うつ病の動物モデル - 慢性絶望モデル(CDM)

大うつ病性障害などの情動障害は、最も頻繁で困難な精神疾患の1つであり、個人の高い苦しみ¹、自殺リスクの増加²と関連しており、社会にかなりの社会経済的負担を引き起こします³。その影響にもかかわらず、治療の選択肢は限られており、特に過去数十年にわたる精神薬理学の革新の危機のために、新しい抗うつ介入の開発が緊急に必要とされています。うつ病の病態生理学を理解し、潜在的な新しい薬剤をテストするためには、合理的で有効な動物モデルが緊急に必要です⁴。ほぼ半世紀にわたり、Porsolt5によって最初に記述された古典的な強制水泳試験(FST)は、潜在的な新規抗うつ薬のスクリーニングのための誘導および読み出しとして使用されていました。これは、1日目に5〜15分間の強制水泳期間、その後の1回限りの薬物適用、および翌日の別の水泳期間におけるマウスが水中で不動で過ごす部分の評価からなる。不動時間は、逃避行動を表すと考えられ、マウスのうつ病様状態の程度と相関すると考えられた⁵。

古典的なFSTは、科学界だけでなく、公共のメディアでも激しく批判されています^6,7,8。FSTに関するほとんどの論争は、古典的なパラダイムにおけるわずか1日の短い誘導および治療期間によるものである。FSTは、人間のうつ病に匹敵する状態よりもむしろ急性外傷モデルを表すと主張した。さらに、Porsolt試験は、潜在的な抗うつ薬のスクリーニングツールとして適しているかもしれないが、多くの抗うつ薬の作用開始の遅延を無視している。

慢性絶望モデル(CDM)⁹、10、11、12、^13、14、¹⁵は、元のFSTに由来し^、うつ病のためのより適切な動物モデルを表す。CDMでは、5日間連続して繰り返し泳ぐストレスは、急性外傷性の影響を回避します。繰り返され、進行中のストレスの多い状況から逃れられないことによって、マウスは無力感、降伏、そして最終的には絶望の状態を発症すると考えられています。このパラダイムは、心的外傷後ストレス障害の発症時に一般的に経験される単一の急性外傷よりも、ヒトにおけるうつ病の発症に関する現在の心理学的理論に匹敵する。CDMにおける結果として生じるうつ病様状態は、最大4週間安定であり⁹、したがって、抗うつ薬が利益を示すために通常2〜4週間を必要とする臨床状態に匹敵するより長い治療期間の可能性を開く¹⁶。

抑うつ状態の評価は、多次元的であるべきである。古典的なFSTのような不動時間の測定は有用であるが、唯一の結果パラメータとして使用するべきではない。以下に説明する様々な方法は、抑うつ状態の異なる次元を、うつ病のヒトに通常見られる症状に沿ってマッピングすることができるはずである。適切な読み出し評価には、脱出行動(不動時間^9,10,17)、尾懸垂試験(TST)⁹、無快感(古典的スクロース嗜好試験(SPT)18)、動機指向行動(鼻突スクロース嗜好試験(NPSPT)10)、期待/探索行動(曖昧な信号に対する応答¹⁹;Y-迷路試験⁹)、電気生理学(長期可塑性の測定(長期増強、LTP;長期うつ病、LTD)²⁰)、分子評価(即時初期遺伝子(IEG)の活性化パターン;さらなるストレスパターン²¹)。

理論的には、反復水泳試験は、不動時間の評価なしに抑うつ状態を誘発するために使用することができる。ただし、少なくとも不動時間を持つ概念実証実験シリーズを提供することを強くお勧めします。さらに、CDMは、誘導期中の不動時間を測定することによって抑うつ様状態の発達を評価するのに好適なモデルを表す。水泳前に処置された特定のマウス系統またはマウスは、ストレスに対する回復力または脆弱性および行動的絶望の誘発に関して評価することができる。

すべての実験は、欧州のガイドライン(EU 2010/63)に同意し、ドイツの動物保護法(TierSchG)、FELASA(www.felasa.eu/guidelines.php)、実験動物の世話と使用に関する国家動物福祉団体GV-SOLAS(www.gv-solas.de/index.html)ガイドに従って行われ、フライブルク大学の動物福祉委員会およびストラスブール大学の動物福祉委員会(CREMEAS、 CEEA35)、ならびに地方自治体。生後10〜14週齢(生後70〜98日、PND)のC57Bl6N野生型マウスの両性を、野生型(WT)示された実験に使用した。ストレスレジリエントな系統として、前脳神経細胞_CaMKIIプロモーター下のアデノシンA1受容体の発現を増強したトランスジェニックマウス系統を用いた^9,15。実験後、マウスを子宮頸部脱臼により屠殺した。

