつつある。非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、進行性の細胞損傷、炎症、および線維症を有する過剰な肝臓脂肪を特徴とするNAFLDのスペクトルのより進行した段階である。これらの病気は、患者の肝臓にかなりの損傷が発生するまで、血液検査や定期検査によって検出されない沈黙であることが多い。現在、患者のNASHを診断するためのゴールドスタンダードは、患者由来の肝臓生検サンプルの組織学的検査を通じて行われています。同様に、NASH/NAFLDの病因を理解するために働く前臨床研究者は、肝臓サンプルの生体内バイオプーゼまたは組織学のための衛星コホートの末期安楽死に基づいて、ステアトーシス、炎症、線維症を測定します。

例えば、肝臓ウェッジ生検は、GUBRA NASHモデル²を用いた間に脂肪性肝炎および線維症を評価するための標準的な技術であった。肝臓ウェッジ生検法は、小動物³において侵襲的かつ骨の折れる。研究の途中でくさび肝生検を使用すると、疾患モデルに追加された実験変数が表され、必要な動物の数が増えることが多い。これらの要因を念頭に置いて、早期の時点でNASH / NAFLD動物モデルにおけるスティートーシスおよび線維症を確実に評価するために使用できる非侵襲的なイメージング技術は価値があることを証明する。剪断波エラストグラフィー(SWE)は、軟組織の弾性を測定するために使用される超音波ベースの方法です。この技術は、組織ターゲットに向けられた超音速超音波パルスによって作成されたせん断波の伝播を測定し、次にE率⁴と呼ばれる値を計算する。せん断波の速度は、組織の剛性の程度に比例します。

図1 と 図2 は、イメージング領域の設定とSWE計測器を示しています。SWEインストゥルメントは、2つの画面と 図2Aに示すコントロールパネルを備えた単一の車輪付きユニットです。上部モニター (図 2B)は、コンピュータモニタとして機能し、画像と患者ディレクトリを表示します。コントロールパネル(図2C)は、画面の凍結、画像の保存、モード間の変更など、画像キャプチャの一般的な側面を制御するボタンとダイヤルの配列です。下の画面(図2D)は、設定を変更するための追加のコントロールを備えたタッチスクリーンであり、必要に応じてデータを入力するためのキーボードとして機能します。楽器は、必要に応じてタッチスクリーン上で使用するスタイラスが装備されています。超音波プローブは、デバイスの下部フロントパネルに取り付けます。げっ歯類におけるBモードおよびSWEイメージングでは、超線形6〜20MHzトランスデューサが使用された。非侵襲的に組織の剛性を測定するこの能力は、SWEをNASH患者における肝線維症⁵ の同定およびステージングのための貴重なツールとなり、より侵襲的な方法の必要性を減少させる。SWEは、実際には、患者における肝線維症を測定するために使用されており、診療所⁶で線維症をスコアするFDA承認の方法である。SWEを使用して病気の動物モデルにおけるNASHの進行を監視することは、治療の開発のための翻訳ツールを提供し、同時に痛みや苦痛を最小限に抑えるための動物被験者数の減少と in vivo 手順の洗練を通じて動物の福祉を改善するであろう。

ヒト患者におけるSWEイメージングは、小動物には理想的ではない低周波超音波トランスデューサ⁴を使用する。特に、高周波SWE技術は、ラットモデル⁷におけるNASHの病因に対するアセチルCoAカルボキシラーゼ阻害の有効性を評価するために使用されており、この技術の有用性は、従来のMETAVIR組織学的採点方法⁸と比較した場合に肝線維化の四塩化炭素ラットモデルに記載されている。しかし、既存の文献には、NASHの前臨床モデルにおけるSWEイメージングの応用に関する詳細な技術と方法論情報が欠けている。前述のように、肝ステアトーシスはNAFLD/NASH状態の重要な特徴の1つであり、介入を考慮することができる重要な段階である。したがって、画像化モダリティを用いた肝脂肪蓄積の評価は、NASH/NAFLDの前臨床モデルにおける肝線維症の評価と同様に重要である。

