マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

Summary

ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。

Abstract

クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子(TF)、クロマチン調節因子、ヒストン修飾の全ゲノム位置をマッピングし、TF結合パターンおよびヒストンポスト修飾を明らかにするための全ゲノムを検出するための強力で広く使用されている分子技術です。ヒストンメチル化などのクロマチン修飾作用は、特定の遺伝子調節配列に採用されることが多く、クロマチン構造の局所的な変化を引き起こし、特定の転写効果を生じる。米の爆発は、世界中の米に壊滅的な真菌病であり、真菌と植物の相互作用を研究するためのモデルシステムです。しかし、ヒストン修飾が Magnaporthe oryzae の毒性遺伝子をどのように調節するかの分子メカニズムは依然として不可解である。より多くの研究者は、ヒストンエピジェネティック修飾が標的遺伝子をどのように調節するかを研究するためにChIP-seqを使用する必要があります。また、動物や植物のタンパク質とDNAの相互作用を研究するために広く使用されていますが、植物病理学の分野ではあまり使用されておらず、十分に開発されていません。本論文では 、M.オリザ エの機能性標的遺伝子に結合するヒストンメチル化(H3K4me3など)のゲノム全体分布を同定するための、ChIP-seqの実験過程と操作方法について述べた。ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。

Introduction

エピジェネティクスは、遺伝子の塩基配列を変化させることなく遺伝子発現の遺伝性変化を指す遺伝子研究の一分野です。エピジェネティックな調節が真核細胞の増殖と発達において重要な役割を果たしていることを示す研究が増えているが、折りたたみと組み立ての動的過程を通じて遺伝子発現を制御し、影響を与えるクロマチンを含む^1,2.クロマチンリモデリングおよび共有ヒストン修飾は、クロマチンポリマーの変動を通じてクロマチンの機能および構造に影響を及ぼし、それにより遺伝子発現^{3、4、5、6}を調節する機能を達成する。ヒストンの翻訳後修飾には、アセチル化、リン酸化、メチル化、モノユビキチン化、相総化、およびADPリボシル化^7、8、9が含まれる。ヒストンH3K4メチル化、特にトリメチル化は、真核生物^10,11における転写複製、再結合、修復、およびRNA処理に関連する転写開始部位にマッピングされている。

ChIP-seq技術は2007年に導入され、転写制御およびエピジェネティック機構^12,13のゲノム全体解析の実験基準となっている。この方法は、ゲノムワイドスケールで、DNA結合タンパク質のDNAセグメントを含むヒストンまたは転写因子相互作用情報を得るのに適している。目的のタンパク質に架橋されたDNA配列は、クロマチン複合体の一部として共沈殿します。新世代シーケンシング技術は、36-100bpのDNAを配列するためにも使用され、その後、対応する標的ゲノムと一致する。

植物病原性真菌では、最近、ヒストンメチル化修飾が病原性の過程で標的遺伝子をどのように調節するかを研究し始めている。いくつかの以前の研究は、ヒストンメチラーゼ関連遺伝子の調節が主に遺伝子サイレンシングおよび二次代謝産物(SM)の産生を触媒することに反映されることを証明した。MoSet1は、MオリザエのH3K4メチラーゼです。この遺伝子のノックアウトは、H3K4me3改変¹⁴の完全な欠失をもたらす。野生型株と比較して、変異体における遺伝子MoCEL7Cの発現は、CMC誘発状態および非誘導状態(グルコースまたはセロビオース)において阻害され、MoCEL7Cの発現は¹⁵増加した。Fusarium graminearumでは、KMT6はH3K27me3のメチル化修飾を触媒し、真菌の正常な発達を調節し、SM遺伝子クラスター^{16、17、18、19}を含む「暗号ゲノム」を調節するのに役立つ。2013年、コノリーは、H3K9およびH3K27メチル化が、標的遺伝子²⁰の阻害を調節する二次代謝産物およびエフェクター因子を通じて真菌の病原性プロセスを調節すると報告した。アスペルギルスにおいて、ヒストンH3K4me2およびH3K4me3の改変は、遺伝子活性化に関連しており、SM遺伝子クラスター²¹のクロマチンレベル調節を制御する上で重要な役割を果たす。M.オリザエにおいて、Tig1(酵母および哺乳動物におけるTig1に相同性)はHADC(ヒストンデアセチラーゼ⁾²²である。Tig1遺伝子のノックアウトは、ヌル突然変異体における病原性および胞胞体産生能力の完全な喪失をもたらす。感染性ヒphphae²²を産生できない過酸素環境に対してより敏感である。

