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方法論記事

原発性膵臓癌および転移における腫瘍微小環境の前臨床モデルとしての器官型スライス培養

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DOI:

10.3791/62541

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2021年6月22日

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1Department of Surgery, University Medical Center Schleswig-Holstein, 2Institute of Medical and Marine Biotechnology, University of Lübeck, 3Fraunhofer Research and Development Center for Marine and Cellular Biotechnology, 4Institute for Surgical Pathology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Tumorbank Comprehensive Cancer Center Freiburg, Medical Center - University of Freiburg, 6Core Facility Histopathology and Digital Pathology Freiburg, Medical Center - University of Freiburg

この記事について

サマリー

このプロトコルは、器官型スライス培養物(OTSC)の調製を説明しています。この技術により、無傷の多細胞組織の ex vivo 培養が容易になります。OTSCは、多細胞環境での薬物に対するそれぞれの反応をテストするためにすぐに使用できます。

要約

原発性膵臓がんと転移の現実的な前臨床モデルは、 生体外で 治療反応をテストし、患者一人ひとりに合わせた治療を促進するために緊急に必要とされています。しかし、現在使用されているモデル(患者由来の細胞株や異種移植片など)には腫瘍特異的な微小環境がないため、予測的な洞察は限られています。器官型スライス培養物(OTSC)は、無傷の多細胞組織で構成されており、空間分解された薬物反応試験に迅速に使用できます。

このプロトコルは、膵臓がんの生存可能な腫瘍スライスとその転移の生成と培養について説明しています。簡単に説明すると、組織を低メルトアガロースにキャストし、冷等張緩衝液に保存します。次に、ビブラトームで厚さ300μmの組織切片を作製します。調製後、スライスは細胞培養インサートと適切な培養培地を使用して、気液界面で培養されます。培養中、細胞の分化と生存率の変化をモニターすることができます。さらに、この技術により、ex vivo での生存可能なヒト腫瘍組織への治療の適用や、トランスクリプトームやプロテオームプロファイリングなどのその後の下流分析が可能になります。

OTSCは、 ex vivo で個々の治療反応をテストし、腫瘍の異なるスライスのそれぞれの反応に関連する個々のトランスクリプトームおよびプロテオミクスプロファイルを特定するユニークな機会を提供します。OTSCをさらに調査して、原発性膵臓がんと転移の治療を個別化するための治療戦略を特定できます。

概要

膵管腺がん(PDAC)およびそれぞれの転移の既存の前臨床モデルは、患者の治療に対する反応の予測因子として不十分であり、これは医薬品開発および予測バイオマーカーの特定における大きな欠点です1。患者由来オルガノイドや患者由来異種移植片などのモデルは有望ですが、その使用は依然として限られています2。これらのin vitroモデルの主な制限は、腫瘍微小環境の欠如と、ヒト免疫不全の非ヒト種における異種移植です。特にPDACとその転移において、腫瘍微小環境は、腫瘍生物学におけるその重要な機能のために、ここ数年でかなり関心を集めています。これは、(筋)線維芽細胞、膵臓星状細胞、免疫細胞、血管、細胞外マトリックス、サイトカイン、成長因子3などの細胞および無細胞成分で構成されています。この微小環境は機能しない腫瘍成分ではなく、腫瘍の進行と転移を誘発し、放射線耐性と化学療法耐性に大きく寄与しているようです4。PDAC微小環境は、薬物送達を機械的に損なうだけでなく、免疫活性および薬物捕捉活性も有しています5,6,7。したがって、腫瘍細胞と腫瘍微小環境の複雑な相互作用を反映する前臨床モデルは、患者の治療反応をex vivoで適切にテストし、個別化された臨床治療を導くために緊急に必要とされています。

新鮮な腫瘍サンプルのex vivo培養は、in situ腫瘍の近似値を示しています。器官型スライス培養(OTSC)は、最近開発され、頭、首、乳房、前立腺、肺、結腸、および膵臓癌などのいくつかの腫瘍について研究されています8,9,10,11,12。OTSCは、定義された組織依存性の期間11,12,13の培養中に、ベースラインの形態、増殖活性、および微小環境を維持することが示されている。PDACのOTSCは、いくつかのin vitro研究5,12,14において、生存率、形態、および腫瘍微小環境のほとんどの構成要素を4〜9日間維持した。将来的には、この技術により、ex vivoでの生存可能なヒト腫瘍組織への治療の即時適用と、トランスクリプトームやプロテオームのプロファイリングなどのその後の下流分析が可能になります。