1. 準備

1. 徹底した実験計画を含む動物実験免許を取得する。
2. 到着:到着時に、CDMを実行するために動物施設で動物を飼育します。動物が外部のサプライヤーから購入された場合は、新しい環境に適応するために少なくとも2週間かかります。
3. 住居:動物を収容するには、追加のストレスを避けるために、ケージが最大数の動物で占有されていないことを確認してください。飼育条件がマウス飼育の国際的な勧告(詳細については、 see ²²)に沿っていることを保証し、常にそれらを常に維持する。
   注:最も重要な標準的な住宅条件には、1時間あたり25〜120回の空気変化を伴う個別に換気されたケージ、12時間の明暗サイクル、可能な限り安定した温度(少なくとも20〜24°Cの間で一定)、可能な限り安定した湿度(少なくとも45%〜65%)、かじりつく材料と避難所の存在、個々のハウジングなしが含まれます。
4. 時点: 1 日の同じ時間にすべての実験を実行します。
   注:昼間のCDMへの影響を検証するための直接的な評価は行われていないが、抑うつ様の状態を評価するほとんどの行動テストは、時刻によって変動を示しており²³、^24、25、昼間もCDMに影響を与える可能性が高い。
5. ネスティング材料: ネスティング材料を最小限に抑えます。ケージ内にランニングホイールなどがないことを確認します。
   注:豊かな環境は、抑うつ状態の誘発を防ぎます。
6. グループ構成:実験全体を通して、動物が同じグループにとどまるようにします。異なる同腹仔からでも雌マウスを一緒にグループ化する。雄マウスを同腹仔の雄動物と一緒にグループ化する。今後の攻撃性、特に男性の攻撃性のために、噛むことや理髪が問題になる可能性があるため、グループ構成に特に重点を置きます。剥奪は大きな追加ストレス要因であるため、単一の住宅を避けてください。
7. 動物:特定の違いが観察されているにもかかわらず、異なるマウス系統を使用してください^9,10。頻繁に使用されるマウス系統はC57Bl6N.で、対応のある統計分析を実行するためにマウスにラベルを付けます(ステップ3.2.4を参照)。
8. 動物の性別:雄と雌の両方のマウスを等しく使用してください。
9. 動物の年齢:動物が少なくとも10週齢(70PND)であることを確認してください。水泳による疲労のために若い動物を使用しないでください。
10. 機器:容量2L以上、直径24~26cm、高さ30cm以上の透明なガラスシリンダー/ビーカーを使用してください。その他の要件には、水温をチェックするための温度計、ペーパータオル、赤色光加熱ランプ/加熱マット、または同等の加熱源、タイマー、ストップウォッチ、静かな環境が含まれます。水泳セッションをビデオ録画して、オフラインでの分析と文書化を行います。日付と時刻が、個々の動物の識別コード番号とともに、テープ/ファイルに継続的に表示されることを確認します。後で分析してさらに参照できるようにファイルを保存します。フィルムは、上からではなく、ガラスシリンダーの側面から、分析を容易にする。

2. 誘導相

1. 始める前に
   1. 噛んだり理髪をしたりの兆候を含む異常がないか動物を視覚的に観察してください。動物が最小限の傷害を示す場合は、実験シリーズからケージ全体を除外します。実験中に怪我が悪化し、マウスがストレスの影響下でより攻撃的になるにつれて継続を妨げるため、獣医師がいつでも利用可能であることを確認してください。
   2. 実験を開始する前に各動物の体重を得た。しばしば観察される体重減少が初期体重の20%を超えないようにしてください。20%以上の体重減少を有する動物を除外し、想定される高い苦痛のために直ちにそれらを安楽死させる。
   3. ビーカーまたはシリンダーを室温(22〜23°C)で底から少なくとも20cmの高さまで水で満たし、水面と容器の上部境界との間に最低10cmを残します。
2. パフォーマンス
   1. 動物を静かに水に移します。水泳段階では、溺死を防ぐために動物を連続観察下に置いてください。動物が実験者を見ることができない位置から観察する(例えば、隣の部屋からのビデオ観察)。
   2. 実験の開始時にクロノメーターを設定します。10分後には、尾をつかむだけで動物を水から取り出します。ペーパータオルで優しく乾かし、暖房用ライトの下または暖房マットの上に置きます。
   3. 一度に1匹の動物だけを評価します。動物がお互いを見ることができないようにします(たとえば、部屋の仕切りで実験用のケージからケージを分離します)。
   4. 強制水泳セッションを毎日10分間、5日間連続して実行します。
3. 仕上げ
   1. 5回の水泳セッションの後、動物を自宅のケージに戻し、少なくとも2日間休ませます。その後、特定の治療介入を開始する。

