バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

サマリー

バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、生化学的、生物物理学的、および構造研究に使用されるタンパク質アルギニンメチルトランスレシナーゼ(PRMT)の発現スクリーニングおよび生産のための堅牢なプラットフォームです。物質のミリグラム量は、真核生物発現プラットフォームを必要とする関心のあるPRMTおよび他のタンパク質の大部分のために製造することができる。

要約

タンパク質アルギニンメチルトランスレシエージ (PRMTs) 多くの細胞プロセスで役割を果たすタンパク質の多種多様なメチル酸アルギニン残基.PRMTは、単一またはジメチル化アルギニングアニジノ基を対称的または非対称にすることができる。これらのタンパク質の酵素学は、高品質の組換えタンパク質のミリグラム量を必要とする複雑で激しく調査された領域です。 オートア・カリフォルニカ 多核多核体ウイルス(AcMNPV)および スポドプテラ・フルギペルダ 9(Sf9)昆虫細胞を用いたバキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、PRMT1、2、および4〜9を含む多くのPRMTの発現スクリーニングおよび産生に使用されている。ドメインや切り捨てられた断片、フルレングスタンパク質を含むこれらのタンパク質の複数の構造の発現を同時にスクリーニングするために、24および96ウェルプレートおよびブロックと組み合わせた調整可能でプログラム可能なマルチチャネルピペットを利用したスケーラブルな方法を適用しました。全体として、これらの方法の調整により、バクミドDNA、組換えウイルス、およびタンパク質発現スクリーニングの大規模な生成が可能になりました。Sf9細胞懸濁液の大量充填量の培養容器を使用して、単一バッチの大規模タンパク質生産のための生産パイプラインのスペース制限を克服するのに役立ちました。ここでは、生化学的、生物物理学的、および構造的研究のための機能的PRMTの効率的かつ費用対効果の高い発現のための詳細なプロトコルについて説明する。

概要

タンパク質アルギニンメチルトランスレシエート酵素 (PRMTs) モノメチルまたは対称/非対称ジメチルの方法でのメチルアルギニン残基.繰り返しのRG/RGG/GRG配列は、ほとんどのPRMTで非常に好ましく、多種多様なタンパク質^1,2に見られる。ヒストンや転写因子などのアルギニンメチル化タンパク質やスプライシング因子は、転写、スプライシング、クロマチン構造^3、4を調節する。PRMTの基質および補因子利用、ターンオーバー、および運動論の多様な調節に関する知識の増加は、選択的阻害剤の生成と同様に、これらの酵素およびそれらの複合体^5,6に機械化光を当てる。しかし、PRMTファミリーの全てのメンバーが同じ程度に研究されるわけではありません。たとえば、PRMT9 は、最近 PRMT ファミリ 1 のメンバであることが確認された^のです。これらのタンパク質の構造および酵素機能研究は、十分なミリグラム、組換えタンパク質の量が利用可能である必要があります。

エシェリヒア・コリ(大腸菌)原核生物発現系は、通常、所定のタンパク質^7、8、9に対する複数の構成体を利用した発現スクリーニングの第一選択である。しかし、大腸菌系の発現は、PRMT5およびPRMT7(下記参照)に特に述べたように、常に活性な形態で十分な量のPRMTタンパク質をもたらすとは限らない。従って、大腸菌で発現できなかったか、真核生物発現機械によって製造される必要があるPRMTは、代替バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)における発現スクリーニングに適したベクターにサブクローニングされた。PRMT1、PRMT3およびPRMT8の発現サンプルは、インビトロアッセイおよび結晶学のために広く利用されているが、その二重メチルトランスファーゼドメインのMEP50結合パートナーを必要とするPRMT5、およびPRMT7および9のようなPRMTsのような、十分な量の活性タンパク質を得るために必要な昆虫細胞発現を必要とするPRMT5のような他のPRMTS。全体として、PRMT4、5、6、7、および9に対する標準化された中スループットメチルトランスファーゼアッセイは、昆虫細胞⁶においてBEVSを利用している。バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、生物化学的、生物物理学的、および構造研究^10、11、12に不可欠な翻訳後修飾を可能にする真核生物発現機械を必要とする組換えタンパク質を産生する汎用性の高いプラットフォームである。1983年にタンパク質発現¹³に対するバキュロウイルスの使用が最初に報告されて以来、いくつかのBEVSが市販されている。これらのプロトコルのほとんどは、発現プラスミドを昆虫細胞に移すさまざまな戦略を採用している。これらには、バクツーバク、フラッシュバック、バキュロゴールドブライト、バクベクトル-3000、バクマジック、バクパックなどが含まれます。我々のプロトコルは、BEVSで最も一般的に使用されるシステム、Bac-to-Bacシステム¹⁴に基づいており、目的のタンパク質をコードする遺伝子/cDNA(POI、ここではPRMT)を、部位特異的転置¹⁵を介して大腸菌の特殊株に維持されたバキュロウイルスゲノムに移すことを目的としています。

簡単に言えば、目的の遺伝子を含むプラスミド転写ベクターをDH10Bac E.大腸菌 の有能な細胞に変換し、組換えウイルスバクミドDNAを生成した。接着Sf9細胞は、次いでバクミドDNAでトランスフェクトされた。トランスフェクションの4~5日後、細胞培地中に分泌された最初の組換えバキュロウイルスを回収し、P1ウイルスとして標識した。P1バキュロウイルス株は、ウイルス増幅(すなわち、P2バキュロウイルス株の生成)およびタンパク質発現スクリーニングに使用された。発現スクリーニング結果に基づいて、タンパク質の最良の発現構築のためのP2ウイルスを同定し、大規模タンパク質産生のためのバキュロウイルス感染昆虫細胞(SCBIIS)の懸濁培養物を生成するために使用した。ここでは、当社の詳細なプロトコルについて説明し、試薬と培養容器の選択肢の背後にある根拠を説明し、より時間効率の高い、コスト効率の高いスケーラブルな方法論を開発し、所望の組換えタンパク質を十分に得るための戦略を支援します。