M.oryzae.によって引き起こされる米の爆発は、世界で最も深刻な米の病気の一つです¹⁹.その代表的な感染過程のために、M.oryzaeは多くの重要な病原性真菌の感染過程に類似している。容易に分子遺伝学的操作を行うことができるので、真菌は真菌と植物の相互作用を研究するためのモデル生物²³となっている。M.オリザエの感染過程のすべてのステップを遮断すると、感染が失敗する可能性があります。感染過程における形態変化は、ゲノム機能全体と遺伝子転写によって厳密に調節される。中でも、ヒストンメチル化などのエピジェネティック修飾は、機能性遺伝子^24,25の転写調節に不可欠な役割を果たす。しかし、これまでのところ、M.オリザエにおける病原性遺伝子の転写におけるヒストンメチル化およびヒストンアセチル化などのエピジェネティック修飾の分子機構に関する研究はほとんど行われていない。したがって、これらの病原性遺伝子の上流および下流の調節ネットワークを研究しながら、稲芽菌のエピジェネティックな調節機構をさらに開発することは、米爆風予防および制御戦略の開発に役立つ。

特にエピジェネティクスにおけるChIP-seqなどの機能性ゲノミクスの開発により、このハイスループットデータ取得法により染色体の研究が加速されました。ChIP-seq実験技術を用いて 、M.オリザエ および他の糸状菌におけるヒストンメチル化(H3K4me3、H3K27me3、H3K9me3など)のゲノム全体の分布を同定することができる。したがって、この方法は、エピジェネティック修飾が植物病理における真菌病因の間に候補標的遺伝子を調節する方法の基礎となる分子メカニズムを解明するのに役立つ。

Protocol

1. Mオリザエからのプロトプラストの調製

1. オートミールトマト寒天(OTA)を準備します。
   1. オートミールの30〜50gの重量を量り、20分間水(ddH₂O)の800 mLでそれを沸騰させます。ガーゼの2層を通してフィルタリングし、濾液を取ります。
   2. 熟したトマトを選び、皮をむきます。ジュースを絞り、2層のガーゼを通して濾過し、濾過されたジュースの150 mLを集めます。
   3. すべてのトマトジュースと準備したオート麦を十分に混ぜ、ddH₂Oを1000 mLまで加えます。
   4. 500 mL の円錐フラスコに OTA 250 mL と 2.5 g の寒天粉末を加え、オートクレーブを 20 分間追加します。25°Cで保管。
2. オートクレーブしたOTAをガラス5cm x 5cmのペトリ皿に25mL注ぎます。これらのペトリ料理の合計10を準備します。OTAがペトリ料理に固まった後、25°Cで料理を逆さまに保管してください。
3. 殺菌された爪楊枝を使用して 、M.オリザエ (野生型株P131、ノックアウト株 Δmobre2、Δmospp1、Δmoswd2)から菌糸体の小片を掘り出し、準備されたOTA料理に置きます。光条件下で28°Cで4~6日間培養します。
   注:汚染を防ぐためにペトリ皿を逆さまにしてください。
4. 1000 μL の液体コンプリートミディアム(CM)(0.6%酵母エキス、0.3%酵素カゼイン加水分解物、0.3%酸性カゼイン加水分解物、1%グルコース)を1000 μL ピペットを使用してOTAディッシュに添加します。
   注:4-6日間OTA料理に催眠術が生えました。
5. 野生型のひずみとノックアウトの菌株を接種ループで削ります。
6. ミセリアの破片を収集し、液体コンプリートミディアム(CM)の250 mLに転送します。
7. 150 rpmで振る28°Cで36時間の三角形フラスコで真菌の破片を成長させる。
8. 漏斗を使用して、真菌のヒファをフィルタリングして収集します。
9. 真菌性ヒファを0.7 M NaCl溶液の500 mLで洗浄します。
10. 真菌菌糸体を収集し、それを量る。
    注:菌糸体は計量前に乾燥する必要はありません。
11. 菌糸菌の1gあたり溶解酵素透過液の〜1 mLを加えます。
    1. トリコデルマ・ハルジアナムの溶解酵素を0.7M NaClに溶解させて、20mg/mL溶解酵素透過液を調製します。
12. 150 rpmで振りながら、28°Cで3〜4時間に合わせる場合にヒファエを置きます。
13. 溶解したヒファエを0.7 M NaCl溶液の50 mLで洗浄します。
14. プロトプラストと遠心分離機を2,000 x g および4 °Cで15分間回収します。
15. 遠心後、上清を慎重に捨てます。プロトプラストを4°Cで0.7 M NaCIバッファーの20 mLに再懸濁します。

