方法論記事

穀物およびマメ科植物の遊離可溶性フェノール酸組成および抗酸化能を決定するための一般化された方法

DOI：

10.3791/62467

⸱

2022年6月10日

 ,  , 
1Department of Food and Human Nutritional Sciences, University of Manitoba, 2Richardson Centre for Functional Foods and Nutraceuticals, University of Manitoba

この記事について

サマリー

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フェノール酸は、全粒穀物に存在する重要な植物化学物質です。それらは抗酸化保護機能のような生理活性特性を有する。この研究は、HPLC同定、総フェノール含有量推定、および穀物および豆類中のフェノール酸の抗酸化能の測定のための一般化された方法に関する報告を目的としていた。

要約

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フェノール酸は、フェノール基とカルボキシル基の両方を持つ有機化合物の一種です。それらは穀物に見られ、穀物のふすままたは豆類の種皮に集中します。彼らは、近年、それらの潜在的な抗酸化保護健康機能について、多くの研究の関心を集めている抗酸化特性を持っています。この研究は、全粒穀物から遊離可溶性フェノール酸を抽出し、それらの抗酸化能力を分析するための一般化された方法を提示する。2つの穀物(小麦および黄色トウモロコシ)および3つの豆類(ササゲ豆、インゲン豆、および大豆)を含む5つの全粒穀物サンプルを使用した。穀物を小麦粉に粉砕し、それらの遊離可溶性フェノール酸をメタノール水溶液を用いて抽出した。次いで、化合物を高圧液体クロマトグラフ(HPLC)を用いて同定した。Folin-Ciocalteu法を使用してそれらの総フェノール含有量を決定し、それらの抗酸化能力はDPPHラジカル消去能、トロロックス等価抗酸化能(TEAC)および酸素ラジカル吸光能(ORAC)アッセイを使用して決定した。同定されたフェノール酸には、バニリック酸、カフェ酸、 p-クマル酸およびフェルラ酸が含まれていた。バニリン酸はササゲでのみ同定され、カフェ酸はインゲン豆でのみ同定された。 p-クマル酸はイエローコーン、ササゲ、大豆で同定され、フェルラ酸はすべてのサンプルで同定された。フェルラ酸は、同定された優勢なフェノール酸であった。サンプル中のフェノール酸の総濃度は、以下の順序で減少した:大豆>ササゲ豆>黄色トウモロコシ=インゲン豆>小麦。総抗酸化能力(DPPH、TEACおよびORACアッセイの値の合計)は、以下のように減少した:大豆>インゲン豆>黄色トウモロコシ=ササゲ豆>小麦。この研究は、HPLC分析ならびにDPPH、TEAC、およびORACアッセイが、全粒穀物のフェノール酸組成および抗酸化特性に関する有用な情報を提供すると結論付けた。

概要

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フェノール酸は、草食動物や真菌の感染に対する植物の防御に重要な役割を果たし、植物組織における構造的支持と完全性の維持に重要な役割を果たしているため、植物で研究されている最も重要な植物化学物質の1つです1,2。彼らは穀物のふすまと豆類の種皮に豊富にあります3.構造的には、それらは2つのグループに分けられる:ヒドロキシ安息香酸(図1)およびヒドロキシ桂皮酸(図2)。穀物および豆類における一般的なヒドロキシ安息香酸には、没食子酸、p-ヒドロキシ安息香酸、2,4-ジヒドロキシ安息香酸、プロトカテクイ酸、バニリック酸、およびシリンギン酸が含まれ、一般的なヒドロキシ桂皮酸にはカフェ酸、p-クマル酸、鉄原酸、シナピン酸3が含まれる。フェノール酸はまた、脂肪中の酸化的酸敗を引き起こすフリーラジカルを捕捉し、生理学的系においてラジカル誘発酸化ストレスを開始および伝播することができるので、抗酸化特性を有する4,5。抗酸化物質としてのこの重要な生理学的役割のために、それらは....