プロトコル

注: BEVS プロトコルの手順の概要は、 図 1に示します。

1. 組換えバクミドDNAの生成

1. DH10Bac変換用LB寒天選択プレートの調製
   1. 50 μg/mL カナマイシン、7 μg/mL ゲンタマイシン、10 μg/mL テトラサイクリン、200 μg/mL ブルオガル、40 μg/mL IPTG を含む LB寒天プレートを用意し、DH10 変換用に選択します。
   2. プレミックスLBスープ25gとバクト寒天13gを秤量し、2Lフラスコに入れる。121°Cで15〜30分間、蒸留水とオートクレーブで1 Lにボリュームを持参してください。
   3. 水浴を50°Cに設定し、オートクレーブした寒天溶液を水浴中で40〜60分間冷却し、50〜55°Cまで冷却します。
   4. 冷却溶液には、ゲンタマイシンを7μg/mLの最終濃度に、カナマイシンを最終濃度50μg/mLに、テトラサイクリンを最終濃度10μg/mL、ブルーギャルを最終濃度200μg/mL、最終濃度40μg/mLに加えます。
   5. 50 mL ピペットを用いて、培地の 7~10 mL の混合物とアリコートを各 60 mm プレートに混合します。プレートを室温(2時間)に座らせて硬化させます。4°Cで反転、ラップ、保管します。 抗生物質を含むプレートは、最大4週間安定です。
2. プラスミドのDH10Bac大腸菌のコンピテントセルへの変換
   1. 有能な細胞の必要な量を計算します。
   2. 氷の上の有能な細胞を解凍し、穏やかにスピンダウンし、穏やかなタップで再中断します。
   3. 12チャンネルのピペットを使用して、4μLの細胞を96ウェルPCRプレートの各ウェルに分配します。
   4. ~ 0.3~0.5 μgの組換えプラスミドDNAを有能力細胞に加え、タップして軽く混ぜます。氷の上で10〜15分間インキュベートします。
   5. PCRマシンで45°Cの熱衝撃を与えます。氷の上で2分間冷やします。
   6. 96ウェルブロック(96-深井戸2.4mL)の各ウェルにSOC培地の0.5 mLを分配します。
   7. 12チャンネルのピペットを使用して、変換された細菌懸濁液をブロックの対応するウェルに移し、エアポアシートで覆います。
   8. ブロックを37°Cの揺れインキュベーターに入れ、4〜5時間中撹拌(205rpm)します。
   9. 無菌ガラスビーズを用いてLB寒天板の表面に培養液の30〜50μLを均等に広げる。残りの文化は4°Cで保存してください。
   10. 青/白のコロニーの色が識別可能になるまで37°Cでプレートをインキュベートします(40-48時間)。十分な白、大きなコロニーがプレート上に得られる場合は培養を捨てる。
   11. 白いコロニーが組み換えバクミドDNAのみを含むようにするために、抗生物質、bluo-gal、およびIPTGを含む新鮮なLB寒天プレートに1つの孤立した白いコロニーを再ストリークし、表現型を検証する。
   12. 37°Cで48時間インキュベートする。
   13. 組換えバクミドDNAの抽出のための再縞プレートから1つの検証された白いコロニーを選んでください。
3. 組換えバクミドDNAの分離
   1. 単一の孤立した白いコロニーを50 μg/mLカナマイシン、7 μg/mLゲンタマイシン、10 μg/mLテトラサイクリンを24ウェルブロック(24ウェルブロックラウンドボトム)で補充したLB培地3mLに接種し、エアポアシートで覆います。
   2. 250 rpmで振ると一晩で37°Cで成長します。
   3. 24ウェルブロックを2,100 x g で10分間遠心します。上清をデカントし、ブロックを反転し、吸収性のティッシュペーパーを軽くタップします。250 μLの溶液1(細胞リサスペンション溶液)を各ウェルに加えます。
   4. テープパッドまたは他のシールフィルムでブロックを密封し、5〜10分間75 rpmの揺れプラットフォームに置きます。適切な細胞のリシスを確認するために各ウェルを確認し、必要に応じて、1 mLの先端を使用して再中断します。
   5. 各ウェルに250 μLの溶液(細胞溶解液)を加え、ブロックを密封し、75 rpmで30sの揺れプラットフォームに置きます(サンプルの交差汚染を避けるために、24ウェルブロックを反転させない)4分間室温でインキュベートします。
   6. 250 μLの溶液3(中和液)を加え、ブロックを密封し、30 sの75 rpmで揺れプラットフォームに置きます。タンパク質と 大腸菌 ゲノムDNAの厚い白色沈殿物が形成されます。サンプルを氷の上に10〜15分間置きます。
   7. 4°Cで2,100xgで60分間の遠心分離機を白色沈殿物にしっかりとペレットする。遠心分離の間、新しいマイクロ遠心管にラベルを付け、絶対イソプロパノールの0.8 mLを加えます。
   8. 上清をイソプロパノールを含むチューブに静かに移し、白色の沈殿物を避けます。チューブを数回そっと反転して混ぜ、氷の上に5〜10分間置きます。この段階では、サンプルは一晩−20°Cで保存することができる。
   9. サンプルを15分間、4°Cで14,000 x g で遠心分離します。 上清を取り除き、各チューブに70%エタノールの0.5 mLを加えます。チューブを数回反転させてペレットを洗浄します。室温で14,000 x g で5分間の遠心分離機。(オプション:繰り返し洗浄)
   10. プラスミド調製の無菌性を確保し、できるだけ多くの上清を取り除くために、ラミナーフローフードの内側にサンプルを持参してください。
       注:ペレットはチューブの底部から外れる可能性があるため、上清を捨てる際にはペレットを注意深く見てください。
   11. 薄層流フード内のペレットを15~20分間エアドライし、50μLのろ過溶出バッファー、10 mM Tris-Cl、pH 8.5(ペレットが過剰乾燥していないことを確認してください)
   12. 組換えバクミドDNAは135kbを超える大きさであるため、DNAの剪断を避けるために、ペレットを緩やかなタッピングで溶解する。
   13. バクミドDNAに関心のある遺伝子の存在を確認するために、PCR反応ミックスを96ウェルPCRプレートにセットします。
   14. PCR ミックスを次のように準備します: バッファー 1 μL、0.2 μL (各 10 mM) の dNTP、0.1 μL の Taq DNA ポリメラーゼ、0.1 μL (25 μM) のフォワードおよびリバースプライマー (BACV2FWD: tattccggatataccg;BACV2REV:ctctacaatgtggatc)、バクミドDNA1 μL、水8μL。
   15. 95°Cで2分間の初期変性を有する標的遺伝子の増幅を行い、続いて94°Cの25サイクルを30s、30sで55°C、1分/kbの72°Cを行います。
   16. 72°Cで7分間の最終延長後に反応を終了する。
   17. 増幅産物の10μLを、電気泳動による核酸染色液を含むアガロースゲル1%(w/v)で分析します。
   18. 検証済みのバクミド・ドナを4°Cに保存します。

