このプロトコルは、ロイコフィルター由来CD34+造血前駆物質の取得に関与するすべてのステップと、培養培地中の血小板を放出することができる原血小板を持つ巨核球への それらの体外 分化および成熟について詳細に説明する。この手順は、巨核代を制御する細胞および分子機構の詳細な分析に有用である。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト造血前駆細胞を巨核球に分化し、プロ血小板を伸ばし、血小板を放出することができる インビトロ の拡大と分化により、血小板生物形成の根底にあるメカニズムの詳細な研究が可能になる。利用可能な培養プロトコルは、主に骨髄または臍帯血に由来する造血前駆物質に基づいており、倫理的、技術的、経済的な懸念の数を提起する。末梢血からCD34細胞を得るためのプロトコルが既に利用可能な場合、この原稿は、血液中枢で容易に入手可能な白血病減少フィルターからCD34+細胞を得るための簡単で最適化されたプロトコルを提案する。これらの細胞は、輸血製品の調製に使用される白血病枯渇フィルターから単離され、8つの献血に対応する。これらのフィルタは破棄されます。これらのフィルターからCD34+細胞として同定された造血前駆物質を収集する詳細な手順について説明する。プロメトレットを伸ばす成熟した巨核球を得る方法についても詳しく述べています。最後に、このプロトコルは、較正されたピペット法を提示し、形態学的および機能的に天然のものと類似した血小板を効率的に放出する。このプロトコルは、基礎となるメカニズムを解剖し、 インビボ 血小板収量に近づくプロセスの様々なステップで作用する薬理学的化合物を評価するための基礎として役立つことができる。
概要
血小板は、巨核球(MKP)として知られている一定の微調整された生産プロセスに由来する特殊な大きな多倍体細胞、巨核球(MK)から来ます。このプロセスの頂点には、骨髄環境(サイトカイン、転写因子、造血ニッチ)と接触して、巨核球体経路に向かってコミットできる造血前駆体(HP)に増殖し、分化することができる造血幹細胞があります。MKPの主要なサイトカインである様々なサイトカイン、特にトロンボポエチン(TPO)の影響を受ける。MKは成熟の2つの主要な段階を受ける:エンドミドーシスと境界膜(DMS)の開発。この完全に成熟したMKは、血液の流れの下で放出され、その後機能血小板2に改造される細胞質拡張、プロ血小板を放出することができるシヌソード血管の近くに現れる。1994年のTPOのクローニングは、HP の分化とMK成熟を可能にする インビトロ 培養技術の開発を加速させることによって、MKPの研究を後押しした。
血小板に影響を与える多くの病理があり、血小板数(増減)と機能4、5の両方の点で。ヒトHPから生体外でMKPを再現できることは、このプロセスの根底にある分子および細胞メカニズムの理解を深め、最....
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プロトコル
ヒトのサンプルを制御することは、研究が行われた輸血センターによって募集された書面によるインフォームド・コンセントを与えたボロンティアの献血者から得られた(エタブリセメント・フランセ・デュ・サン・グラン・エスト)。すべての手続きはフランスの高等教育研究省によって登録され、承認され、AC_2015_2371数で登録されました。寄付者は、サンプルを研究目的で使用するために、CODHECO番号AC- 2008 - 562同意書で承認を与えました。人間の研究はヘルシンキ宣言に従って行われた。
1. LRFからのCD34+細胞(HP)の抽出と選択
-
試薬の調製 (1つのLRF用)
- 25 mLの濾過溶出バッファーを調製:リン酸緩衝食塩基線21.25 mL(PBS)、酸クエン酸デキストロース(ACD)2.5 mL、および1.25 mLの非補体ウシ胎児血清(FBS)を調製します。0.22 μmでフィルターし、37 °Cに置きます。
- エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の2 mMでPBS500mLを調製します。
- 25 mL の密度勾配媒体 (DGM) (1.077 g/mL) を 2 本の 50 mL チューブに入れ、
- LRF バックフラッシュ モダリティ (図 1)
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結果
LIFからのCD34+セルの抽出と選択
ここで、Peytourら9に由来する方法は、白血球除去後に血液バンクで利用可能な廃棄されたLIFからのCD34+細胞の抽出および選択について説明する。バックフラッシュ手順に従って、通常1.03 x 109 ±2.45 x 108セル/LRF(平均±SEM;n = 155)は、94.88±0.10%の生存率で回収される(図2Ai)。 CD34陽性選択後、平均615.54 x 103±12.28細胞/LRFが得られる(n=155) (図2A ii)。セル数が 300,000 未満の場合は、手順が正しく実行されておらず、停止する必要があると結論付ける必要があります。CD34選択の成功を評価するために、CD34+細胞の純度はフローサイトメトリーに.......
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ディスカッション
このプロトコルは、血液由来HPからプロ血小板を放出し、培養培地から血小板を放出することができるMKを産生する方法を説明する。HPは、細胞血液産物から汚染された白血球を除去し、有害反応を避けるために使用される血液バンクの副産物であるLRFから得られる。この方法は比較的簡単ですが、いくつかの点は特別な注意を払うに値します。
密度勾配媒体上の細胞懸濁液の沈着(ステップ1.3.1)は、混合物(赤色含有量)を避けるために穏やかに行われね。この手順を慎重に実行しない場合、プロトコルはこの時点で停止する必要があります。同様に、ステップ1.3.1でも、分数を混ぜないようにブレーキをオフモードにする必要があります。ない場合は、HP の選択を中断する必要があります。プロトコル 1.4 に示されているように、PBMC コレクションの後に手順を中断できます。この場合、細胞は、4°Cで一晩攪拌下で維持することができる。 その後、40 μmのセルストレーナーを使用して形成された凝集体を除去し、その後のCD34選択に影響を与える可能性があります。なお、手順を中断してもCD34+細胞の収率や純度には
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品は、ANR(アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ)グラントANR- 17-CE14-0001-1によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| 抗CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| 抗CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| 抗CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| 遠心分離機 | ヘレウス | Megafuge 1.OR | または同等の材料 |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | または同等の材料 |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | または同等の材料 |
| ロイコノストック属のデキストラン | シグマ | 31392-50g | または同等の材料 |
| DMSO Hybri-max | シグマ | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| エッペンドルフ 1.5 mL | Dutscher | 616201 | または同等の材料 |
| ろ過ユニット Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human | LDL Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | または同等の材料 |
| 層流フード | Holten | NA | アーカイブ製品 |
| LS Columms | ミルテニーバイオテック | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen 連鎖球菌グルタミン (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | または同等の材料 |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| ポッシュ・ド・トランスファー 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| プレセパレーションフィルター (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | サーモスサイエンティフィック | SH3007103 | |
| シリンゲ30mL | テルモ | SS * 30ESE1 | または同等の材料 |
| リンジフィルターMillex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| チューブ 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | または同等の材料 |
| チューブ 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | または同等の材料 |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | または同等の材料 |
参考文献
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Natu....
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