このプロトコルは、ロイコフィルター由来CD34+造血前駆物質の取得に関与するすべてのステップと、培養培地中の血小板を放出することができる原血小板を持つ巨核球への それらの体外 分化および成熟について詳細に説明する。この手順は、巨核代を制御する細胞および分子機構の詳細な分析に有用である。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト造血前駆細胞を巨核球に分化し、プロ血小板を伸ばし、血小板を放出することができる インビトロ の拡大と分化により、血小板生物形成の根底にあるメカニズムの詳細な研究が可能になる。利用可能な培養プロトコルは、主に骨髄または臍帯血に由来する造血前駆物質に基づいており、倫理的、技術的、経済的な懸念の数を提起する。末梢血からCD34細胞を得るためのプロトコルが既に利用可能な場合、この原稿は、血液中枢で容易に入手可能な白血病減少フィルターからCD34+細胞を得るための簡単で最適化されたプロトコルを提案する。これらの細胞は、輸血製品の調製に使用される白血病枯渇フィルターから単離され、8つの献血に対応する。これらのフィルタは破棄されます。これらのフィルターからCD34+細胞として同定された造血前駆物質を収集する詳細な手順について説明する。プロメトレットを伸ばす成熟した巨核球を得る方法についても詳しく述べています。最後に、このプロトコルは、較正されたピペット法を提示し、形態学的および機能的に天然のものと類似した血小板を効率的に放出する。このプロトコルは、基礎となるメカニズムを解剖し、 インビボ 血小板収量に近づくプロセスの様々なステップで作用する薬理学的化合物を評価するための基礎として役立つことができる。
概要
血小板は、巨核球(MKP)として知られている一定の微調整された生産プロセスに由来する特殊な大きな多倍体細胞、巨核球(MK)から来ます。このプロセスの頂点には、骨髄環境(サイトカイン、転写因子、造血ニッチ)と接触して、巨核球体経路に向かってコミットできる造血前駆体(HP)に増殖し、分化することができる造血幹細胞があります。MKPの主要なサイトカインである様々なサイトカイン、特にトロンボポエチン(TPO)の影響を受ける。MKは成熟の2つの主要な段階を受ける:エンドミドーシスと境界膜(DMS)の開発。この完全に成熟したMKは、血液の流れの下で放出され、その後機能血小板2に改造される細胞質拡張、プロ血小板を放出することができるシヌソード血管の近くに現れる。1994年のTPOのクローニングは、HP の分化とMK成熟を可能にする インビトロ 培養技術の開発を加速させることによって、MKPの研究を後押しした。
血小板に影響を与える多くの病理があり、血小板数(増減)と機能4、5の両方の点で。ヒトHPから生体外でMKPを再現できることは、このプロセスの根底にある分子および細胞メカニズムの理解を深め、最終的には患者の治療管理を改善することができる。
ヒトHPのさまざまな供給源が適している:臍帯血、骨髄、および末梢血6、7、8。末梢血からHPを収穫することは臍帯血または骨髄からの回復より少ない物流および倫理的問題を提起する。HPは、白血病やバフィーコートから回収することができますが、これらの供給源は高価であり、常に血液中枢で利用可能であるとは限りません。他のプロトコルは、より安価で実行しやすく、以前のCD34駆動隔離4、8を必要とせずにヒト末梢血単核細胞(PBMC)を直接回復することを可能にする。しかし、この方法では巨核球の純度は満足のいくものではなく、MKへの最適な分化にはPBMCからCD34+細胞を選択することが推奨されています。これにより、白血球を除去し、免疫反応の悪性を避けるために血液バンクで日常的に使用される、白血病低減フィルター(LRF)からのHP精製を実施するに至った。確かに、1998年以来、フランスでは血小板濃縮物が自動的に白血病になってきた。このプロセスの終了時に、LRF は廃棄され、LRF に保持されているすべてのセルが破棄されます。したがって、LDF 内のセルは、追加コストなしで容易に利用できます。LDFは、白血病またはバフィーコートによって得られたものに近い細胞含有量を有し、特にCD34+HPの組成において、著しく魅力的なソース10を作る。ヒトHP源としてのLRFは、細胞に無傷の機能能力11を提供することが既に実証されている。このソースは、豊富で、実験室の研究のための手頃な価格であることの利点を持っています.この記事では、この資料では、続いて説明します: i) 抽出と LIF から CD34+ HP の選択;ii) 二相最適化培養, 巨核球経路へのHPのコミットメントとプロ血トを放出することができるMKの成熟;iii) これらのMKから血小板を効率よく放出する方法;iv) MKおよび培養血小板のフェノタイピングの手順。
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プロトコル
ヒトのサンプルを制御することは、研究が行われた輸血センターによって募集された書面によるインフォームド・コンセントを与えたボロンティアの献血者から得られた(エタブリセメント・フランセ・デュ・サン・グラン・エスト)。すべての手続きはフランスの高等教育研究省によって登録され、承認され、AC_2015_2371数で登録されました。寄付者は、サンプルを研究目的で使用するために、CODHECO番号AC- 2008 - 562同意書で承認を与えました。人間の研究はヘルシンキ宣言に従って行われた。
1. LRFからのCD34+細胞(HP)の抽出と選択
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試薬の調製 (1つのLRF用)