HR指数として知られている超音波技術は、腎皮質のそれと比較して肝臓の組織の明るさの比率、クリニック^9、10におけるステアトーシスの代理マーカーとして使用されている。しかし、このアプローチは、NAFLD/NASHの前臨床動物モデルにおいて広く使用されていない。この記事では、NAFLD/NASHのコリン欠乏、高脂肪食(CDAHFD)ラットモデルで、肝線維症と脂肪症の代理マーカーとしてのHR指数と同様に弾力性を測定する方法について説明します。このモデルは、マウス¹¹において6週間以内に測定可能な迅速なスティートーシス、肝臓炎症、および線維症を誘発する。この食事療法へのコレステロール(1%)の添加は、ラット¹²における線維形成を促進することが示されており、このモデルはせん断波イメージングを含む検証研究に適した候補となる。全体的に、この画像化技術はまた、ステアトーシスおよび/または線維症が関心のエンドポイントであるNASHモデル/ダイエットの広い範囲に適用することができる。

プロトコル

すべての動物関連の手順は、ファイザーの制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって審査され、承認され、AAALAC(実験動物ケアの評価と認定)国際認定施設で行われました。

1. 病気の誘導

1. 既知のラットの虫着病原体を含まない雄のウィスターハンラット(150-175 g;〜6〜7週齢;合計40ラット)を使用する。紙の寝具( 材料表を参照)で個別に換気ケージでペアでラットを収容し、12:12 hの明暗サイクルで22±1°C、40〜70%の相対湿度で維持します。
2. 150-175 g(〜6-7週齢)のラットを、研究の設計に応じて、1%コレステロール(n = 20)または標準的な実験室げっ歯類チャウ(n = 20)を有するコリン欠損、高脂肪食に置く。
   注:本研究では、1群につき合計40匹のラットが20匹の動物と一緒に登録された。6^週 目の終わりに、各群のコホートの半分を肝臓サンプルの中期研究組織学的分析のために壊死させた。したがって、サンプルサイズは、9番目および12^番目 の週のタイムポイントについて、グループあたり10匹^の 動物であった。

2. 計器のセットアップ

1. イメージング領域を次のように設定する:イメージング中に動物を暖かく保つための温められた表面( 図1のc)と、手順全体を通して麻酔の面を維持するために吸入麻酔を提供する固定麻酔ノーズコーンを含む( 図1のb)。
2. 超音波プローブホルダーを使用して、超音波プローブを所望の場所に移動させ、プローブが動物の上に置かないようにします。
   1. 超音波画像が取得された皮膚に温め超音波ゲルを使用してください。
   2. 手順全体を通して、タッチ スクリーンで調整できる設定を維持します。ティッシュの調整者1540のm/s;ダイナミックレンジ60 dB;弾性範囲(SWEモード)は30kPa<。
3. 超音波プローブを専用ホルダーのレールシステムに取り付けます(図1)。
4. 計測器のスイッチを入れ、起動できるようにします。モニタの電源が入ったら、接続されたトランスデューサの詳細を持つ Bモード 画像に注意してください。

3. 対象準備

1. 腸の内容が画像取得を妨げないように、画像処理の少なくとも4時間前に動物が断食されていることを確認してください。
   1. 少なくとも4時間の断食後、適当なレベルの麻酔に達するまでイオブルラン麻酔誘導室にラットを入れ、つま先ピンチに対する応答がない状態で確認する。3-5分間3〜5分間イオブルランに動物をさらして麻酔を誘発する。
   2. 維持麻酔のために、画像の取得中に2-3%イオブルランの下で動物を保つ。眼科軟膏を適用して、麻酔中の乾燥から眼を保護します。
2. 麻酔ができたら、誘導室から動物を取り出し、暖かいお湯の循環毛布の上に置きます。鼻の上に麻酔の鼻コーンを置き、胸部から骨盤まで、動物を右側に剃ります。この領域内の残りのすべての毛髪を除去するために化学脱毛クリームを使用してください。
3. 髪を取り除いたら、動物を左横の遅れに置き、上足を頭の上にテープで張った暖かいイメージングプラットフォーム(図3A)に置きます。
4. 計器コントロールパネルの Patient キーを押して、スタディの設計に従って対象を特定します。
   1. タッチスクリーン上のアイコンをタップして、楽器の キーボード 機能を開きます。必要に応じて名前を入力します。
   2. [終了]をタップして、患者名画面を終了します。モニタで B モードが再び開くことを確認します。

