ここでは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍固有および末梢由来腫瘍浸潤リンパ球の特性評価のための腫瘍移植プロトコールを提示する。フローサイトメトリーによるレシピエント由来免疫細胞の流入の特異的追跡は、抗腫瘍免疫応答中のこれらの細胞の表現型および機能的変化のダイナミクスを明らかにする。
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サマリー
要約
T細胞媒介性免疫は腫瘍に対する免疫応答において重要な役割を果たしており、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は癌細胞の根絶において主導的な役割を果たしている。しかしながら、腫瘍微小環境(TME)内の腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞の起源および補充は不明瞭なままである。このプロトコールは、代理ネオ抗原、オボアルブミン(OVA)、およびTCRトランスジェニックOT-Iマウスを安定に発現するB16F10-OVAメラノーマ細胞株を採用し、CD8+ T細胞の90%以上がクラスI主要組織適合性複合体(MHC)分子H2-Kbに結合したOVA由来ペプチドOVA257-264(SIINFEKL)を特異的に認識する。これらの特徴は、腫瘍形成中の抗原特異的T細胞応答の研究を可能にする。
このモデルを腫瘍移植手術と組み合わせることで、ドナー由来の腫瘍組織を腫瘍マッチした同系レシピエントマウスに移植し、移植ドナー組織へのレシピエント由来免疫細胞の流入を正確に追跡し、腫瘍固有の抗原特異的CD8+および末梢起源抗原特異的CD8+ の免疫応答の解析を可能にした。 T セル。これら2つの集団間で動的な遷移が起こることが判明した。全体として、この実験計画は、TME中のCD8+ T細胞の免疫応答を正確に調査するための別のアプローチを提供し、腫瘍免疫学に新たな光を当てるであろう。
概要
CD8+ T細胞媒介性免疫応答は、腫瘍増殖の制御において極めて重要な役割を果たしている。腫瘍形成の間、ナイーブCD8+ T細胞はMHCクラスI制限様式で抗原認識時に活性化され、続いてエフェクター細胞に分化し、腫瘍塊に浸潤する1,2。しかし、腫瘍微小環境(TME)内では、長期にわたる抗原曝露および免疫抑制因子が、浸潤した腫瘍特異的CD8+ T細胞を「枯渇」3として知られる低応答状態に追いやる。疲弊したT細胞(Tex)は、急性ウイルス感染で生成されたエフェクターまたはメモリーT細胞とは、転写的およびエピジェネティックに区別される。これらのTex細胞は、主に、一連の阻害性受容体の持続性および上昇した発現、ならびにエフェクター機能の階層的喪失によって特徴付けられる。さらに、疲弊したCD8+ T細胞の増殖能の障害は、腫瘍特異的T細胞の数を減少させ、その結果、TME内の残留CD8+ T細胞は、腫瘍進行に対して十分な保護免疫をかろうじて提供することができる3。したがって、腫瘍内抗原特異的CD8+ T細胞の維持または強化は、腫瘍抑制に不可欠である。
さ....
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プロトコル
すべてのマウス実験は、第三軍事医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに準拠して実施された。体重18~22gの6~8週齢のC57BL/6マウスおよび素朴なOT-Iトランスジェニックマウスを使用する。無作為化や「盲検化」を行わずに男性と女性の両方を使用してください。
培地および試薬の調製
- ダルベッコの改変イーグル培地に10%ウシ胎児血清(FBS)、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを添加して、前述の29 と同様に細胞培養培地D10を調製する。
- RPMI-1640に10%FBS、100U/mLペニシリン、および100mg/mLストレプトマイシンを添加して細胞培養培地R10を調製する。
注:培養培地D10およびR10は、2〜4°Cで保存した場合、少なくとも2週間は無菌で安定なままにすることができます。 - 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に2%FBSおよび0.01%のアジ化ナトリウムを補充することによって、蛍光活性化細胞選別(FACS)緩衝液を調製する。
注:アジ化ナトリウムを添加すると、FACSバッファーは2〜4°Cで数ヶ月間保存することができます。 - 二重蒸留水に155 mM NH 4 Cl、10 mMKHCO3、および0.1 mM エチレンジアミン四酢酸....