2. 組換えバキュロウイルス株の生成

注:バキュロウイルス生成、バキュロウイルスの容積増幅、タンパク質発現スクリーニング、タンパク質産生のための細胞トランスフェクションを含む、バキュロウイルス発現プロトコルの任意のステップに対して95%以上の生存率を持つ指数関数的に成長するSf9細胞を使用してください。

1. ジェットプライムやX-tremeGENE 9などのバクミドDNAおよびトランスフェクション試薬(T.R.)を用いたSf9細胞のトランスフェクション。
   注:トリパンブルー染色と血球計を使用して、生存細胞数と%細胞生存率を決定することができます。生存不可能な細胞は染色を取り込み、顕微鏡下で青色に見えますが、生存細胞は染色されていないままです。細胞生存率 %を計算するために、総細胞数が得られ(染色されず、染色)、生存セル数を総細胞数で割り、100倍になります。
   1. 指数関数的に成長するSf9細胞を、血清フリー昆虫培地中の4 x 10⁵ 細胞/mLの最終的な細胞密度に希釈し、滅菌試薬貯留槽に注ぎます。
   2. プログラム可能なマルチチャンネルピペットを使用して、希釈されたSf9細胞の0.5mLを24ウェルプレートの各ウェルに播種します。
   3. プレートの1つの井戸をコントロール(未感染)としてラベル付けし、トランスフェクトされた細胞と非トランスフェクトされた細胞を比較して感染の潜在的な兆候を評価するコントロールとして使用します。
   4. プレートに細胞を播種した後、プレートを数回ゆっくりと前後に揺らし、細胞の単層を均等にします。細胞がウェルの中心に集落するので、プレートを旋回しないでください。
   5. 培養プレートへの細胞付着を可能にするために、27°Cでプレートを少なくとも1時間インキュベートする。
   6. トランスフェクション試薬バイアルをよく混ぜます。トランスフェクションごとに、トランスフェクション試薬の2 μLをトランスフェクションバッファーの100 μLに加えます。他の任意の非補充昆虫培地も使用することができます。希釈したトランスフェクション試薬を滅菌試薬リザーバーに堆積させ、10 sのために穏やかに混合する。
   7. 12チャネルピペットを使用して、希釈トランスフェクション試薬の102 μLを滅菌96マイクロウェルプレートに移します。
   8. 組み換えバクミドDNAの0.2 μg/μL溶液を96ウェルマイクロウェルプレートの対応するウェルに10 μL移動し、プレートを側面から穏やかに振る(タッピング)して混ぜます。
   9. トランスフェクション混合物を15〜20分間インキュベートし、複雑な形成を可能にします。
   10. 96~24ウェルプレート間の移動用に設計された調整可能な6チャンネルピペットを使用して、トランスフェクションミックスを細胞に滴下してトランスフェクションプレートの対応するウェルに追加し、27°Cで4〜5時間インキュベートします。
   11. インキュベーション時間中にプレートを数回ゆっくりと前後に揺らし、細胞単層上のトランスフェクション混合物の均等な分布を確保します。
   12. トランスフェクション後4〜5時間、1.5mLの無血清培地を加え、10%(v/v)の加熱不活化ウシ胎児血清と抗生物質抗ミコティックの最終量(ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、および0.25m)を添加した。
   13. 27°Cインキュベーターで細胞を72〜96時間インキュベーターでインキュベートする。可能な場合は、トランスフェクションプレートを1日1回軽く揺らします。
   14. トランスフェクション後72-96時間のトランスフェクト細胞に明らかな感染の兆候(SOI)を探す(図2)。トランスフェクトされた細胞はウイルスの産生を開始し、さらに培養物に感染することを覚えておいてください。したがって、感染の兆候を探してください。
       注:感染の兆候は、昆虫細胞の構造変化であり、例えば、細胞径の25〜50%の増加、拡大細胞核、均一に丸みを帯びた形状、培養皿表面への増殖および付着の喪失、ならびに細胞生存率の低下である(図2.バキュロウイルス感染および感染していないSf9細胞)。

