方法論記事

生体膜力プローブ分光法による分子ばね定数解析

DOI：

10.3791/62490

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2021年11月20日

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1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

バイオメンブレン力プローブ(BFP)は、イン ・ス・ ダイナミック・フォース分光法(DFS)の技術です。BFPは、生細胞上の分子相互作用のばね定数を測定するために使用することができる。このプロトコルは、BFPによって検出された分子結合に対するばね定数分析を提示する。

要約

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生体膜力プローブ(BFP)は、最近、単一分子結合性キネティクスを測定し、リガンド-受容体相互作用の機械的特性を評価し、タンパク質の動的構造変化を視覚化し、よりエキサイティングに受容体媒介細胞メカノセンシング機構を解明することができる、ネイティブ細胞表面または その場 動的力分光(DFS)ナノツールとして出現しました。最近では、BFPは分子結合のばね定数を測定するために使用されています。このプロトコルは、分子ばね定数DFS分析を実行するためのステップバイステップの手順を説明する。具体的には、2つのBFP動作モード、すなわちビードセルとビードビードモードについて説明します。このプロトコルは、DFS生データから分子結合と細胞のばね定数を導き出することに焦点を当てています。

概要

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ライブセルDFS技術として、BFPはヒト赤血球(RBC;)図1)0.1-3pN/nm1、2、3で互換性のあるばね定数範囲を持つ超高感度で調整可能な力トランスデューサーに。リガンドと受容体の相互作用をプローブするために、BFPは、約1pN(10-12 N)、〜3nm(10-9 m)、および〜0.5 ms(10-3 s)の力、空間、および時間分解能4、5でDFS測定を可能にする。その実験的構成は、2つの対向するマイクロピペット、すなわちプローブとターゲットで構成されています。プローブマイクロピペットはRBCを吸引し、ビーズはビオチンとストレプトアビジンの相互作用を介して頂点に接着されます。ビーズは、目的のリガンドでコーティングされている(図1A)。標的マイクロピペットは、対象の受容体を担う細胞またはビーズのいずれかを吸引し、ビーズ細胞(図1B)およびビーズビーズ(図1C)モードにそれぞれ対応し、それぞれ5。

BFP の構築、アセンブリ、DFS 実験プロトコルについては、前に1,6を詳しく説明しました。簡単に言えば、BFPタッチサイクルは、アプローチ、インピンジ、接触、後退および解化の5つの段階で構成されています(図1D)。水平 RBC 頂点位置は ΔxRBCと示されます。冒頭で、無ストレス(ゼロフォース)RBC変形ΔxRBCは0(表1)である。ターゲットは、ピエゾトランスレータによって駆動され、プローブビードを押さえ、引き込まれるようにします(図1D)。RBCプローブは、まず負のRBC変形ΔxRBC<0でターゲットによって圧縮されます。ボンドイベントでは、リトラクトステージは、正のRBC変形ΔxRBC>0(図2CおよびD)を有する圧縮相から引張り相に移行する。フックの法則によれば、BFP軸受力は、F = kRBC×Δ xRBCとして測定することができ、k RBC(表1)はBFPのRBCばね定数である。ボンド破裂と1回のタッチサイクルの完了時に、プローブビーズはΔxRBC = 0(図1D)でゼロフォース位置に戻ります。

kRBCを決定するために、プローブマイクロピペット内オリフィス(R p)、RBC(R0)、およびRBCとプローブビーズの間の円形接触領域(Rc)の半径を測定し、記録する(図1A)。次いで、KRBCは、BFP(図S1A)8,9を操作する仮想計測器(VI)として機能するLabVIEWプログラムを用いて、Evanのモデル(Eq. 1)7,8に従って計算される。

流体力学におけるkRBCの静的平衡方程式 変数と対数項を示す (Eq. 1)

BFPが確立され、DFS生データが得られたことで、リガンドとレセプターの対または細胞のばね定数を分析する方法を紹介します。グリコシル化タンパク質Thy-1とK562細胞を持つインテグリンの相互作用に関するDFS生データα 5 β 1 (thy-1-α5β1;図3A及び3B)10及びフィブリノーゲン及びビーズ αのそのとIIb β 3(FGN-α IIb β 3; 図3C)11,12は、ビーズセルおよびビードビーズ分析モードをそれぞれ実証するために使用されています。

BFP実験準備
BFP実験の準備と計測の詳細については、前に公開したプロトコル3を参照してください。簡単に言えば、ヒトRBCは、炭素/重炭酸塩緩衝液中のビオチン-PEG3500-NHSを用いてビオチン化されている。目的のタンパク質は、リン酸緩衝液中のMAL-PEG3500-NHSを用いてホウケイ酸ガラスビーズに共有結合されている。ビオチン化RBCに付着するために、プローブビーズはまた、MAL-SAを使用してストレプトアビジン(SA)でコーティングされています。 資料表 と 表2を参照してください。