OTSCの設立は、手術後速やかに ex vivo で治療反応をテストするユニークな機会を提供します。したがって、OTSC は、転移性疾患の治療を個別化するための治療戦略を特定することを前向きに可能にします。このプロトコルは、膵臓がんの生存可能なOTSCの生成と培養について説明しています。

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プロトコル

組織標本は、リューベック大学の地元の倫理委員会(#16-281)の承認後に収集および処理されました。

1.新鮮なティッシュの収集と取り扱い

注:固定されていないすべてのヒト組織標本は、血液媒介性病原体による感染のリスクを防ぐために注意して取り扱う必要があります。すべての患者は、組織処理の前にHIV、HBV、およびHCVについて陰性であることが検査されるべきです。保護コートを着用し、手袋をして人体組織標本を取り扱います。

  1. 手術直後に、最小サイズ0.4 x 0.4 cmの新鮮で固定されていない凍結していないPDAC組織標本を採取し、組織保存溶液で試料を実験室に輸送します。
  2. 可能であれば、新鮮なティッシュをすぐに処理してください。
  3. あるいは、ティッシュをティッシュ保存液に入れ、4°Cの湿った氷で一晩保存します。ただし、組織の保存は生存能力を損なう可能性があるため、一般的には避けるべきです。

2. 事前準備

  1. 低融点アガロース調製
    1. 100 mLの低融点アガロース(8%)を調製するには、8 gのアガロースを予熱したリンゲル液100 mLに溶解し、必要になるまで4°Cで保存します。
    2. 腫瘍切除の発表が発表されたら、アガロースを電子レンジで溶かします。
    3. アガロースを予熱した水浴(37°C)に入れ、調製前に生理学的温度まで冷却します。
  2. ビブラトームのセットアップ
    1. かみそりの刃をビブラトームのホルダーに置き、該当する場合は製造元の指示に従って自動角度調整を実行します。
    2. カッティングチャンバーのジャケットを冷却ユニットまたはウェットアイスで冷却します。
    3. 切断チャンバーに約100 mLの生理学的切断溶液(例:リンゲル溶液)を満たします。
    4. 取り付けたカミソリの刃を事前に冷やした切断液に入れ、カミソリの刃を冷まします。

3. 低融点アガロースへの組織包埋

  1. 組織標本を冷却(4°C)PBSで洗浄し、PBS中の組織を氷上の大きな(~14cm)シャーレに置きます。
  2. 氷上で肉眼的に見える余分な結合組織をメスで取り除きますと、切断効率が悪くなる可能性があるため、メスを使って取り除きます。
  3. ティッシュを小さなシャーレ(~3cm)に入れます。
  4. 巨視的に見える結合組織の残存がペトリ皿の底面と同じ向きになるように、組織の向きを調整します。ペトリ皿の底は、切断面と同じ向きをしています。
  5. 準備した低融点アガロースを小さなペトリ皿に注ぎます。
  6. 必要に応じて、鉗子を使用して組織の向きを再調整します。
  7. ペトリ皿を濡れた氷の上に置いて、アガロースを速く硬化させます。
  8. メスを使用して組織を慎重に切断し、組織の両側に少なくとも5mmの周囲のアガロースを残します。
  9. 埋め込まれた組織を慎重に移し、瞬間接着剤を使用してサンプルホルダーに接着します。
  10. 数秒後、サンプルホルダーをカッティングチャンバーに入れます。
  11. 必要に応じて、組織の向きをかみそりの刃に向けて調整します。

4. ビブラトームによるアガロース包埋組織のスライス

  1. 組織試料のサイズに応じて、切断範囲(y軸)の外側の限界を定義します。
  2. ティッシュブロックの上部に向かってブレードを調整します。
  3. 切削速度を0.04mm/s、切削振幅を1mm、スライス厚を300μmに設定します。
  4. 最初のスライスを慎重にカットし、湿った氷の上で事前に冷却した(4°C)切断溶液を入れた別の容器に移します。