3. 小規模タンパク質発現スクリーニングとウイルス増幅

1. P1バキュロウイルス株によるSf9細胞の感染。
   注:トランスフェクションの4〜5日後、逆顕微鏡下でのコントロール(未感染)細胞と比較すると、感染の兆候がトランスフェクション細胞で明らかであるべきです。細胞培養培地に分泌される最初の組換えバキュロウイルスは、収集する準備ができているべきである。
   1. 種子2 x 10⁵ は、P1ウイルスに感染してウイルス量を増幅するため、24ウェルプレートの各ウェルに無血清昆虫培地中のSf9細胞を指数関数的に増殖させ、ウイルス量を増幅する(P2ウイルスの生成をもたらす)。
   2. 細胞をプレートにピペット化した後、プレートを穏やかに揺らし、前後の動きを使用して均一な単層を確保します。細胞がウェルの中心に集落するので、プレートを旋回しないでください。
   3. プレートに細胞の付着を可能にするために、27°Cでプレートを少なくとも1時間インキュベートします。
   4. 4 mLのSf9細胞を、24ウェルブロックの各ウェルに昆虫無血清培地で3.5-4 x 10⁶ の濃度で分配し、タンパク質発現スクリーニングのためにP1ウイルスに感染します。
      注:SOIを探すときに感染した細胞と感染していない細胞を比較するための未感染制御として、24ウェルプレートと24ウェルブロックの1つのウェルにラベルを付けます。
   5. プログラム可能な電子マルチチャネルを使用して、P1ウイルスの同時収集(ステップ2.1.13)、播種したばかりのSf9細胞の感染(ステップ3.1.1)、およびP1ウイルスの150 μLを有する24ウェルブロック(ステップ3.1.4)の懸濁液細胞の感染を可能にする。
   6. 収集したP1ウイルスストックの残りの部分を17,970 x gで15分間スピンダウンし、マイクロ遠心チューブに移し、4°Cで暗闇の中に保管します。
   7. 24ウェルプレート(ステップ3.1.1)を往復シェーカーにそっと揺らし、細胞単層上に追加されたP1ウイルスの均等な分布を確保します。インキュベーション時間中にこれを数回繰り返します。
   8. 感染したSf9細胞の懸濁液培養液(ステップ3.1.4)で24ウェルブロックをエアポアシートで覆います。
   9. 24ウェルブロックを27°Cでインキュベートし、245rpmで72-96時間振ります。
   10. P2ウイルス(ステップ3.1.1)を有する24ウェルプレート(ステップ3.1.1)および24ウェルブロック(ステップ3.1.4)で感染後72-96時間以内にSOIを探して、発現スクリーニングのために感染細胞を用いる。
       注:P1ウイルスによるSf9細胞の感染から4~5日後、SOIは、逆顕微鏡下で非感染した対照細胞と比較した場合、感染細胞に明らかであるべきです。
   11. P2ウイルスを24ウェルプレートから収集し、遠心分離機を15分間17,970xgで15分間収集し、マイクロ遠心チューブに移し、4°Cで暗闇の中に保管してください。
   12. 72-96 hポスト感染時に、70%エタノールで24ウェルブロックの上にスプレーし、層流フードに持ち込み、トリパンブルー染色によっていくつかのウェルの細胞密度と生存率をチェックする。
   13. 細胞に感染の兆候があり、生存率が70-75%に近い場合は、トリパンブルー染色で評価されたタンパク質精製に進みます。
   14. ペレット細胞は、24ウェルブロックを4°Cで525xgで15分間遠心して行った。 上清を捨て、25 mM Tris pH 8.0を含む1mLのリシスバッファーにペレットを完全に再中断し、 300 mM NaCl, 0.6 % NP-40, 2 mM イミダゾール, 5% グリセロール (v/v) および 1x プロテアーゼ阻害剤カクテル (100x プロテアーゼ阻害剤カクテルはアプロチニン 0.25 mg/mL, ロイペプチン 0.25 mg/mL, ペプスタチン A 0.25 mg/25 mg/mL;E-64 0.25 mg/mL)。
   15. その後の試験精製のために、細胞懸濁液を-80°Cに保存してください(3.2.2参照)。
2. 凍結細胞懸濁液からのタンパク質精製を24ウェル試験発現ブロックで行う。
   1. バインド ブロックのアセンブリ (図 3)
      1. 96深層ウェルブロック(96-深井戸2.4mL)の上部にパラフィルムの重なり合う3層を配置します。
      2. 96ウェルフィルタープレート(フィルターマイクロプレート、96ウェル、25 μm超高分子量ポリエチレン膜付きポリプロピレン)を96深層ウェルブロックの上部に配置します。
      3. フィルタープレートを押し下げて、先端をパラフィルムに固定し、96ウェル深いブロックからフィルタープレートを密封します。
      4. 50 μLの事前平衡化された 50% Ni-NTA 樹脂スラリーをフィルタープレートの各ウェルに移します。
   2. テスト式の手順
      1. 冷凍セル懸濁液(ステップ3.1.15)を24ウェルブロックに入れ、RTのウォーターバスに5〜10分間置き、450rpmで20分間振ります。
      2. 24ウェルブロックを3,275 x g で15分間遠心します。
      3. マルチチャンネルピペットを使用して、クリアしたライセートを50μLの事前平衡化された50%Ni-NTA樹脂スラリー(ステップ3.2.1.4)を含むフィルタープレートに移し、96ウェルキャップマット(96ウェルキャップマット、正方形ウェル、2 mLで使用)でフィルタープレートを密封します。
         注:インキュベーションと遠心段階でバインドブロックを一緒に保つために、いくつかのゴムバンドを使用してください。
      4. 安全な結合ブロックを冷たい部屋の回転器に45-60分間置き、クリアしたライセートをNi-NTA樹脂でインキュベートします。
      5. インキュベーション後、フィルタープレートを慎重に持ち上げ、96深ウェルブロックの表面からパラフィルム層を取り除きます(ステップ3.2.1.1)。
      6. 96深いウェルブロックの上にフィルタープレートを戻し、235 x gで2分間、固定されたバインドブロックをスピンダウンします。
      7. 洗浄結合Ni-NTA樹脂2x 2mLの洗浄バッファーは25 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、5%グリセロール、および15 mMイミダゾールを含む洗浄バッファー。
      8. 235 x g で毎回5分間洗浄バッファーでブロックをスピンダウンして、残留液を完全に除去します。
      9. 4x負荷染料の10 μLを含む96ウェルPCRプレートの上部にフィルタープレートを移します。
      10. 40 μL の溶出バッファー (25 mM トリス pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% グリセロール、 500 mM イミダゾール) をフィルタープレートの各ウェルに加え、5 分間インキュベートします。
      11. ブロックをスピンダウンして、タンパク質を96ウェルPCRプレートに10分間235 x g で溶出させます。
      12. 96ウェルPCRプレートを高温に耐えるタップパッドでシールし、98°Cで3分間加熱します。
      13. 溶出したタンパク質サンプルを、タンパク質ラダーの横にある4-20%SDS-PAGEゲルの標準Laemmliバッファーに15μLロードし、SDSを含む標準ランニングバッファでゲルを実行します。
      14. クーマシーブルーでゲルを染色し、水で汚れを取り出します。テスト式の結果を分析し、大規模生産に最適な発現構造を特定します。