2. 生体内架橋と超音波処理

1. 55 μLのホルムアルデヒドを加え(最終濃度が1%になるまで滴下してホルムアルデヒドを加えて)、架橋用のプロトプラストを含むNaCIバッファーの2mLに添加します。
2. プロトプラストを25°Cで10分間インキュベートします。
3. 各チューブに20μLの10μLのグリシンを加え、未反応のホルムアルデヒドを急がせます。
4. 25°Cで5分間混合してインキュベートします。
5. 2,000 x g および 4 °C で 15 分間の遠心分離機。
6. 遠心後、上清を慎重に捨てます。ペレットを0.7 M NaCI溶液の1 mLに再懸濁します。
7. 2,000 x g および 4 °C で 10 分間の遠心分離機。
8. 遠心後、上清を慎重に捨てます。750 μL の RIPA バッファー(50 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、プロテアーゼ阻害剤) でペレットを再懸濁します。
9. 20xプロテアーゼ阻害剤の37.5 μLを加えます。
10. 前のステップから1.5 mL遠心分離管にプロトプラストを移します。
11. 超音波処理(25%W、出力3 s、5 s、4°C)を超音波処理を約10分間超音波処理器で直ちに行います。このステップの目的は、最良の条件を決定するために一定期間架橋ライセートを超音波処理することです。
    注:このステップで-80°Cで凍結することができます。
12. 超音波処理の最適条件が既に決定されている場合は、次の手順に進みます。
13. 必要に応じて、アガロースゲル分析用に5μLのプロトプラスト(未シェレドDNA)を除去します。
14. 8分間超音波ホモジナイザー(25%W、出力3s、ストップ5 s、4°C)で超音波処理によってクロマチンを剪断します。
15. サンプルが超音波破断された後、サンプルの一部を「入力」として取り出します。入力はChIP実験を行うものではなく、サンプルが超音波処理された後に放出されるすべてのDNAおよびタンパク質を含む。
16. 超音波処理の後、DNA断片の長さを分析するために1%アガロースゲル電気泳動を実行します。
    注:アガロースゲル電気泳動の結果は、DNA断片の長さが200-500 bpであることを示しています(図4)。
17. タンパク質の分解を防ぐために、超音波チューブを氷の上に置きます。
18. 遠心分離機 10,000 x g および 4 °C で 10 分間
19. 遠心分離後、遠心分離された上清を新しい1.5mL遠心管に移し、後で使用するために-80°Cで保管してください。この工程で得られたクロマチン溶液は、後続のIPに使用することができる。
20. IP実験を行う前に、1x RIPAバッファでクロマチンサンプルを1:10の比率に希釈します(例えば、10 μLのクロマチンサンプルを1×RIPAバッファの1μLに加えます)。