- 25 mLの濾過溶出バッファーを調製:リン酸緩衝食塩基線21.25 mL(PBS)、酸クエン酸デキストロース(ACD)2.5 mL、および1.25 mLの非補体ウシ胎児血清(FBS)を調製します。0.22 μmでフィルターし、37 °Cに置きます。
- エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の2 mMでPBS500mLを調製します。
- 25 mL の密度勾配媒体 (DGM) (1.077 g/mL) を 2 本の 50 mL チューブに入れ、
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LRF バックフラッシュ モダリティ (図 1)
注:このステップは、熱可塑性チューブの滅菌接続を可能にする滅菌チューブ溶接機を必要とします。- まず、LRFを空の600 mL転送バッグに接続し、LRFをチューブセットに接続します(図1A)。バイオセーフティキャビネットの下で、取り扱ったLFLの数(xLRF x 25 mL)に対応するフィルタ処理および準備溶出バッファの総容量を空の袋に注入します。次いで、30mLシリンジを使用して、LRFを介して袋の内容物全体を穏やかに吸引し、バックフラッシュして細胞を新しい50mLチューブに移す(図1B)。
- 赤血球沈下に, Dextranで半分の細胞懸濁液を希釈 2% 赤血球を凝集するためによく混合.室温(RT)で30分待ちます。
図1:LRFバックフラッシュモダリティ(A)LRFへの転写バッグの無菌接続と(ii)の管セットをLRFに設定した代表的なスキーム。(B) 細胞収集用の注射器の接続の代表的なスキーム。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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PBMCコレクション
- 赤血球沈降に続いて、上清を50mLチューブに取り出して移し、PBS-EDTA 2 mMで満たします。上清を上で準備したDGMにそっと重ねます。密度勾配の表面面を壊さずに、上清が穏やかに流れましょう。ブレーキオフモードで30分間RTで400 x g で遠心分離機。
- 使い捨て可能な転送ピペットでPBMC層を収集します。各DGMチューブから新しい滅菌50 mLチューブに細胞を移します。各チューブにPBS-EDTA 2 mMを充填し、モードのブレーキでRTで10分間200 x g でPBS-EDTA 2 mMの50 mLで2回洗浄します。
- ピペットを外し、50 mL PBS-EDTA 2 mMで細胞ペレットをプールします。
注:夜間に4°Cで攪拌下で収集した細胞を維持することによって、手順を停止する可能性があります。次いで、40μmのセルストレーナーで懸濁液を濾過し、形成された凝集体を除去する。
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CD34+ セルの選択
- 細胞数と遠心分離機を室温で400xgで10分間、ブレークオンで決定します。
- 上清を完全に吸引し、CD34選択キットのメーカーが詳述したPBS-EDTA 2 mMの適切な容積(108 セル用PBS-EDTAの300 μL)で再懸濁します。適切な濃度(108 細胞に対して50μL)のFcRブロッキング試薬とCD34マイクロビーズを加えます。
- 4°Cで30分後、細胞懸濁液を洗浄し、CD34選択キットのメーカー(108 細胞あたり500 μL)によって詳述されたPBS-EDTA 2 mMの適切な体積で再中断します。
注: 列ごとに最大 2 x 109 個のセルを並べ替える場合に選択します。 - 磁石の濡れたカラムの上にサンプルを渡します。3 mLのPBS-EDTA 2 mMで2回洗浄し、5 mLのPBS-EDTA 2 mMで細胞を溶出させます。サンプルの純度を向上させるためには、同じ手順に従って新しいカラムで2回目の実行が必要です。
注: 期待される数は 6.1 x 105 セル/LRF (図 2A)です。LRF数を増やす場合は、それに応じて試薬と方法をスケールアップします。
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CD34+ 細胞純度の評価
- CD34+選択後に得られた懸濁液の100μLのアリコートに加えて、ヒトCD34-PE抗体の2μLまたはIgG-PEの2μL(対照)を加える。よく混ぜ、4°Cで15分間インキュベートします。
- 2 mLのPBSと遠心分離機を400xgで5分間加えて細胞を洗浄します。吸気上清は完全に200 μLのPBSで再懸濁します。
- 図 2Aおよび考察に示すように、フローサイトメトリーによる純度を分析します。
メモ: 90%を超える CD34+ セルの純度が期待されます (図 2Bii)。 - CD34+セルを直接使用するか、またはさらに使用するためにフリーズしてください。
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CD34+ 細胞の凍結
注:CD34+細胞の凍結は、1mLあたり106 細胞の密度で行われます。
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結果
LIFからのCD34+セルの抽出と選択