4. タンパク質産生のためのバキュロウイルス感染昆虫細胞(SCBIIC)の調製

1. 予定生産時間の4日前に、指数関数的に成長するSf9細胞を2 x 10⁶ 細胞/mLの最終細胞密度に分割し、125 mL / 250 mL / 500 mLエルレンマイヤーガラスシェイクフラスコを50 mL / 100 mL / 200 mLの昆虫血清フリー培地1%(v/v)を含む
2. 0.150 mL /0.300 mL /0.6 mLの適切なP2ウイルスを加え、1インチのストロークで軌道シェーカー上で165rpmで感染細胞をインキュベートし、25°Cの低温で細胞分裂を遅くする。
3. 感染後4日間で、細胞を顕微鏡下でSOIをチェックし、トリパンブルー染色で検証された細胞生存率が70〜75%に近い場合は産生に進む。

5. 大規模タンパク質製造のためのSf9細胞製剤

1. 予定生産時間の4日前に、大規模タンパク質生産に必要なSf9細胞の量を計算する。
2. 昆虫血清フリー培地中のSf9細胞の種子2Lを、2.8 Lフェルンバッハシェイクフラスコで1 x 10⁶ 細胞/mLの細胞密度にする。
3. 27°Cでインキュベートフラスコを150rpmに設定した振れを使用。
   注:Sf9細胞培養で細菌汚染を防止するには、ゲンタマイシンを10 μg/mL、またはペニシリン/ストレプトマイシンをそれぞれ50 U/mLおよび50 μg/mLに最終濃度にします。

6. 大規模タンパク質生産のためのSCBIISによるSf9細胞の感染

1. 2.5 L タネアシェイクフラスコまたは 5 L 試薬ボトルで 4 x 10⁶ 細胞/mL の最終的な細胞密度に昆虫血清フリー培地で指数関数的に成長する Sf9 細胞の 2 L または 4 L を分割します。
2. バキュロウイルス感染昆虫細胞(SCBIIC)懸濁液培養液の10-12 mL/Lを加える。
3. Sf9細胞の感染培養物をシェーカー上で、25°Cの低温で145rpm(細胞分裂を遅くする)で72〜96時間培養します。
4. 72時間の感染後、顕微鏡下で細胞を検査し、細胞の生存率を評価する。
5. 通常、約72時間後感染後、Sf9細胞の生存率は70%-75%に低下する(トリパンブルー染色を用いて測定)。1 Lポリプロピレンボトルに感染したSf9細胞を、4°Cで15分間900xgで遠心分離して収穫する。
6. 1Lの産生細胞培養液から採取した細胞ペレットを、緩やかに旋回して1xPBSの20〜25mLで再懸濁し、50mL円錐形チューブに移します。
7. 細胞懸濁液を900 x g で15分間回転させ、PBS溶液を捨てます。
8. 洗浄した細胞ペレットを、20-25 mLの懸濁液バッファー(20 mM Tris-HCl pH 8.0,500 mM NaCl,5%グリセロール、1xプロテアーゼ阻害剤カクテル)と液体窒素中のフラッシュフリーズで再懸濁する。精製まで-80°Cで保管してください。
   注: PRMT の精製手順については、SGC の論文⁶に詳しく説明されています。

結果

BEVS プロトコルの概要を図 1に示します。PRMTの複数発現構築物は、全長、ドメイン、および切り捨てられた断片を含む、構造ゲノミクスコンソーシアム(SGC、トロント)で生成され、比較的高い発現レベル^7,9で可溶性および安定性タンパク質を同定するための成功率を高めようとして社内戦略に従^った。関心のある読者は、発現クローンに組み込まれた遺伝子配列のセグメントとして「断片」を設計するSGCの定義と方法論を検討し、PFAMアノファクタ化された構造ドメインとしての「ドメイン」、および発現ベクターでクローン化された断片としての「構築」を検討することが奨励^される。このプロトコルで提示されるPRMTの発現構築物は、pFastBac1ベクターの誘導体であるpFBOH-MHLベクターにクローン化されたポリヒスチジンタグタンパク質の産生に関するものである。図4では、Sf9細胞での4mLの産生後に採取したペレットから精製されたPRMT1、2、4-9のHisタグ付き可溶性構築物のSDS-PAGE分析を提示する(ステップ3.1.4)。フルレングス(FL)PRMT1およびPRMT9は、このゲルでは提示されておらず、FL PRMT1は大腸菌から製造されているので、BEVSから製造されたFL PRMT9はFlagタグ⁶によって精製されている。PRMT1、FL PRMT4、およびすべてのPRMT8コンストラクトの切り捨てられた構成体は比較的高い収率を示すが、タンパク質溶出物は共精製汚染物質の分画を含む。これらの構成体は、精製プロトコルのさらなる最適化を必要とする。したがって、分析結果を浄化したリセートを用いたインキュベーションの段階でのニッケルビーズの量の減少など、スケールアップ生産からこれらのタンパク質の純度を向上させるためには、さらなるアプローチが必要です。洗浄バッファー内のイミダゾール濃度の増加;TEVプロテアーゼによるHisタグの切断、続いてNi-affinity樹脂への適用;サイズ排除やイオン交換クロマトグラフィーなどの追加の精製ステップ。PRMT2の構築物は、強力な汚染バンドを伴う他のタンパク質および全長PRMT2タンパク質と比較して有意に低い収率を示す。スケールアップ生産とIMACおよびサイズ排除などの精製の2つのステップは、FLタンパク質の共精製汚染物質の持続的存在と共に、この構造の低発現レベルを確認した。純粋なタンパク質は、その義務結合パートナーであるMEP50で製造および精製されたPRMT5複合体について得られた。PRMT9の切り捨てられた構造は、他のPRMTと比較して、ほぼ2〜3倍の低い発現レベルを有し、1.5mg/Lに近い。それにもかかわらず、この構成体の組換えウイルス株はスケールアップ生産に用いられ、回折結晶が得られ、このタンパク質に対してPRMT4、6、および7と共に構造が解された(図5)。