3. 架橋タンパク質/DNAのIP

1. ピペット50 μLの超常磁性タンパク質ビーズを2 mL遠心分離チューブに入る。チューブを磁気スタンドに置きます。磁気ビーズを沈殿させましょう。上清を取り除く。
2. 1x RIPAバッファー(氷上で予冷)の1 mLをチューブに加え、超常磁性タンパク質ビーズを洗浄します。洗浄後、チューブを磁気スタンドに置き、上清を取り除きます。各チューブに1x RIPAバッファ100μLを加えます。
3. 300 μLのチョルマチンサンプル(2 x 10⁷ 細胞を使用)、100 μLの超常磁性タンパク質ビーズ、4 μLのH3K4me3抗体をチューブに加えます。
4. 陰性コントロールとしてマウス IgG を使用したサンプルを使用します。
   注:このプロトコルで使用されるマウスIgGは0.01 Mリン酸バッファーと0.15 M NaClを含み、20°C以下の凍結状態を保ちます( 材料表を参照)。
5. よく混合した後、回転式シェーカーの上にサンプルを置き、4°C、30 x gで一晩インキュベート。
   注:免疫沈降(IP)のインキュベーション時間を短縮することができるかもしれません。インキュベーション時間は異なる因子(例えば、抗体、遺伝子標的、細胞タイプなど)に依存し、経験的に試験する必要があります。

4. IP製品の収集とリンス

1. 磁石スタンドに置いて超常磁性タンパク質ビーズをペレットにする。吸引し、上清を捨てる。
2. 1x RIPAバッファーの1 mLでビーズを再懸濁して、超常磁性タンパク質ビーズ抗体/クロマチン複合体を洗浄します。
3. ロータリーシェーカーでチューブを5分間リンスし、上清を30xgで取り除 きます。
4. 低塩免疫複合洗浄バッファー(0.1%SDS、1%トリトンX-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH 8.1、および150 mM NaCl)を1 mL添加します。
5. ロータリーシェーカーでチューブを5分間すすいで、上清を取り除きます。
6. 遠心管に高塩免疫複合洗浄バッファー(0.1%SDS、1%トリトンX-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH 8.1、および500 mM NaCl)を1 mL加えます。
7. ロータリーシェーカーにチューブを5分間置き、上清を取り除きます。
8. 遠心分離管に1 mLのLiCl(0.25 M LiCl、1%NP-40、1%デオキシコール酸、1 mM EDTA、および10 mM Tris-HCl pH 8.1)を用いてリンスします。
9. ロータリーシェーカーにチューブを5分間置き、上清を取り除きます。
10. 試験管を0.25 M LiCIバッファーの1 mLで再びすすいで、ピペットで上清を取り除き、上清を捨てます。
11. TE バッファーを 1 mL 追加します (10 mM トリス-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA)。
12. 30 x g で 5 分間回転式シェーカーにチューブを置 きます。
13. 1 mL TE バッファーでチューブを再度洗い、ピペットで上清を取り除きます。
14. ビーズを収集します。

5. タンパク質/DNA複合体の溶出

1. 溶出バッファー(20% SDSの10 μL、1 M NaHCO₃の20 μL、滅菌蒸留H_{2 O}の170 μL)を全てのIPおよび入力チューブに準備します。
2. 各遠心チューブに溶出バッファーの100 μLを追加します。
3. 65°Cで15分間溶出。
4. 10,000 x g および4 °Cで1分間の遠心分離機を、上清を新しい遠心管に集めます。
5. ステップ 5.2 ~ 5.4 を繰り返し、溶出を組み合わせます。190 μL の溶出バッファーを入力DNAの 10 μL に加えます。(総体積= 200 μL)。

6. タンパク質/DNA複合体の逆架橋

1. 5 M NaClの8 μLを全てのチューブに加え、65°Cで4~5時間または一晩インキュベートしてDNA-タンパク質の架橋を逆にします。
   注: このステップの後、サンプルを -20 °C に保存し、必要に応じて次の日にプロトコルを続行します。
2. RNase Aを1 μL加え、37°Cで30分間インキュベートします。
3. 各チューブに4μLのプロテイナーゼ_K(H2Oに溶解して20mg/mLで溶解し、-20°Cで保存)を加え、45°Cで1〜2時間インキュベートします。

7. DNAの精製と回収

1. 550 μL のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール混合物(25:24:1の比率)を遠心分離管に加えます。
2. 混合物を1分間徹底的に渦液にする。
3. 10,000 x g で15分間遠心分離機を使用し、上清を吸引します。
4. 抽出した上清を前工程から新しい1.5 mL遠心管に移します。
5. 1/10量の3 M酢酸ナトリウム溶液、2.5容量の絶対エタノール、3 μLのグリコーゲン(20 mg/mL)をチューブに加えます。
6. サンプルを一晩-20°Cの冷蔵庫に入れて沈殿させます。
7. 遠心分離機 15分間、10,000 x g および 4 °C.
8. 遠心後に上清を捨てます。ペレットを1mLの75%エタノール(新鮮な調製が必要)で3回10,000xgで洗浄します。
9. 洗浄した沈殿物を清潔なベンチに置き、アルコールを乾燥させます。
10. 50μLの無菌脱イオン化_H2Oを加え、沈殿を十分に溶解する。
11. シーケンシングアダプターをDNAフラグメントにリゲートし、ハイスループットシーケンシングプラットフォームを使用してDNAを配列します。