ここで、Peytourら9に由来する方法は、白血球除去後に血液バンクで利用可能な廃棄されたLIFからのCD34+細胞の抽出および選択について説明する。バックフラッシュ手順に従って、通常1.03 x 109 ±2.45 x 108セル/LRF(平均±SEM;n = 155)は、94.88±0.10%の生存率で回収される(図2Ai)。 CD34陽性選択後、平均615.54 x 103±12.28細胞/LRFが得られる(n=155) (図2A ii)。セル数が 300,000 未満の場合は、手順が正しく実行されておらず、停止する必要があると結論付ける必要があります。CD34選択の成功を評価するために、CD34+細胞の純度はフローサイトメトリーに...
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ディスカッション
このプロトコルは、血液由来HPからプロ血小板を放出し、培養培地から血小板を放出することができるMKを産生する方法を説明する。HPは、細胞血液産物から汚染された白血球を除去し、有害反応を避けるために使用される血液バンクの副産物であるLRFから得られる。この方法は比較的簡単ですが、いくつかの点は特別な注意を払うに値します。
密度勾配媒体上の細胞懸濁液の沈着(ステップ1.3.1)は、混合物(赤色含有量)を避けるために穏やかに行われね。この手順を慎重に実行しない場合、プロトコルはこの時点で停止する必要があります。同様に、ステップ1.3.1でも、分数を混ぜないようにブレーキをオフモードにする必要があります。ない場合は、HP の選択を中断する必要があります。プロトコル 1.4 に示されているように、PBMC コレクションの後に手順を中断できます。この場合、細胞は、4°Cで一晩攪拌下で維持することができる。 その後、40 μmのセルストレーナーを使用して形成された凝集体を除去し、その後のCD34選択に影響を与える可能性があります。なお、手順を中断してもCD34+細胞の収率や純度には
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品は、ANR(アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ)グラントANR- 17-CE14-0001-1によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| 抗CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| 抗CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| 抗CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| 遠心分離機 | ヘレウス | Megafuge 1.OR | または同等の材料 |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | または同等の材料 |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | または同等の材料 |
| ロイコノストック属のデキストラン | シグマ | 31392-50g | または同等の材料 |
| DMSO Hybri-max | シグマ | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| エッペンドルフ 1.5 mL | Dutscher | 616201 | または同等の材料 |
| ろ過ユニット Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human | LDL Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | または同等の材料 |
| 層流フード | Holten | NA | アーカイブ製品 |
| LS Columms | ミルテニーバイオテック | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen 連鎖球菌グルタミン (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | または同等の材料 |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| ポッシュ・ド・トランスファー 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| プレセパレーションフィルター (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | サーモスサイエンティフィック | SH3007103 | |
| シリンゲ30mL | テルモ | SS * 30ESE1 | または同等の材料 |
| リンジフィルターMillex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| チューブ 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | または同等の材料 |
| チューブ 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | または同等の材料 |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | または同等の材料 |
参考文献
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