5. 器官型スライス培養物の培養

  1. ウェルごとに1 mLの適切な培養培地を入れた6ウェルプレートを調製します。
    1. ミディアムA:高度なDMEM / F12、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン。
    2. ミディアムB:RPMI 1640、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、4μg/mLインスリン、8 ng/mL EGF、0.3 μg/mLヒドロコルチゾン。
      注:最適な培養条件の培地は、組織や患者によって異なる場合があります。2つの異なる組織培養培地を比較し、1つはDMEM/F12(培地A)をベースにしたもの、もう1つはRPMI(培地B)をベースにしたものを比較しました。これらのメディア間に実質的な違いは検出されませんでした。このプロトコルで示されたすべての実験について、培地Aを使用しました。
  2. 培地を入れた6ウェルプレートをインキュベーターに入れ、培養前に温度とpHを調整します。
  3. ゲイズフィルターを使用して、スライスを細胞培養インサート(孔径0.4 μmの親水性PTFEインサートなど)にセットします。
  4. ロードされたフィルターを滅菌布の上に置いて、余分な切断液を取り除きます。
  5. 準備した6ウェルプレートに装填したフィルターを入れます。インサートにメディアを追加しないでください。
  6. 6ウェルプレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。
  7. 新しい6ウェルプレートでステップ5.1、5.2、5.5を繰り返して、2日ごとに培地を交換します。
    注:器官型スライス培養物は、個々の研究課題に応じてさまざまな期間培養することができます。

6. レサズリン生存率アッセイ

注:レサズリン生存率アッセイは、生細胞15における非蛍光青色レサズリンの赤色蛍光レゾルフィンへの還元に基づいて、器官型スライス培養物の一般的な代謝活性を測定する。このアッセイは細胞に毒性作用を及ぼさず、個々の研究課題に応じて培養物に繰り返し適用することができます。生存率は、2〜3日ごとにレサズリンアッセイを使用して測定されました。

  1. レサズリン原液の調製
    1. 無菌フードのライトを消してください、レサズリンストック溶液は光に敏感ですので。
    2. 1x PBS中に10 mg / mLのレサズリンナトリウム塩を含むストック溶液を調製します。.
    3. ストック溶液は、光で保護されたアリコートに入れ、使用するまで冷蔵庫で4°Cで保存してください。
  2. 全体的なスライス生存率の評価
    1. 無菌フードのライトを消してください、レサズリンストック溶液は光に敏感ですので。
    2. レサズリン原液を適切な培地で1:250に希釈します。.
      注:希釈に使用する培地は、培養に使用する培地(培地Aまたは培地B)と同じにする必要があります。
    3. スライスごとに1 mLの最終レサズリン溶液を調製し、ブランクコントロール用にさらに1 mLを追加します(例:6スライスの場合、28 μLのレサズリンストック溶液を7 mLの培地に希釈します)。
    4. レサズリン溶液を6ウェルプレートに分注し、1ウェルあたり1 mLの希釈レサズリン溶液を分注します。
    5. スライスが入った栽培フィルターをレサズリン溶液の入ったウェルに移します。resazurinの解決が付いている1つの井戸はブランク制御として空保たれる。
      注:実験手順を簡素化するために、このステップを培地の変更と組み合わせることができます(ステップ5.7)。ただし、追加の生存率測定が必要な場合は、スライス培養物の培養中いつでもアッセイを行うことができます。
    6. 組織切片をインキュベーターに37°C、5%CO2で1時間置きます。
    7. スライス培養を続行する場合は、培地で新しい6ウェルプレートを調製します(ステップ5.1および5.2を参照)。
    8. スライスした培養フィルターをレサズリン溶液から取り出し、ロードしたフィルターを滅菌布の上に置いて余分な溶液を取り除きます。
    9. スライスと一緒に培養フィルターを事前に準備した培養プレートに移します。
    10. 各6ウェルから100 μLのレサズリン溶液を取り出し、96ウェルプレートに移します。ブランクコントロールから、3つのサンプル(3 x 100 μL)を96ウェルプレートの別々のウェルに入れます。
    11. メーカーの指示に従って、プレート光度計で消光を定量化します。励起波長は545nm、発光波長は600nmに設定されています。

7. OTSCのホルマリン固定とパラフィン包埋

  1. 培養した組織切片をプラスチック製の埋め込みカセットに慎重に移します。これを行うには、以下の手順に従います。
    1. スライスを取り付けた培養フィルターをペトリ皿に置きます。
    2. メスで、取り付けられたティッシュスライスでフィルター膜を慎重に切り取ります。
    3. スライスを取り付けたフィルターメンブレンを生検ナイロンバッグに慎重に移し、埋め込みカセットに入れます。
    4. その後、プラスチック包埋カセットを、事前に冷却した(4°C)4.5%ホルマリンを入れた容器に移します。スライスは、さらに使用するまでホルマリン溶液で4°Cに保持できますが、少なくとも24時間インキュベートする必要があります。
      注:OTSCは簡単に引き裂かれるため、細心の注意を払って転送する必要があります。
  2. ホルマリン固定スライス培養物を流水で1.5時間慎重にすすぎます。
  3. ホルマリン固定組織切片を70%エタノール(2×3時間)、95%エタノール(1×一晩、1×3時間)でインキュベートし、続いて無水エタノール(1×3時間、1×一晩)でインキュベートして脱水します。
  4. ホルマリン固定組織スライスをキシレンで3時間インキュベートして2回透明にします。
  5. 組織をパラフィンに60°Cで浸します(1回で一晩、1回で2時間)。組織包埋型に組織をパラフィンブロックに埋め込みます。
  6. パラフィン包埋組織ブロックを厚さ4 μmでミクロトームで切片化し、蒸留水を含む40°Cのウォーターバスに浮かべます。切片をスライドガラスに移します。
  7. パラフィン切片を60°Cで1時間インキュベートし、組織をガラスに結合します。スライドを37°Cで一晩インキュベートします。

8. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色

  1. ステップ7.7の切片をキシレンでインキュベート(3回5分間)して脱パラフィンします。
  2. 無水アルコール(5分間2回)、95%アルコール(5分間2回)、および70%アルコール(5分間1回)でインキュベートして再水和します。蒸留水で短時間すすいでください。
  3. Mayerヘマトキシリン溶液で5分間染色します。水道水で10分間すすいでください。
  4. 0.5% Eosin溶液で40秒間対比染色します。蒸留水ですすいでください。
  5. 70%アルコール(最大1分)、95%エタノール(2回で3分)、無水アルコール(2回で3分)でインキュベートして脱水します。
  6. キシレンを3回交換(各数秒)でクリア。封入剤を一滴垂らし、スライドをカバースリップで覆います。

9. OTSCの免疫組織化学

  1. キシレン2xで10分間インキュベートし、続いて1:1エタノール/キシロールで10分間インキュベートすることにより、切片を脱パラフィンします。
  2. スライドを100%エタノール(2倍で3分間)、96%エタノール(2倍で3分間)、70%エタノール(1倍で3分間)、次に50%エタノール(1倍で3分間)に移します。
  3. 抗原賦活化を行い、抗原エピトープのマスクを解除します。スライドをクエン酸緩衝液中のマイクロ波で900Wで5分間加熱し、続いて600Wで8分間2回加熱します。
  4. PBSで3回、シェーカーで3分間洗います。
  5. 0.1% Triton X-100 in PBS(スライドあたり200 μL)を加湿チャンバー内で室温で10分間インキュベートすることにより、細胞膜の透過処理を行います。
  6. PBSで3回、シェーカーでそれぞれ3分間洗います。
  7. 切片をメタノール中(スライドあたり200 μL)の3% H2O2 溶液と室温で10分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断します。
  8. PBSで3回、シェーカーで3分間洗います。
  9. ブロッキングバッファー200μL(PBS中の1:50馬用血清)を加え、加湿チャンバーで室温で25分間インキュベートします。
  10. 紙ティッシュの上でスライドを傾けて、スライドからブロッキングバッファーを排出します。
  11. 適切に希釈した一次抗体200 μLを抗体希釈液に塗布し、4°Cの加湿チャンバーで一晩インキュベートします。ネガティブコントロールとして、マウス免疫グロブリンの適切なアイソフォームを一次抗体と同じ希釈で使用します。
  12. シェーカーでPBSで3分間3回洗浄します。
  13. 200 μLのビオチン化二次抗体(PBS溶液1:50溶液)をスライド上にアプライし、加湿チャンバー内で室温で30分間インキュベートします。
  14. シェーカーでPBSで3分間3回洗浄します。
  15. アビジン/ビオチンベースのペルオキシダーゼ複合体は、塗布前に製造元の指示に従って調製してください。スライドに200 μLのアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体を塗布し、加湿チャンバー内で室温で30分間インキュベートします。
  16. シェーカーでPBSで3分間3回洗浄します。
  17. 200 μLのDAB基質溶液(使用直前に新たに調製したばかり:1 mLの基質に1滴のDAB)を、スライド1枚あたり200 μLで塗布します。目的の色の強度に達するまで、色の展開を1〜3分待ちます。
  18. 水道水で10分間すすいでください。
  19. スライドの側面をヘマトキシリンに5分間浸して、スライドをカウンターステインします。
  20. 水道水で10分間すすいでください。
  21. 水性封入剤とカバースリップを使用してスライドを覆います。取り付けられたスライドは、室温で永久的に保管することができます。