スケールアップ産生については、対応するP2ウイルスを使用してSf9昆虫細胞の懸濁液培養に感染した。このステップは、上清中の感染細胞およびP3ウイルスを含むバキュロウイルス感染細胞の50/100/200 mLを生成する。大規模なタンパク質生産のために、2LのSf9細胞を150rpm、27°Cでそれぞれ2.8 Lのフェルンバッハ振動フラスコで培養した(図6)。生産日に、2 LのSf9細胞(細胞生存率>97%)2.5 Lタネアシェイクフラスコまたは4 Lの5L試薬ボトルでは、4 x 10⁶/mLの細胞密度に希釈した。これらの細胞は、バキュロウイルス感染昆虫細胞の懸濁培養液の10-12 mL/Lに直接感染し、145rpmで25°Cの低温でインキュベートした。バキュロウイルス感染昆虫細胞の懸濁培養による生産バッチの直接感染は、ウイルス量増幅における手間のかかるステップを大幅に減少させ、感染細胞の余分な取り扱いを除き、価価およびウイルス分解の減少を回避した。SF9細胞培養の維持およびスケールアップ生産は、1つのバッチで大規模なタンパク質生産を採用するために大量の培養容器で行われている(図6)。

全長PRMT 4、5(MEP50との複合体)、6、7、およびバキュロウイルス媒介生産プラットフォームから産生される9タンパク質は、SGC6での運動特性評価および阻害剤化合物スクリーニングに使用されている。結晶構造を解いて、タンパク質PRMT 4、6、7、および9の全長または切り捨てられた形態のタンパク質データバンク(PDB)に、様々な化学プローブおよび阻害剤を用いて堆積させた。これらのPRMTの発現プラスミドは、Addgeneプラスミドリポジトリに堆積し(AddgeneはSGCの配布パートナーであり、https://www.addgene.org/)、研究コミュニティに利用可能である(図5)。

図1: バキュロウイルス発現プロセスの手順の概略図図 この 図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:バキュロウイルス感染および感染していないSf9細胞 感染の兆候は、昆虫細胞の構造変化であり、例えば、細胞径の25〜50%の増加、拡大細胞核、均一に丸みを帯びた形状、増殖の喪失、および培養皿表面への付着、ならびに細胞生存率の低下である。白スケールバー200 μm。ここで提示される感染の徴候は、トランスフェクション試薬、JetPrimeおよびX-tremeGene 9の両方を使用してトランスフェクション細胞のために同じです。示される特定の例は、ジェットプライムトランスフェクション試薬に対するものである。(A) コントロールとして感染していない Sf9 細胞。(B) バキュロウイルス感染Sf9細胞 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:試験発現タンパク質を迅速に精製するための結合板アセンブリ詳細については、手順3.2.1-2この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください、テキストを参照してください。

図4:タンパク質発現スクリーニング結果 異なるPRMTおよびPRMT5-MEP50複合体に対応するP1組換えウイルスに感染したSf9懸濁培地の4mLにおけるバキュロウイルス媒介タンパク質産生のタンパク質発現スクリーニング結果。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:構造ゲノミクスコンソーシアム(SGC)での結晶構造研究に用いられるPRMT4,6,7,9の発現構造の概要 結晶構造は、タンパク質の完全な長さまたは切り捨てられた形態のタンパク質PRMT 4、6、7、および9のタンパク質データバンク(PDB)に、様々な化学プローブおよび阻害剤を用いて解いて堆積した。これらのPRMTの発現プラスミドは、Addgeneプラスミドリポジトリに堆積し、研究コミュニティに利用可能です(AddgeneはSGCの配布パートナーです https://www.addgene.org/)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:異なる培養容器におけるSf9昆虫細胞の維持とタンパク質産生:(A)2.8 Lフェルンバッハフラスコ細胞維持およびタンパク質産生72%の充填量を使用すると、1つの揺れプラットフォームでスループット率が2.5倍に向上します。(B)タネールシェイクフラスコ(この写真では10個中9本のフラスコのみ)と80%の充填量の試薬ボトルは、揺れプラットフォームの生産能力を大幅に向上させます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

昆虫細胞におけるBEVSの利点の1つは、翻訳後修飾機械の能力に焦点を当て、リン酸化、ミリストレーション、グリコシル化などのより複雑な改変を可能にします。哺乳動物タンパク質の非常に効率的な折りたたみと共に、これらの修飾は、生理学的に関連する下流実験¹⁶に適した大量の改変および折り畳まれたタンパク質を促進する。