BFP(図1、左)を組み立てるには、プローブビーズを送達し、RBCの頂点1、3に接着するために「ヘルパー」と呼ぶ3番目のマイクロピペットを使用します。SAコーティングプローブビーズとビオチン化RBCの共有結合相互作用は、対象のリガンド-受容体結合よりもはるかに強い。したがって、解離ステージは、RBCからのプローブビーズの剥離ではなく、リガンド-受容体結合破裂と解釈することができる。

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プロトコル

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1. 分析可能な DFS イベントの取得

  1. BFPコントロールとパラメータ設定(図S1A)のソフトウェア(例えば、LabVIEW VI)で実験を開始します。
  2. BFP モニタ用ソフトウェアで、反復プローブビーズ ターゲット ビーズ/セル タッチを観察します (図 S1B)。
  3. 衝突力と接触時間を調整することにより、最初の50タッチ以内に20%の接着周波数≤を試験し、達成し、それによってDFS接着イベントの≥89%が単一結合12、13、14によって媒介されることを保証する。
    注: 各ビーズセル/ビーズペアに対して、200反復的なタッチサイクルを実行します。パブリッシュ可能なデータ品質を得るために、我々は通常、n ≥3ビードビーズまたはビードセルペアを実行します。
    1. BFP コントロールとパラメータ設定のソフトウェアによってプロンプトが表示され、各ペアの最後までに、Force vs. Time という形式で、データをユーザーが指示したフォルダーに保存します。
  4. BFP 取得プラットフォームを使用して、図 2Aに示すように、ボンド イベントのフォース対時間の生データを収集します (図 S1C)。
    1. BFP データ解析ソフトウェアを開きます。黄色のフォルダアイコンをクリックし、それらをダブルクリックして、対応する生データファイルを選択します。
  5. プログラムを実行し、上ボタンと下向きボタンをクリックしてイベントを切り替えます。外れ値除外条件 (図 S2) を使用して、無効なイベントを表示します。[強制対時間]形式として書き出すデータ タイプを選択し、[ プロット データをエクスポート ]ボタンをクリックします。

2. フォース対時間カーブをフォース対変位曲線に変換

  1. リトラクトステージに対応するデータセグメントを、ばね定数分析に関連するスプレッドシート(図2A、四角いマーキー)にエクスポートします。
  2. スプレッドシート ソフトウェアを使用して、フォースとタイム カーブをプロットします。フォースと変位曲線を取得するには、時間値(図2A、x-軸)を、ピエゾ移動速度(プリセットで4,000 nm/s)で時間値を乗算して、合計変位値(Δxtot)に変換します。
  3. 取得した各変位値から最小の変位値を引いて、最初のデータ点をゼロにします。この水平変換は、リトラクト ステージの上昇勾配や後続のばね定数計算には影響しません。
  4. 特に、BFPは、RBC、Δx RBC(表1)の総変形をΔx、分子結合、Δxモル(表1)、標的細胞Δx細胞(表1)、Eq2として表したシリアルスプリングシステムと考えられている。
    静的平衡方程式Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell,数式 (Eq. 2)
  5. 図 2Bに示すように、力 (F) と変位 (Δxtot) カーブをプロットします。

3. ビーズ-セルモードのスプリング・クネスタント解析

  1. フォース対変位曲線では、2 つの異なるスロップを識別でき、それぞれが圧縮フェーズと引張フェーズを表すことができます。回帰直線を各データグループ(図2B)に適合し、より大きな線形適合勾配が圧縮相(図2B、赤色)における総ばね定数を表す(k1(表1)として示される)。そしてより小さい線形フィット勾配は、テンズリール相(図2B、青)でのスプリングの合計定数を表し、k2(表1)と示す。
  2. ステップ2.2の説明ごとに直列に接続されたばねについては、全ばね定数の逆数を表し、ktot(表1)、RBCのバネ定数逆数の和として、kRBC、kRBC(表1)、分子結合、kモル(表1)、および標的細胞、kセル(表1)を表す。ビーズ細胞モードの圧縮相の間、分子結合は伸張されず、従ってkモルは考慮されない。このシナリオでの kトートの逆数 (1/k1) は次のように表現されます。
    生物学における細胞動態を表す方程式。運動定数の図:k1、kRBC、kcell。 (Eq. 3)。
    サンプルデータでは、kRBCが事前に決定されています(デフォルトでは0.25 pN/nm)。kセルは、取得したk1およびk RBCを有するEq. 3から導出することができる(図3B)。
  3. 引張段階の間、リガンドと受容体の対の間に接着が形成される。このシナリオでkトートの逆数を表現する (1/k2)
    速度論研究で使用される、1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcellを示す直列抵抗方程式。 (Eq. 4)
    ここで k2 ( 表1) は、引張フェーズ中のばね定数の合計を表します。
  4. 1/ k1を1/ k2から1/k1を引いてkモルを導出する(Eq. 3対Eq. 4を比較する)。