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結果
このプロトコルの概略を図1に示します。腫瘍接種から8日後、CD45.1+およびCD45.1+CD45.2+ OT-I細胞をB16F10-OVA担がんC57BL/6マウスに注射した。腫瘍を、移植後8日目にCD45.1+ OT-I細胞移植マウス(ドナー)から外科的に切除し、移植腫瘍と同じ側の背側腹部の腫瘍マッチCD45.1+CD45.2+ OT-I細胞移植マウス(レシピエント)に移植した。フローサイトメトリー(図2に示すゲーティング戦略)分析により、CD45.1+ドナー由来およびCD45.1+CD45.2+レシピエント由来TILを含む、CD44+CD8+腫瘍抗原特異的T細胞の2つの集団をTMEにおいて容易に同定することができる。続いて、抗原特異的CD8+ T細胞の.......
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ディスカッション
T細胞媒介性免疫は腫瘍に対する免疫応答において重要な役割を果たしており、CTLはがん細胞の根絶において主導的な役割を果たしている。しかしながら、TME内の腫瘍抗原特異的CTLの起源は解明されていない30。この腫瘍移植プロトコールの使用は、幹細胞様TCF1+前駆CD8+ T細胞が存在するにもかかわらず、腫瘍内抗原特異的CD8+ T細胞が長期間持続しない可能性があるという重要な手がかりを提供してきた。注目すべきは、末梢由来腫瘍特異的CD8+ T細胞が腫瘍塊に連続的に流入していることです。
我々の知る限り、これは、TME内の抗原特異的CD8+ T細胞の維持が、腫瘍常在性TILの自己複製ではなく、末梢由来腫瘍特異的CD8+ T細胞の補充に主に依存することを確認する比較的便利で説得力のある方法である。ここで提示されたプロトコルは、ドナー由来およびレシピエント由来のTILの割合にのみ焦点を当てているが、これら2つの集.......
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開示事項
著者らは、開示する利益相反はありません。
謝辞
この研究は、国家自然科学基金(LYに31825011番)と中国国家自然科学財団(31900643番からQHへ、31900656番からZWへ)からの助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22 以上 μ;m フィルター | ミリポア | SLGPR33RB | |
| 1 mL ツベルクリン シリンジ | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL 遠心分離管 | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U インスリン注射器 | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL コニカルチューブ | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-トリブロモエタノール (アバーチン) | Σ | T48402-25G | |
| 2-メチル-2-ブタノール | シグマ | 240486-100ML | |
| 70 μmナイロン細胞ス | トレーナーBDファルコン | 352350APC | |
| 抗マウスCD45.1 | BioLegend | 110714 | クローン:A20 |
| B16F10-OVA細胞株 | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V(ウシ血清アルブミン) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421マウス抗マウスCD45.2 | BDホライゾン | 562895 | クローン:104 |
| 細胞培養皿 | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | シグマ | EDS-500g | |
| FACS チューブ | BD ファルコン | 352052 | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 10270-106 | |
| フローサイトメーター | BD | FACSCanto II | |
| 血球計算盤 | PorLab Scientific | HM330 | |
| イソフルラン | RWD ライフサイエンス | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD 固定可能近赤外死細胞染色キット、633または635 nm励起用 | Life Technologies | L10199 | |
| ニードルキャリア | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| パラホルムアルデヒド | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE抗マウスTCR V&α;2 | BioLegend | 127808 | クローン:B20.1 |
| Pen 連鎖球菌グルタミン (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 抗マウス CD8a | BioLegend | 100734 | クローン:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Σ | R8758-500ML | |
| アジ化ナトリウム | Σ | S2002 | |
| 外科用鉗子 | RWD ライフサイエンス | F12005-10 | |
| 外科用ハサミ | RWD Life Science | S12003-09 | |
| 縫合糸 | RWD Life Science | F34004-30 | |
| トリプシン-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
参考文献
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
