本稿では、神経芽細胞腫のゼブラフィッシュモデル、特に自発的に転移を発症する MYCN および LMO1の過剰発現を伴うトランスジェニックゼブラフィッシュ系統における腫瘍転移をリアルタイムで発生、特徴付け、および追跡する方法を紹介する。
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この記事について
サマリー
要約
ゼブラフィッシュは、ヒトの疾患、特に癌を研究するための重要な動物モデルとして浮上している。ゼブラフィッシュのモデリングに適用される堅牢なトランスジェニックおよびゲノム編集技術に加えて、メンテナンスの容易さ、高収率の生産性、および強力なライブイメージングにより、ゼブラフィッシュは、このプロセスの根底にある転移および細胞および分子基盤をインビボで研究するための貴重なモデルシステムとなっています。転移の最初のゼブラフィッシュ神経芽細胞腫(NB)モデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で、2つの癌遺伝子、MYCNおよびLMO1を過剰発現させることによって開発された。MYCNおよびLMO1を共発現させることは、神経芽細胞腫形成の潜伏期間の減少および浸透度の増加、ならびに腫瘍細胞の遠隔転移の加速をもたらした。この新しいモデルは、臨床的に関連する遺伝子改変および転移関連遺伝子改変の関与を含む、ヒト転移性NBの多くの重要な特徴を確実に繰り返している。インビボでの転移の自然および自発的な発生;転移の保存された部位。したがって、ゼブラフィッシュモデルは、インビボでの腫瘍転移の複雑なプロセスを解剖するユニークな利点を有する。
概要
ゼブラフィッシュは広く使用されており、特に癌において、いくつかの研究分野に適用されています。このモデルは、堅牢な再生、費用対効果の高いメンテナンス、腫瘍の成長と転移の汎用性の高い視覚化など、多くの利点を提供し、ゼブラフィッシュを腫瘍形成と転移の細胞および分子基盤を研究および調査するための強力なツールにします。大規模なゲノムマッピング、トランスジェネシス、遺伝子の過剰発現またはノックアウト、細胞移植、および化学スクリーニングのための新しい技術は、ゼブラフィッシュモデルの力を非常に増強しました1。過去数年間、白血病、黒色腫、横紋筋肉腫、肝細胞癌を含むがこれらに限定されない様々なヒト癌の腫瘍形成および転移を研究するために、多くのゼブラフィッシュ系統が開発されてきた2,3,4,5。さらに、神経芽細胞腫(NB)の最初のゼブラフィッシュモデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で末梢交感神経系(PSNS)において癌遺伝子であるMYCNを過剰発現させることによって生成された。このモデルでは、活性化ALKがMYCNと相乗作用して腫瘍発症を加速し、....
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プロトコル
ゼブラフィッシュと動物のケア/メンテナンスを使用したすべての研究方法は、メイヨークリニックの施設ガイドラインに準拠して実施されました。
1. PSNSにおいて過剰発現を有する LMO1 トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の開発のための導入遺伝子構築物の調製およびマイクロインジェクション
- LMO1-pDONR221エントリークローンを開発するには、PCRを用いてヒト細胞株から得られたcDNAからヒトLMO1のコード領域を増幅する。
- 10 標準 Taq 反応バッファー 2.5 μL、 Taq DNA ポリ メラーゼ 0.125 μL、10 mM dNTP 0.5 μL、cDNA テンプレート 2 μL、10 μM フォワード LMO1 ATTB1 プライマー 0.5 μL、10 μM 逆 LMO1 ATTB2 プライマー 0.5 μL 、および水 18.875 μL です。
注: 前方 LMO1 ATTB1 プライマーを使用してください: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' および逆 LMO1 ATTB2 プライマー: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
GAACTTGGGATTCAAAGGT-....
- 10 標準 Taq 反応バッファー 2.5 μL、 Taq DNA ポリ メラーゼ 0.125 μL、10 mM dNTP 0.5 μL、cDNA テンプレート 2 μL、10 μM フォワード LMO1 ATTB1 プライマー 0.5 μL、10 μM 逆 LMO1 ATTB2 プライマー 0.5 μL 、および水 18.875 μL です。
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結果
LMO1がMYCNと相乗作用してNBの病因に影響を及ぼすかどうかを決定するために、dβhプロモーターの制御下にあるPSNS細胞におけるLMO1(dβh:LMO1およびdβh:mCherry)またはMYCN(dβh:EGFP-MYCN)のいずれかの発現を駆動するトランスジェニック構築物をゼブラフィッシュ胚に注入した13。 図1Aに例示されるように、安定なトランスジェニック株の発達およびそれらの遺伝子型の検証の後、ヘテロ接合型MYCNおよびLMO1魚が交配された。彼らの子孫は、それぞれ1dpfまたは3-4dpfでMYCN(EGFP+)またはLMO1(mCherry+)発現についてソートされた。MYCN過剰発現はPSNSの発達を抑制することが示されている6。し.......