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結果

図 1 は、凍結されていない新鮮な腫瘍組織から OTSC を培養するワークフローの概要を示しています。原発性PDACおよび転移巣の検体は、外科的切除直後に採取し、組織保存溶液中の4°Cの湿った氷に一晩保存した。標本を加工し、スライスをプロトコルに記載されているように培養しました。各OTSCの巨視的な形態は、培養中に大きく変化しませんでした。しかし、OTSCの表面積のサイズは、 図2A に例示されているように、6日間の培養中に時間とともに減少しました。OTSC の全体的な生存率は、0、2/3、および 6 日目にレサズリン生存率アッセイによって評価されました (図 2B)。レサズリン生存率アッセイは、生細胞15における非蛍光青色レサズリンの赤色蛍光レゾルフィンへの還元に基づいて、OTSCの一般的な代謝活性を測定する。 図2B

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ディスカッション

新鮮な腫瘍サンプルのOTSCは、in situ腫瘍の近似値です。それらは、定義された組織依存期間11,12,13の培養中に、ベースラインの形態、増殖活性、および微小環境を維持します。この技術により、ex vivoでの生存可能なヒト腫瘍組織への治療の即時適用と、トランスクリプトームやプロテオームのプロファイリングなどのその後の下流分析が可能になります。OTSCの具体的な利点は、MALDIイメージングなどの空間的に分解されたダウンストリーム解析を無傷の多細胞腫瘍組織に適用できることです。

ここでは、PDACのOTSCとその転移巣の作製、培養、病理組織学的評価の方法について述べる。この技術の主な課題は、凍結手順や気液界面での培養を行わずに新鮮な組織を切断することです。この方法の限界は、新鮮、未固定、および凍結されていない組織を培養前に腫瘍細胞含有量を評価できないことで...

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開示事項

著者らは、潜在的な利益相反を明らかにしていません。

謝辞

R. Braunは、Clinician Scientist School Lübeck (DFG #413535489) と University of Lübeck の Junior Funding Program の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Advanced DMEM/F-12 MediumGibco12634028
Agarose Low MeltRoth6351.28% in Ringer solution
抗体希釈液、バックグラウンド 還元DakoS3022
AquaTexMerck108562
バイオエタノール (99%、変性)CHEMSolute2,21,19,010
クエン酸一水和物Sigma AldrichC7129
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAbCell Signalling Technology96641:400 希釈
ダービー エクストラダブルエッジ 安全 カミソリ刃ダービー東海
埋め込みカセットRothH579.1
エオシン Y-solution 0,5% 水性メルク10,98,44,100
ユーキット クイック硬化封入剤Sigma-Aldrich3989
ウシ胎児血清ギブコ10270106
ホルムアルデヒド溶液 4.5%、緩衝剤Büfa ChemikalienB211101000
Hem alum solution acid acc. to MayerRothT865
Human EGFMilteniy Biotec130-097-794
HydrocortisoneSigma Aldrich (Merck)H0888
過酸化水素 30%Merck1,08,59,71,000
Insulin humanSigma Aldrich (Merck)12643
液体DAB+基質 発色剤システムDakoK3468
MACS 組織保存液Milteniy Biotech130-100-008
メタノールMerck10.600.092.500
顕微鏡スライド Superfrost PlusThermo ScientificJ1800AMNZ
Millicell Culture Insert, 30 mm, 親水性 PTFE, 0.4 & マイクロ;mミリポア(メルク)PICM0RG50
モノクローナルマウス抗ヒト サイトケラチン7(クローンOV-TL 12/30)DakoM70181:200
モノクローナルマウス抗ヒトKi67クローンMIB-1DakoM72401:200
モノクローナルマウス抗ビメンチン(クローンV9)DakoM07251:200
ネガティブコントロールマウスIgG2aDakoX09431:200
コントロールマウスIgG1DakoX093101-21:200希釈パラ
フィン(融解温度56°C-58°C)メルク10,73,37,100
ペニシリン-ストレプトマイシン (10.000 U/ml)Gibco15140122
PBS pH 7,4 (1x) フローサイトメトリーグレードGibcoA12860301
レサズリンナトリウム塩; PBS SigmaAldrichR70171:250 希釈
ゲル溶液フレゼニウス カビ
RPMI-1640 ミディアムSigma Aldrich (Merck)R8758
組織培養試験板 6TPP92006
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase KitVector LaboratoriesPK-6200
キシレン (エクストラピュア)J.T.Baker8,11,85,000
Equipment
ClarioStar マイクロプレートリーダーBMG Labtech
パラフィン包埋センター E61110ライカ
ロータリー ミクロトーム Microm HM355SThermo Scientific
切片搬送システム Microm STSThermo Scientific
VT 1200S バイブラトムライカ
希釈 希釈 希釈 希釈 ネガティブリン 2610813

参考文献

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