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プロトコル

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1. サンプルの種類

  1. この研究には、2つの穀物(例えば、デュラム小麦およびイエローコーン)および3つの豆類(例えば、ブラックアイサゲ豆、大豆、および赤インゲン豆)を含む5つの全粒穀物サンプルを使用する。
  2. 各穀物の50gを3連で粉砕し、コーヒーグラインダーを使用して小麦粉にし、それらを500μmのふるいに通す。
  3. -20°Cで保管してください。

2. サンプル調製

  1. 乾物含有量の測定と乾燥重量基準の表現
    注:AOAC(2000)12の方法に従って、各粉末サンプルの乾燥物含有量を決定する。
    1. 強制対流式オーブンの電源を入れ、温度を 130 °C に設定します。
    2. 乾燥剤(シリカゲル)をオーブン中で30分~1時間乾燥させ、乾燥したシリカゲルをデシケーターに移した。
    3. 各サンプルの2gを正確に計量し、清潔で予備乾燥し、計量したアルミニウム缶に入れます。
    4. 秤量した試料を強制対流式オーブン中で130°Cで1時間乾燥させる。
    5. 乾燥したサンプルをデシケーターに移し、周囲温度まで冷却します。
    6. 乾燥し、冷却されたサンプルを計量し、その重....

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結果

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表2 に、穀物及びマメ科植物粒において同定されたフェノール酸類を示す。入手可能な本物の標準に基づいて、サンプル中に4つのフェノール酸が同定され、それらはバニリック酸、カフェ酸、 p-クマル酸、およびフェルラ酸である。バニリン酸はヒドロキシ安息香酸であり、他の3つはヒドロキシ桂皮酸である。バニリン酸はブラックアイササゲ豆でのみ同定され、カフェ酸はインゲン豆でのみ同定された。 p-クマル酸は、イエローコーン、ササゲ豆、および大豆で同定された。その濃度は乾燥重量ベースで7.57〜12.48μg/gの小麦粉の範囲であり、黄色いトウモロコシが最も低い値を持ち、大豆が最も高い値を持っていた。フェルラ酸は、すべてのサンプルで同定された唯一のフェノール酸であった。その濃度は、乾燥重量ベースで5.69〜41.76μg/gの小麦粉の範囲であった。サンプルの中では、フェルラ酸濃度は大豆で最も高く、小麦、イエローコーン、インゲン豆は同等の値であった(表2)。各サンプルについてすべてのフェノール酸濃度を合計すると、それらの値は次の順序で減少した:大豆>サ.......

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ディスカッション

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全粒穀物は、世界中で幅広い食品用途を見つける代表的な穀物および豆類として選択されました。各穀物の品種間にはばらつきが存在するかもしれないが、この研究の焦点は、全粒穀物の遊離フェノール酸抽出および分析のための一般化された方法を実証することであった。抽出方法は、そのような実験が行われたときに環境に放出される化学物質の量を減らすために、サンプルおよび溶媒の量を大幅に減らすことによって修正された。この修飾はまた、全粒穀物のミリグラム量からのフェノール抽出を可能にする。

HPLC分析は、試料中の構成フェノール酸のクロマトグラムを生成する。フェノール酸を表す各クロマトグラフィーピークは、予め定義された波長におけるその保持時間を、本物のフェノール酸標準の保持時間と比較することによって同定することができる。紫外線(UV)検出器は、通常、UV波長範囲内のフェノール酸を識別するために使用されます。ヒドロキシ安息香酸類は通常254〜280nmの間で同定され、ヒドロキシ桂皮酸類は通常300〜330nm15の間で同定される。フォトダイオードアレイ検出器は、紫外.......

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開示事項

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著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