8. DNA修復とソレクサ図書館の建設

1. DNAエンドリペアキット(1-34 μL DNA、10倍のエンドリペアバッファーの5 μL、各dNTP2.5 mMの5 μL、10 mM ATPの5 μL、エンドリペア酵素1μL、および_H2Oを使用して、反応体積を49μLに調整する)を使用して、DNA末端を修復して鈍末DNAを生成します。
2. PCR精製キットまたはフェノール:クロロホルム抽出を使用してDNAを精製します。1x TE pH 7.4の30 μLでDNAをエルテまたは再中断します。
3. 3'末端に「A」を加えます(ステップ2から30μL、H2Oの2μL、10x Taqバッファの5 μL、1 mM dATPの10 μL、および3 μLのTaq DNAポリメラーゼを含む)。0.2 mL PCR遠心分離チューブに試薬を加え、よく混合し、72°CのPCRマシンで10分間反応させます。
4. 10 μLのDNA、9.9 μLのH₂O、T4 DNAリガーゼバッファーの2.5 μL、アダプタオリゴミックスの0.1 μL、T4 DNAリガーゼの2.5 μLを混合してリンカーライゲーションを行います。0.2 mL PCR遠心チューブに試薬を加え、よく混ぜます。16°Cで4時間インキュベートします。
5. メーカーのプロトコルに従って PCR 精製キットを使用して DNA を精製します。溶出バッファーの 20-25 μL とエルルート.
6. DNAライブラリーが確立される前に、精製されたDNAの濃度を特定し、その後のシーケンシング実験での使用を確認します。
7. 蛍光計を使用してDNA濃度を検出します。氷の上で試料を溶かし、1000 x g と4°Cで30sの遠心分離機を十分に混ぜます。 次に、適切な量のサンプルを取り、波長260nmの蛍光計で測定します。
8. シーケンシング用のイルミナシーケンシングプラットフォームに、適格な品質と濃度のDNAサンプルを配置します。
9. シーケンシングの前に、PCRプライマー、PE1.0およびPE2.0、および2x高忠実度マスターミックス(DNA 10.5 μL、2倍の高忠実度マスターミックスの12.5 μL、PCRプライマーPE1.0の1 μL、PCRプライマーPE2.0の1 μL)を使用してDNAを増幅します。0.2 mL PCR遠心チューブに試薬を加え、よく混ぜます。
10. PCR マシンで PCR 反応を実行します: 95 °C 2 分間の予分化;その後、10 sのための95°C変性の35サイクル、15 sのための60°Cで焼鈍、5 sのための72°Cで延長;72°Cで5分間の最終延長。最後に、4°Cで反応をインキュベートする。
11. DNAをクラスター生成に使用し、イルミナヒセク2000でシーケンシングを行います。
    注: このプロトコルでは、クラスタ生成にイルミナ フロー セルが使用されていました。合成によるシーケンシングは、メーカーの指示に従ってイルミナゲノムアナライザーで行われました。

Results

図1に、ChIP-seq メソッドの全体のフローチャートを示します。ChIP-seq実験は、野生型株P131におけるH3K4me3に対する抗体と、m.オリザエにおけるヒストンH3K4me3分布の全ゲノムワイドプロファイルを検証するために、mobre2、mospp1、およびmoswd2遺伝子を欠いていた3つのヌル変異株に対する抗体を用いて行った。野生型株のプロトプラスト、Δモブレ2、Δmospp1、およびΔmoswd2は、25%Wで超音波処理し、出力3s、ストップ5s、4°Cで調製した。 また、クロマチンをH3K4me3抗体及びダイナビーズタンパク質A/Gで免疫精製した。続いて、シーケンシングライブラリを構築するフェノールクロロホルム法を用いてDNA断片を抽出し、ハイスループットシーケンシングプラットフォーム上でシングルエンドで配列決定した。