ここでは、バキュロウイルス発現プラットフォームにおけるPRMTタンパク質の複数の構築物の発現スクリーニングと大規模なPRMTタンパク質産生の成功に不可欠な要素を強調するBEVSの詳細なプロトコルを説明しました:1)通常の、調整可能でプログラム可能なマルチチャネルピペットを使用して、24と96の間で生物学的材料を転送する細胞培養プレートとブロック組換えウイルスの集合体,組換えウイルスのウイルス量の増幅およびタンパク質発現スクリーニングブロックの調製。2) 組換えウイルスの生成のための高性能かつ費用対効果の高いトランスフェクション試薬。3) バキュロウイルスに感染した昆虫細胞(SCBIIC)の大規模タンパク質産生のための懸濁液培養4)大量の2.8 Lフェルンバッハシェイクフラスコを使用してSf9懸濁液培養液と2.5 Lタネアシェイクフラスコと5L試薬ボトルを大規模タンパク質製造に利用。

変換およびトランスフェクションのステップに関する特別な考慮事項と根拠。
商用プロトコルでは、1つの変換¹⁴に対して100μLのコンピテントセルを使用することを推奨していますが、市販のDH10Bac E.のコンピテントセルの変換効率は1 x 10⁸ cfu/ μg DNAと同じくらい高いので、4μLしか使用しなくなっています。これは、各変換剤がバクミドDNA単離のために単離された白色組換えコロニーを得るのに十分です。24ウェルトランスフェクションプレート中の接着性Sf9細胞を、無血清昆虫培地の0.5mLで2 x 105/mLの細胞密度で播種した。このボリュームは、井戸の作業面のカバレッジを確保するのに十分です。同時に、トランスフェクションミックスを希薄化しすぎ、トランスフェクション効率を高めます。トランスフェクション試薬はSf9細胞に対して無毒であり、培地交換は必要ありません。メディアの変化の代わりに、10%(v/v)FBSを含む培地の追加1.5 mLをトランスフェクションプレートに4〜5時間トランスフェクションタイムで添加し、細胞増殖を促進します。両方のトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率が高い。それでもX-tremeGene 9では、トランスフェクトされた細胞の感染の兆候(図2)はJetPrime試薬より10〜12時間早く現れるので、プロトコルの次のステップの作業スケジュールに応じてこれらの試薬の中から選択します。

タンパク質検査発現スクリーニングは、トランスフェクションプレートから採取し、P1と標識した初期組換えウイルスの量が、タンパク質発現スクリーニングに使用する制限因子である場合にP2ウイルスで設定することができる。

小規模から大規模なカルチャ に移行する場合の考慮事項。
歴史的に、最適な細胞増殖はSf9細胞維持およびスケールアップ生産の懸濁液培養において高い空域を必要とすると考えられていた。しかし、2014年には、培養容器の高い空域は、これまで考えられていた¹⁷よりも重要ではないと報告されました。揺れプラットフォームの軌道投げに適宜調整された揺れ速度を用いて設置された培養容器は、より長い時間の間小さな気泡を作成し維持することによって、高充填体積懸濁液培養中でも十分な酸素移動を提供する。このアプローチにより、市販の昆虫細胞は、高い細胞生存率を犠牲にすることなく、細胞の倍率の正常範囲内でより高い揺れ速度で培養することができる。

このように、6年前、細胞維持時に揺れフラスコ中の懸濁培養量を増加させ始め、揺れの状態を調整・監視しながらタンパク質製造用の異なるタイプの培養容器を導入した(図6)。これらの培養容器に最適な条件を確立するために、細胞の生存率、サイズと形状、凝集の状態、細胞の感染性とともに、細胞の倍加時間などのSf9細胞培養パラメータを監視しました。

例えば、Sf9細胞維持のために、2.8Lフェルンバッハシェイクフラスコでは、27°Cで150rpmで揺れるSf9懸濁液細胞の0.8Lの代わりに2Lを培養し、細胞生存率はほとんどの時間で99%に近く、均一に形成された健康な分割細胞を有する。スケールアップ生産では、25°Cの低温で高速145rpmで揺れる5L試薬ボトル内の4Lの細胞に感染します。 内蔵の揺れプラットフォームを備えた最も一般的に使用されるインキュベーターは、6 x 2.8 Lシェイクフラスコまたは6 x 5 L試薬ボトル、または10 x 2.5 Lタネールシェイクフラスコを保持できます。したがって、1つの揺れプラットフォームの容量は、フェルンバッハシェイクフラスコと試薬ボトルを1/3に充填すると、2.8 Lフェルンバッハシェイクフラスコを使用して4.8 L対12 L、5 L試薬ボトルを使用して10 L対24 Lである(図6)。大量の培養容器におけるサスペンション細胞培養の維持とスケールアップ生産は、生産量の限界を克服し、大規模なプラットフォームを採用しています。したがって、これは、バイオリアクターや生産パイプラインの限られたスペースにアクセスできるラボに非常に便利です。