4. ビーズビーズモードのスプリング定数分析

  1. 回帰直線を圧縮相データに合わせて k 1 (図 2B、赤に似ています) を得る。なお、ビーズ・ビードモードでは、標的細胞は目的の受容体でコーティングされたガラスビーズに置き換えられる(図1C)。ビードの変形は無視できるので、1/k細胞項は、それに応じてEq. 3およびEq. 4から除去することができる。圧縮相(1/k1)の逆数kトートは、次のように表現できます。
    関係を示す方程式:1 / k1 = 1 / kRBC;生化学分析における運動速度定数の鍵 (Eq. 5)
  2. 引っ張り相データに回帰直線を合わせてk2を得る(図2B、青に似ている)。引張フェーズの逆数kトート(1/k2) は、次のように表現できます。
    反応速度方程式、逆速度定数図。速度論解析のためのk2,kRBC,kmol項 (Eq. 6)
  3. 1/ k1を1/k2から減算から kモルを導出する (Eq. 5 対 Eq. 6)。

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結果

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この研究では、BFPばね定数分析のプロトコルを実証しました。ビーズ細胞解析モードでは、プローブビーズ上でコーティングされたグリコシル化タンパク質Thy-1と、標的K562α細胞上で発現するインテグリンα 5 β 1との間の分子結合のkモルを解析β 1 β。図 3A)10. kセルもビーズセルモードから派生します (K562 セル;図 3B)。ビード・ビードモードでは、フィブリノーゲンとインテグリンの間に形成される分子結合α IIbβ 3(FGN-インテグリンα IIbβ 3;図3C)11,12...

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ディスカッション

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要約すると、BFPビーズビーズおよびビードセル解析モードでDFS生データを前処理し、分子ばね定数を導出するための詳細なデータ分析プロトコルを提供しました。分子および細胞のばね定数を決定するために必要な生体力学的モデルと方程式が提示される。異なるインテグリンが研究されているにもかかわらず、ビーズ・ビーズ・モードとビーズ・セル・モードで測定された kモル は有意な範囲差を有する(図3A 対 図3C)。注目すべきは、ビードビーズモードでは、受容体はガラスビーズに共有結合している。これに対して、ビーズ細胞モードでは、表面受容体は、基になる原形質膜および細胞骨格によって適応され、測定された kモルに影響を与える可能性が最も高い。

データ品質管理は、再現性を確保するために重要です。このため、フォースプロットと時間プロットに対するDFSデータの事前スクリーニングと外れ値除外基準を実装しました。これを...

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開示事項

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著者らは、本研究に関して報告する競合する利益はないと宣言している。

謝辞

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ギヨーム・トロアデックは、有益な議論、ハードウェアコンサルテーションのためのZihao Wang、シドニー・マニュファクチャリング・ハブ、グレッグ・スアンイン、サイモン・リンガーのラボスタートアップのサポートに感謝します。この研究は、オーストラリア研究評議会ディスカバリープロジェクト(DP200101970 - L.A.J.)、NSW心血管能力構築プログラム(早期キャリア研究者グラント - L.A.J.)、シドニー研究アクセラレータ賞(SOAR - L.A.J.)、ラマシオッティ財団によって支援されました 健康投資助成金(2020HIG76 - L.A.J.)、国民保健医療研究評議会アイデアグラント(APP2003904 - L.A.J.)、シドニー大学工学部スタートアップファンドと主要機器スキーム(L.A.J.)。ライニングアーノルドジュは、オーストラリア研究評議会DECRAフェロー(DE190100609)です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTMS)Uct、Specialties、llc4420-74-0ガラスビーズ機能化
Anhy。リン酸ナトリウム 二塩基性(Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907リン酸緩衝液調製
BFPデータ取得 VILabVIEWBFP制御およびパラメータ設定 BFP
データ解析 VILabVIEWBFP生データ解析
Biotin-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBCビオチン化
ホウケイ酸ガラスビーズDistrilab Particle Technology, Netherlands9002ガラスビーズの機能化
牛血清アルブミンSigma-AldrichA0336リガンド機能化
カメラ VILabVIEWBFPモニタリング
D-グルコースSigma-AldrichG7021Tyrode'緩衝液調製
HepesSigma-AldrichH3375Tyrode'緩衝液
調製 MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1ガラスビーズ官能基化
塩化カリウム (KCl)Sigma-AldrichP9541Tyrode's緩衝液
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)Sigma-AldrichS5761炭酸塩/重炭酸塩緩衝液;タイロード緩衝液
炭酸ナトリウム(Na2CO3)Sigma-AldrichS2127炭酸塩/重炭酸塩緩衝液
塩化ナトリウム(NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode's緩衝液
リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(NaH2PO4•H2O)Sigma-AldrichS9638リン酸緩衝液の調製
ストレプトアビジン-マレイミドSigma-AldrichS9415ガラスビーズの機能化

参考文献

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  3. Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
  4. An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
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  12. Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
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  16. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
  17. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).

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