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著者らは、アリソン・セル氏とハンナ・オドゥロ・オーベン氏の技術支援、ジャニス・ファハルド氏とミゲル・デル・ロザリオ氏によるビデオ編集のサポートに感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL Falcon Conical 遠心分離管Fisher Scientific05-527-90
2 mL 琥珀色ガラス ID Surestop バイアルThermo ScientificC5000-2W
2 mL 琥珀色微量遠心チューブVWR20170-084
2,2′-アゾビス(2-アミジノプロパン) 二塩酸塩 (AAPH)Sigma-Aldrich440914-100G
2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)(C18H18N4O6S4)≥98%、シグマ アルドリッチA1888-2G
2,2-ジフェニル-1ピクリルヒドラジル (DPPH) (C<サブ>18H<サブ>12N<サブ>5O<サブ>6)シグマ アルドリッチD913-2
6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸 (トロロックス) (C<サブ>14H<サブ>18O<サブ>4)、 ≥98%Fluka Chemika56510
9 mm オートサンプラー バイアル スクリュー スレッド キャップThermo Scientific60180-670
96 ウェル平底プレートフィッシャー サイエンティフィック12565501
Agilent BioTek ELx800 マイクロプレート リーダーフィッシャー サイエンティフィBT-ELX800NB
アジレント バイオテック プレシジョン 2000 96/384 自動マイクロプレート ピペッティング システムフィッシャーScientificN/A
Agilent BioTek FLx800 マイクロプレート蛍光リーダーFisher ScientificN/A
分析天びん SI-114Denver InstrumentSI-114.1
オートサンプラー、Waters 717 PlusWatersWAT078900
BD 3 mL syringe Luer-Lok TipBD309657
Bransonic 超音波洗浄機、ブランソン5510ミリポアシグマZ245143
コーニングLSEボルテックスミキサーコーニング6775
デュラポアフィルター(0.45 µm PVDFメンブレン)Merck Millipore LtdHVLP04700 
デュラポアメンブレンフィルター(0.45 µm HV)Merck Millipore LtdHVHP04700
Eppendorf Research プラス、0.5-10 & マイクロ;Lエッペンドルフ3123000020
Eppendorf Research さらに、0.5-5 mLEppendorf3123000071
Eppendorf Research プラス、100-1000&マイクロ;Lエッペンドルフ3123000063
Eppendorf Research さらに、10-100 & マイクロ;Lエッペンドルフ3123000047
酢酸エチル、HPLC グレードフィッシャーケミカルE195-4
フェルラ酸標準シグマ アルドリッチ128708-5G
フルオレセインフィッシャー サイエンティフィAC119245000
フォリン &Ciocalteuフェノール試薬Sigma AldrichF9252
ギ酸、99%Acros Organics、Janssen Pharmaceuticalaan 3a27048-0010
没食子酸標準SigmaG7384
高速液体クロマトグラフ(HPLC)、Waters 2695Waters960402
メタノール、HPLCグレードFisher ChemicalA452-4
マイクロピペットチップ、0.5-10 & マイクロ;Lフィッシャーブランド21-197-2F
微量遠心分離機 Sorvall Legend Micro 21 遠心分離機Thermo Scientific75002435
マルチチャンネルマイクロピペット、Proline Plus、30-300 µLSartorius728240
フォトダイオードアレイ検出器、Waters 2996Waters720000350EN
ピペットチップ、1000 µLVWR83007-382
ピペットチップ、1-5 mLVWR82018-840
過硫酸カリウム(K < sub > 2< / sub>S2< / sub>O8< / sub>)、≥99.0%シグマアルドリッチ216224-100G
リン酸二塩基性カリウム無水(K < sub>2< / sub>HPO4< / sub>)フィッシャーサイエンティフィックP288-500
カリウム一塩基性(KH < sub > 2< / sub >PO 4< / sub>)フィッシャーサイエンティフィックP285-500
レックス250mLショートネックボイリングフラスコ、 丸底Corning4321-250
逆相 C18 分析カラム (100 x 3 mm) Accucore aQThermo Scientific17326-103030
ロトエバポレーター、IKA RV 10IKA 
炭酸ナトリウム(NaCO3)無水フィッシャーケミカルS263-1
塩化ナトリウム(NaCl)Mallinckrodt AR®7581
リン酸ナトリウム二塩基性無水(Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-500
ナトリウム一塩基性無水(NaH2PO4)Fisherバイオ試薬BP329-500
標準化ピペットチップ0-200µLフィッシャーブランド02-681-134
シリンジ駆動フィルターユニット (0.22 µm) Millex®-GVSLGVR04NL
ターゲットマイクロサートバイアルインサート (400 & micro;L)Thermo ScientificC4011-631
超純水(ポンプ付きダイレクトQ-3 UVシステム)ミリポアZRQSVP030
ック ック リン酸パイ0010005185リン酸

参考文献

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  1. Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478(2014).
  2. Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I.

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