このプロトコルは、適切な樹脂を利用し、SGCの発表された論文⁶ に記載されているように、PRMT4、7、9、およびHisタグ付きPRMT5-MEP50複合体およびPRMT6のフラグタグ付きタンパク質に関する精製バッファーを改変することにより、異なる親和性タグを有するタンパク質構築物の製造および精製に容易に適応することができる。我々は、タンパク質のPRMTファミリーのためのBEVSプロトコルを記述するが、同じアプローチは、他のタンパク質ファミリーに適用することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2.8L ナルゲン Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,Nalgene		29171-854	Sf9細胞の懸濁液培養の大規模維持用
24ウェルブロック RB	Qiagen	19583	4ml懸濁液のインキュベーション用 Sf9細胞 タンパク質の場合 発現スクリーニング
4-20 基準 TGX Gel 26W 15 ul	Biorad	5671095	精製タンパク質のSDS-PAGe分析用
50ml 試薬リザーバー	Celltreat Scientific Products	229290	希釈トランスフェクション試薬に用いるリザーバー そしてSf9細胞の懸濁液
96井戸の帽子のマット、正方形の井戸との使用のために、2つのmL	Greiner Bio-One	381080	96の井
戸のブロック96の井戸のPCRの版	Eppendorf	30129300
バクト寒天	BD	214010	LB寒天の選択のための
paltesのAirporeテープシート	Qiagen	19571	蛋白質の表現のスクリーニング
のための24の井戸のブロックをカバーするためAllega X-15R 遠心分離機	Beckman Coulter	392932
抗生物質 抗真菌薬 (100x)	Gibco	15240112
Bacmid DNA	社内	非カタログ項目	キュロウイルス生産用バクミド DNA
Bluo-Gal、1g	サーモフィッシャー	15519028
ベックマン JLA 8.1000
細胞培養プレート、24 ウェル、付属蓋、平底、滅菌済み	エッペンドルフ	30722116	ティッシュ  培養処理プレート
細胞再懸濁液 0.5 L	ミリポアシグマ	LSKCRS500	バクミドDNA抽出
用セル 溶解液 0.5 L	ミリポアシグマ	LSKCLS500	バクミドDNA抽出用
CELLSTAR 組織培養プレート、96ウェル	Greiner Bio-One	655180	トランスフェクションミックス用
ClipTip 1250、フィルターリロード、滅菌	ThermoFisher Scientific	94420818	Tips for  プログラム可能で調整可能なマルチチャンネルピペット
dNTP Mix (各 25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R1121
E1-ClipTip 電子調整可能なチップ間隔マルチチャンネルイコライザーピペット、15〜1250 μL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4672090BT	プログラム可能で調整可能なマルチチャンネルピペット
E4 XLS調整可能スペーサー6チャンネルピペット、20-300 μL	Ranin	LTS EA6-300XLS	Ranin調整可能マルチチャンネルピペット
フィルターマイクロプレート、96ウェル、ポリプロピレン、25 µmの超高分子量ポリエチレンの膜	Agilent	201005-100	表現のスクリーニングの蛋白質の浄化のため
フルバッフルのフラスコのキットTunair、2.5L	IBIの科学的な	SS-6003C	SF9細胞の懸濁液の文化の大規模な蛋白質の生産のため
Gentamicin 10x10ml	BioShop	15750078
熱不活化胎児のウシの血清	WisentのBiocenter	080-450
I-Max 昆虫培地 L-グルタミン 1 L	Wisent Biocenter	301-045-LL	無血清昆虫細胞増殖培地
インスタントブルー 超高速タンパク質染色	Expedeon Protein Solutions	ISB1L-1L	タンパク質ゲル(SDS-PAGE)染色用
Iptg、Ultra Pure、Dioxane Free、最小 99.5%	BioShop	IPT001.100
JetPRIMEトランスフェクション試薬 付属品 ジェットプライムバッファー	ポリプラストランスフェクション株式会社	114-01	バキュロウイルスを生成するためのSf9細胞トランスフェクション用
カナマイシンモノサルフェート	BioShop	KAN201.100
Lb ブロス (レノックス)、粉末微生物 Gro&	シグマ	L3022-1KG
マスターブロック96ディープウェル2.4mL	Greiner Bio-One	780285-FD	形質転換および発現スクリーニング手順に使用
最大効率DH10Bacコンピテントセル、0.5mL	サーモフィッシャー	10361012	バクミドDNA生成用コンピペット
mLINE 12チャンネルピペット、調整可能 30-300 uL	ザルトリウス	ザルトリウス725240	12チャンネルピペット
中和液、0.5 L	ミリポア シグマ	LSKNS0500	バクミド DNA 抽出
用 ニューブランズウィック州 Innova 44R、120V、軌道 2.5 cm (1 in)	Eppendorf	M1282-0004	Sf9 細胞の懸濁液のインキュバイオン用シェーカーインキュベーター
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30250	タンパク質精製用
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Gibco	LS15140122
PYREX デロングシェーカー三角フラスコバッフル、コーニング 500ml	Pyrex	4444-500	For  Sf9細胞の懸濁培養
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer フラスコ バッフル付き、コーニング  125ml	Pyrex	4444-125	Sf9細胞の懸濁培養用
PYREX Delong Shaker 三角マイヤーフラスコ、バッフル付き、コーニング  250ml	Pyrex	4444-250	Sf9細胞
の懸濁培養用レッドセーフ 核酸 酸 染色 溶液	Froggabio	21141
RNase A、0.9 mL	ミリポア シグマ	LSKPMRN30	バクミド DNA 抽出用懸濁液バッファー用
ロール &球形ガラスめっきビーズ	MPバイオメディカル	115000550	。寒天プレートの表面全体に細菌 細胞の広がり
RT-LTS-A-300μL-768/8 (先端)	ラニン	30389253	ラニンマルチチャンネルピペット
用ヒント S.O.C. 中	サーモフィッシャー科学	15544034
血清、細胞培養、ウシ胎児血清 (FBS)、ハイクロン、特徴付けられたカナダの	cytivalifesciences	SH3039602	フリーメディムに加えて、トランスフェクト細胞
Sf9 細胞	サーモフィッシャー	12659017	昆虫細胞
Sfx-Insect Cell Culture Media	Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)	SH3027802	無血清昆虫細胞増殖培地
テープパッド	Qiagen	19570	テープパッド
Taq DNAポリメラーゼ ThermoPol Buffer - 2,000 units	ニューイングランドバイオラボ	M0267L
テトラサイクリン Hcl	BioShop	TET701.10
トリパンブルー 0.4%ソリューション	Gibco	15250061	For  細胞生存率の評価
VITLAB 試薬ボトル、スクリューキャップ付きPP、PP、BrandTech、5L	VITLAB	V100889	Sf9細胞の懸濁培養における大規模なタンパク質生産用
VWR デジタルミニインキュベータ	ーVWR	10055-006	性Sf9細胞用インキュベーターVWR
インキュベーティングマイクロプレートシェー	カーVWR	97043-606	キュベーター、24ウェルブロックのSf9細胞の懸濁培養用
VWRシャーレ	VWR	CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA トランスフェクション試薬 1.0 M	Roche	6365787001	Sf9細胞トランスフェクションによる組換えバキュロウイルスの生成