4. ヘパト腎(HR)指数測定用画像取得

1. 少量の温め付き超音波ゲルを動物の脱毛皮膚領域に塗布する。
2. 超音波プローブを移動して、被験者のゲルで覆われた領域に触れる(図3B)。被験者の内臓のライブBモード画像がモニターに現れたら、超音波プローブを腰の少し上の領域に移動し、腰椎(矢状面)と平行に動かす。
3. モニターのBモードディスプレイを使用して、大きな腎動脈と皮質/髄質分離を特定することによって右の腎臓を見つける(図4A)。さらに、画像の単一の平面で肝臓の一部を観察します。
   1. シャドウや気泡などのイメージアーティファクトがほとんどないか、まったく存在しないようにします。
4. B モード比を測定して、HR インデックスを取得します。
   1. 腎皮質と肝臓のパレンチマの両方が同じ焦点面にあることを確認してください。必要に応じて、フォーカスを調整し、明確な画像を得るために制御を得る。
      1. コントロールパネルのフォーカスつまみを回して フォーカス を調整します。 自動TGC ボタンを1回押してゲインを調整します。
   2. コントロールパネルの フリーズ キーを押します。画像のぼやけを避けるために、画面をフリーズする際に、動物が呼吸の間にあることを確認してください。
   3. 画面がフリーズしたら、タッチスクリーンの [計測ツール ]をタップします。B モード比率を選択し、選択した関心領域の組織の相対的な明るさを測定する組み込みのツールです。2 mm の円を作成して、関心領域 (ROI) を選択します。コントロールパネルのトラックボールの外縁に沿って指を動かして、円のサイズを調整します。
   4. 腎臓の右側に配置する必要があります肝臓画像ROIに2ミリメートルの円を配置します。均質なエコー原性と滑らかな輪郭に基づいて肝臓組織を同定する。
   5. 円が配置されたら、コントロールパネルの 選択 ボタンを押し、表示される新しい円を確認します。
   6. 新しい円の大きさを2mmに調整し、腎臓皮質の画像に置きます。肝臓と腎臓皮質の円の深さを同じに保つようにしてください。配置したら、コントロールパネルの 「選択 」ボタンを押します。組み込みのシステムツールに、人事指数がBモード比で表示されます。
   7. [イメージの保存]を押して画像を保存し、保存した画像がモニターの右側にサムネイルとして表示されることを確認します。
   8. コントロールパネルの 「フリーズ 」ボタンを押して、イメージのフリーズを解除し、ライブ B モードのイメージに戻ります。
5. 異なる深さと組織の平面でBモード比測定を3回繰り返します。動物とタイムポイントごとに、これら 3 つの B モード比の平均値を計算します。

5. せん断波エラストグラフィー用画像取得

1. Bモードを使用して肝臓を見つけるために右の肋下領域でプローブを横断的に移動します。主にパレンチマであり、門脈や肝動脈などの大きな血管のない肝臓の領域を見つけます。肝臓の透明な領域が見つかったら、コントロールパネルの SWE ボタンを押して組織のせん断弾性マップを生成する。
2. 影のない領域で肝臓カプセルの下のSWEボックスのサイズと位置を調整します。カプセルを肝臓の上部付近の明るいエコー原性ラインとして識別します。.
3. SWE ボックスが 5 ~ 10 s 以内のカラー マップに遷移することを確認します。ボックスが満杯で安定したら、動物が呼吸の間にあるときにコントロールパネルの フリーズ ボタンを押します。
   注:ボックスカバレッジの最小量は、肝臓の弾力性を正確に評価するために60〜80%でなければなりません。
4. タッチ スクリーンで、せん断波弾性マップ上の ROI から弾性を計算する組み込みのシステム ツール QBoxをタップします。モニタに表示される円とデータボックスを確認します。タッチスクリーン上の位置アイコンをタップして、QBoxの位置を調整します。
5. コントロールパネルのトラックボールの外縁に沿って指を動かして、円のサイズを3mmに調整します。トラックボールを使用して、均一な色で影のない領域に円を配置します(図5A、B)。血管や肝臓カプセルなどの剛性の既知の領域を避けるために注意してください, だけでなく、これらの構造からの出血ダウン.
6. 適切な領域が見つかったら、コントロールパネルの 「イメージを保存 」を押してイメージを保存します。肝臓の異なる領域でこの手順を 3 回繰り返します。.プローブを腹部の上下または横に動かして、肝臓の異なる領域からSWEマッピングされた画像を収集します。
7. すべての画像が収集されたら、コントロールパネルの End Exam を押し、モニタに表示される患者情報画面をメモします。
8. 動物の足からテープを取り出し、余分なゲルを拭き取り、画像処理段階から動物を取り除きます。完全に回復するまで、それ自体で暖かく、乾燥ケージ内の麻酔から回復することを許可します。胸骨の不全を維持する能力によって示される麻酔からの完全な回復を確実にするために各動物を監視する
9. コホート内の動物ごとに、4~5のセクションの手順を繰り返します。