野生型の代表的な結果は、Δre2、Δ

Discussion

近年、ChIP-seqは、特定のヒストンによって改変されたTFまたは濃縮部位の結合部位を決定するためのゲノム解析法として広く用いられている。従来のChIP-seqテクノロジーと比較すると、新しいChIP-seq技術は高感度で柔軟性に優れています。核酸の非特異的なハイブリダイゼーションによって生じるノイズ信号など、負の影響を受けることなく高解像度で得られます。これは一般的な遺伝子発現解析ですが、多くの計算方法が検証されており、ノイズと変動性の観点からChIP-seqデータの複雑さが、この問題を克服することは特に困難です。データ分析の面では、ChIP-seq実験で生成された大量のデータの管理と分析も、まだ十分に対処されていない課題です。

ChIP-seq 実験には、いくつかの重要なステップがあります。まず、プロトプラストの調製は非常に重要です。高品質のプロトプラストを収集できるように、崩壊時間を制御する必要があります。超音波も非常に重要であり、超音波時間が制御されるべきであり、長すぎるか短すぎる動作しません。第二に、添加される抗体の量は、タンパク質に結合するより多くのDNA断片の濃縮...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酸性カゼイン加水分解物	WAKO	65072-00-6	中型構成
の寒天粉末	科学者	9002-18-0	中型構成
のデオキシコール酸	MedChemExpress	83-44-3	タンパク質および溶解
DNA エンドリペアキット	NovoBiotec	ER81050	酵素的または機械的せん断
によって損傷した DNA または cDNA の修復Dynabeads	Invitrogen	no.100.02D	結合ターゲット
EBバッファー	JIMEI	JC2174	メンブレンおよび液体
EDTA	ThermoFisher	AM9912	プロテアーゼ阻害剤
酵素カゼイン加水分解物	Sigma	91079-40-2	中型グル
コース	Σ	50-99-7	中型グリ
コーゲン	サーモフィッシャー	AM9510	沈殿物作用
H3K4me3抗体	アブカム	ab8580	H3K4me3タンパク質に対する免疫応答
イルミナ イルミナ ゲノム解析	イル	ミナ Hiseq 2000	大型構成
イルミナ PCRプライマー	イルミナ	CleanPlex	ランダムユニバーサルプライマー
イソアミルアルコール	化学書	30899-19-5	精製DNA
LiCl	サーモフィッシャー	AM9480	特異的除去 RNA
溶解酵素	シグマ	L1412-10G	細胞溶解バッファー
マウスIgG	イェイセン	36111ES10	動物正常免疫グロブリン
NaCl溶液	サーモフィッシャー	7647-14-5	中型構成
NaHCO3	Seebio	SH30173.08*	タンパク質複合体溶離液の調製
NP-40	ThermoFisher	85124	細胞溶解を促進する細胞溶解物
PCR 精製キット	Qiagen	28004	精製手順は、DNAサンプルからプライマーを除去し
プロテアーゼ阻害剤	ThermoFisher	A32965	タンパク質活性を低下させるタンパク質阻害剤
プロテイナーゼK	ThermoFisher	AM2546	DNA抽出試薬
Qubit 4.0	ThermoFisher	Q33226	中型構成
RIPA バッファー	ThermoFisher	9806S	細胞溶解バッファー
RNase A	ThermoFisher	AM2271	精製
DNA SDS	ThermoFisher	AM9820	電荷差を隠す
酢酸ナトリウム溶液	ThermoFisher	R1181	酢酸バッファー
デオキシコール酸ナトリウム	サーモフィッシャー	89904	プロテアーゼ分解
の阻害 T4 DNAリガーゼ	サーモフィッシャーEL0011		ATPを補酵素として、DNAリガーゼ
T4 DNAリガーゼ緩衝液	サーモフィッシャーB69		DNAリガーゼ緩衝液
トリス-HCl	サーモフィッシャー1185-53-1		緩衝剤作用
トリトンX-100	サーモフィッシャー	HFH10	は、膜タンパク質を安定な
酵母抽出物	OXOID	LP0021	型構成