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ディスカッション
ゼブラフィッシュは、メンテナンスの容易さ、堅牢な再生、in vivoイメージングの明確な利点などの明白な理由から、過去数十年間、特にがん研究で一般的に使用されてきました1,28。ゼブラフィッシュモデルは、大規模な遺伝学的研究のために、ラットやマウスなどの哺乳類モデル生物をうまく補完する外部受精および発達のために、胚的に容易に操作することができます1,2,3。さらに、ゼブラフィッシュゲノムはヒトゲノムと高いレベルの類似性を有する。ゼブラフィッシュゲノムの詳細な注釈をヒト参照ゲノムと比較すると、ヒト遺伝子の約70%がゼブラフィッシュオルソログ29を得ることが示されている。さらに、研究におけるゼブラフィッシュの他の用途は、個別化がん治療のための創薬および患者アバターに拡張されて.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この研究は、国立がん研究所からの助成金R01 CA240323(S.Z.)によって支援された。米国国防総省(DoD)からの助成金W81XWH-17-1-0498(S.Z.)。V Foundation for Cancer Research(S.Z.)のV奨学生賞とMayo Center for Biomedical Discovery(S.Z.)のプラットフォーム助成金。メイヨークリニックがんセンターと個別化医療センター(S.Z.)からの支援。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)ベクトルキット | ベクトル | SK-4100 | |
| 酢酸 | フィッシャーサイエンティフィック/アクロス有機 | 64-19-7 | |
| アガロースGP2 | 西部科学 | 009012-36-6 | |
| チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体 | ペルフリーズ | P40101 | |
| ビジン/ビオチンブロッキングキット | ベクトルSP-2001 | ||
| BOND Intense R Detection | ライカバイオシステムズ | DS9263 | |
| BOND 一次抗体希釈剤 | ライカバイオシステムズニューカッスル | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC装置 | ライカバイオシステムズ・ニューカッスル(株) | N/A | 全自動IHC染色システム |
| CH211-270H11 BACクローン | BACPACリソースセンター(BRFC) | 該当なし | |
| DP71カメラ搭載化合物顕微鏡 | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (キシレンベースの封入剤) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (準備不要) |
| エタノール | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN 11681834001 | ||
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| ヤギ抗Rb二次抗体(ビオチン化) | Dako | E0432 | |
| ヘマトキシリン溶液、ハリス修正 | シグマ アルドリッチ ケミカル カンパニー / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP アビジン D | ベクター | A-2004 | |
| 塩酸 | アクア ソリューション | 4360-1L | |
| 過酸化水素、3% | フィッシャー サイエンティフィック | H324-500 | |
| I-SceI 酵素 | ニューイングランド バイオラボ、マサチューセッツ | R0694L | |
| 硫酸カナマイシン | テクノバ(株) | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| 炭酸リチウム | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| 切片化用ミクロトーム | ライカバイオシステムズ | RM2255 | |
| ワンショット TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a 寛大な贈り物 (資料を入手するには、説明されているように自由に配布できるウェブページ http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page を参照してください。 |
| パラフィンワックス | Surgipath Paraplast | 39603002 | パラフィンからパラフィンへ |
| パラホルムアルデヒド | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST ベクター (I-SceI 認識部位を含む修正された目的地ベクター) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a 寛大な贈り物 |
| pDONR 221 ゲートウェイ ドナー ベクター | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R ドナーベクター | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a a 寛大な贈り物 |
| フェノールレッド、0.5% | シグマ アルドリッチ | P0290 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius 赤染色キット | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| プロテイナーゼ K、組換え、PCR グレード | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO急速脱灰剤 | Apex Enginerring | RDO04 | |
| アジ化ナトリウム (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| 実体蛍光顕微鏡 | ライカ | MZ10F | |
| デジタルサイトを搭載した立体蛍光顕微鏡 DS-U1 イメージング用 | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| ティッシュテックVIP® 6 AI 真空浸透プロセッサ | さくら | N/A | モデル #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| キシレン | サーモフィッシャー サイエンティフィック X3P1GAL |
参考文献
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <....
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