6. 画像データの取得と解析

1. すべての動物の画像が収集されたら、麻酔をオフにします。
2. マシンから画像データを取り出すには、コントロールパネルの 「レビュー」 ボタンを押して、モニタに表示される計測器で実行されたすべてのスキャンを確認します。画面の上隅にある検索ウィンドウを使用して、目的のスキャンを検索します。
3. トラックボールと選択ボタンを使用して患者の名前の横にあるボックスをチェックして、データ分析に必要なすべてのスキャンを 選択 します。必要なスキャンをすべてハイライト表示したら、タッチスクリーンで [JPEGをエクスポート ]を選択します。ネットワーク ドライブまたはポータブルユニバーサル シリアル バス (USB) ドライブにデータをエクスポートします。計測器の背面にあるUSBポートを探します。
4. ファイルがエクスポートされたら、ワークステーションコンピュータ上の各スキャンの個々のjpgファイルを開きます。画像の右側にあるすべてのデータを観察する:Bモード比-B比番号を収集します。Q ボックスは平均弾性(kPa)値を収集します。
5. すべてのデータをスプレッドシートまたは他のデータベース管理ソフトウェアに入力し、目的の統計分析を実行します。

7. 肝臓サンプルの組織学的分析

1. 6^週 目の終わりに、肝臓サンプルの中期研究組織学的分析のために、各群のコホートの半分に壊死を行う。同様に、動物のコホートの残りの部分を安楽死させ、第12^週 のタイムポイントで組織学的分析のための肝臓サンプルを収集する。
2. ORO染色の場合、肝臓切片を10%中性緩衝ホルマリンに固定し、少なくとも一晩冷蔵30%スクロース溶液を使用してスクロースで凍結保存します。最適な切断温度化合物にセクションを凍結埋め込み、ORO染色の準備のために充電されたスライドにクライオセクション。
3. クライオ切片を100%プロピレングリコールに2分間入れ、続いて0.5%ORO溶液で一晩インキュベーションを行います。ORO溶液から除去した後、85%プロピレングリコールのセクションを1分間分け、脱イオン水でリンスし、マイヤーのヘマトキシリン・リリーの変性を1分間に対抗します。
   1. 水性実装媒体を使用してスライド上にカバースリップを置き、室温で乾燥させます。
4. PSRの場合、ホルマリン固定、パラフィン埋め込み肝セクションスライドを脱パラフィン化し、ブイン流体に一晩置き、いくつかの最適化されたステップ(1%ホスホモリブディック酸5分、0.1%シリウスレッドの飽和ピク酸の90分、2x30 s)を使用して、自動化されたスライド染色剤を使用して、ace.5%の酸を洗浄します。自動的にスライドを脱水し、永久的な取り付け媒体でそれらを取り付けます。
5. デジタル顕微鏡スキャナを20倍の倍率でOROとPSR染色されたスライドの画像をキャプチャし、.svs形式で保存し、スライドマネージャの画像データベースに保存します。
6. デジタル病理学ソフトウェアで作成されたカスタムアルゴリズムを使用して画像を分析します。閾値パラメータを持つデジタル病理ソフトウェアアプリケーションを均一に適用して、肝臓切片領域、およびORO染色領域およびPSR染色領域を同定し、定量化します。面積のパーセンテージ計算のために、測定値をスプレッドシートにエクスポートします。

8. 統計分析

1. シダックの多重比較テストを使用して、異なる時間ポイントでのグループ間の差を評価することにより、双方向ANOVAを使用してイメージングデータの統計解析を実行します。確率値 p ≤ 0.001 のグループ間で有意な差があると仮定します。また、イメージング読み出しと組織学的解析の相関を行います。
2. 非パラメトリック統計を使用して、この研究の組織学的解析結果を分析します。グループ値を半四分位範囲 (sIQR) ±中央値として報告します。確率値 p ≤ 0.001 のグループ間で有意な差があると仮定します。マン・ホイットニー検定を使用して、異なるグループ間のPSRとOROの組織化学的染色の量を比較します。

結果

CDAHFDを与えられた動物の特徴の一つは、ステアトーシスである。肝臓での脂肪の蓄積は、肝臓の明るさを測定し、同じ平面で撮影されたBモード画像から腎皮質の明るさにそれを正規化することによって定量することができる組織のエコー原性特性を変化させる。定量化された値は、ステアトーシスの間接的な尺度であるHR指数として表されます。 図4Aにおいて、対照動物からの代表的な肝臓像は、腎皮質と比較してほぼ同等以下の明るさ(エコー原性)を示す。したがって、通常の動物のHR指数は<1である。本研究では、3週間のタイムポイントにおけるコントロール動物の平均HR指数は0.645±0.03である。対照的に、CDAHFD供給動物の代表的なBモード画像(図4A)は、腎皮質と比較して肝臓の明るさが増加していることを示している。その結果、CDAHFDダイエット動物からの代表的な画像のHR指数は、それぞれ6週と12週のタイムポイントで1.91と1.79であった。

ディスカッション

SWEを含む超音波ベースのイメージングは、NAFLD/NASHの前臨床モデルにおける肝ステアトーシスおよび剛性の縦断評価のための非常に貴重なツールとなり得る。本論文では、NASHのCDAHFDダイエット誘導ラットモデルを用いて、HR指数と弾力性の測定のための肝臓のSWE画像と同様に、高品質のBモードを取得する方法についての詳細な方法論を説明する。また、この結果は、HR指数と弾性と肝臓組織の評価組織評価のゴールドスタンダードとの優れた相関を示す。手順自体は単純に見えますが、プロトコルには成功を収める重要な側面がいくつかあります。

トランスデューサの配置は、特にBモードでHR指数を測定する腎臓を探す場合に重要です。プローブを肋骨の近くに置きすぎると肋骨の影が生じ、超音波減衰の誤った尺度が生じる。さらに、シェービングクリームと脱毛クリームの両方を使用してすべての髪の除去は、残りの髪がBモード画像に影を落とす気泡をトラップすることができるように、重要です。最後に、胃および腸内の食物の存在は、特に正常なチャウ供給動物において肝臓を覆い隠すことができるので、すべての動物の十分な断食は肝臓のイメ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Aixplorer	超音速		横波エラストグラフィ装置
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 トランスデューサ	超音速 横	波エラストグラフィ用イ
Alpha-dri寝床			ラットケージ
Aperio AT2 スキャナ	ライカバイオシステムズ		デジタルパソロジー 明視野スキャナ
Compac 6麻酔システム	VetEquip		は、麻酔気化器とデリバリーシステムです。ただし、任意の麻酔送達システムを使用できます。
イメージャーデータベースの管理	ライカバイオシステムズ		デジタルパソロジー
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E染色/組織学
ナイール	教会&ドワイト		ヘアリムーバーオイル
レッドO溶液	ポリサイエンティフィック		脂質染色/組織学
ピクロシリウスレッドステイン(PSR)	ローリー生化学	F-357-2	染色/組織学
Puralube眼科軟膏	クラ獣医製品		麻酔中の目の乾燥を防ぐための潤滑
ッシュテックプリズマプラス	サクラファインテックUSA		自動スライドステイナー
VISIOPHARMソフトウェア	Visiopharm		デジタルパソロジーソフトウェア
	研究用ダイエット	A06071309i	NASH誘導ダイエット
	ピュリナ	5053	コントロールアニマルチャウ
Vevoイメージングステーション	富士フイルム VisualSonics		Vevoイメージングステーションは、イメージング中に超音波トランスデューサを保持するために使用されます。
ウィスター・ハン・ラット	チャールズ・リバー・ラボラトリーズ