3. 抗うつ治療の評価

1. 時間経過
   1. CDMによる急性および亜慢性治療を評価する。科学的な質問に応じて、誘導段階と読み出しの間の休息期間を調整します。
   2. ケタミンの急性および速効性効力を評価するには、CDMの誘導期後の短い休息期間(数日)を選択する。治療(すなわち、腹腔内注射)を適用し、その後すぐに評価(追加の水泳セッションまたは異なる評価方法)を行う。
   3. 亜慢性治療の効果を評価するには、治療期間を最大4週間まで延長します(より長い治療期間で利用可能なデータはありません)。例えば、誘導期後4週間の間に動物にイミプラミンによる経口処置を与え、その後評価する。
   4. 治療期間の終了直後、例えば翌日に抑うつ状態の評価を開始する。対照条件と実験条件には、常に同じ期間を選択してください。
2. 不動時間
   1. 概念実証
      1. 読み出し方法として不動時間を使用するには、誘導相と試験日の各日を評価して概念実証を提供します( 図1参照)。さらなる実験系列については、評価を1日目、5日目、および試験日に減らす( 図1C参照)。
      2. 各実験をビデオテープに収める。実験条件に盲目になっている 2 人の訓練を受けた観察者が独立して分析を実行できるようにします。ビデオ分析により、実験者は別の部屋から動作を観察できるため、テストとの干渉を最小限に抑えることができます(たとえば、 補足資料のビデオファイルを参照)。
   2. 条件:水泳テスト中に3つの異なる行動条件(闘争、水泳、不動)を観察し、特定します。ほとんどの研究者は不動に焦点を当てています。苦闘と水泳のさらなる区別はめったに役に立たず、分析の複雑さと持続時間を劇的に増加させます。
      1. 苦労:動物は積極的に脅威的な状況から逃げようとします。これには、頭を壁に向け、すべての手足の動きでシリンダーの側面を足で止めることが含まれます。水面は通常、わずかに乱流です。
      2. 水泳:動物は少なくとも両方の後足を動かし、水中を距離を移動します。それは積極的に出口を探しますが、容器のガラス壁を乗り越えようとはしません。水泳は足を水面上に持ち上げることを伴わず、体は通常シリンダーの壁に平行に向いています。この状態では、動物はしばしば向きを変えたり、円を描いて動きます。
      3. 不動:動物は凍ったような姿勢で静止し、まったく動かないか、尾を動かすか、前足を動かして頭を水面の上に保ちます。パッシブフローティングを除いて、距離は積極的に移動されず、前足の指向性の動きは観察されません。
   3. トラッキング
      1. オフラインのビデオ録画を使用して評価を実行します。2人の独立した経験豊富な審査官による盲検評価を使用し、2つの評価の平均を計算します。
      2. 2人の評価者の結果が以前に決定された範囲を超えて異なる場合は、評価を繰り返します。さまざまな条件が闘争、水泳、および不動の間で頻繁に変化するので、マウスを継続的に観察する。
      3. ストップウォッチを使用して、マウスが水中にとどまる10分間にわたって、焦点を合わせた段階(通常は不動)に費やされた合計時間を測定します。進行中の時間測定を変更する前に、約1秒の短い待ち時間を考えてみましょう(例えば、動物が20秒間不動のままで、1秒未満で1回だけ移動し、さらに10秒間不動に戻る場合、合計不動時間は30秒です)。
   4. 統計:個体間標準偏差が比較的高いため(おそらくケージから水泳テストへの階層依存の行動の移動によって引き起こされる)、後で(ペアではなく)ペアのパラメトリックテストを実行するように動物にマークまたはラベルを付けます。正規性分布を評価し、特定の質問に応じて、ポストホック t検定または対応のある t検定を使用して分散分析(ANOVA)を実行して、異なるグループを比較します。不動時間の絶対値または正規化された値として解析を実行します。
      1. 絶対値:SEMで1日目から5日目までの不動時間の平均値と試験日±平均値を与える( 図1A参照)。1日目と5日目の平均値を比較し、好ましくは、対をなす t検定を使用して、抑うつ状態の誘導を検証する。1日目と5日目の間に有意差がある場合は、5日目の平均値を試験日の平均結果と比較します。1回の実験における典型的なグループサイズが6~10匹であることを確認し、野生型動物におけるベースラインと誘導後の不動時間の間に有意差があると予想する。異なるグループを不対応の t検定と比較することは、ベースラインの違いのために絶対値が使用されている場合、困難です。したがって、正規化された値を使用します。
      2. 相対値/正規化値: 正規化による異なる治療効果を5日目の個々の結果と比較し、5日目のパーセンテージで値を表します( 図1B参照)。
   5. 対照実験
      注: 水泳のパフォーマンスは、移動と相関している可能性があります。過運動を引き起こす物質は、偽陽性の結果(すなわち、不動時間の減少)を誘発する可能性がある。鎮静剤と同様に、人為的に不動時間を増加させることができる。
      1. 水泳解析を実行する前に、未知の物質の移動の変化を評価します。オープンフィールドテスト(OFT)を別の動物群で少なくとも10分間使用してください。
      2. CDMと同じ観測時間(10分)をOFTで選択して、高い有効性を有する不動時間の測定を介してCDMの読み出しに影響を与える可能性のある試験化合物の非特異的ハイパー機関車効果を検出する。
      3. ハイパーロコモティブ効果が著しい場合は、抗うつ力を評価するために水泳セッションを評価せず、異なる読み出し方法(例えば、スクロース嗜好、尾部サスペンション試験など)を使用してください。

4. 抑うつ状態の発症の評価

1. 抑うつ障害の発症を評価するために、誘導期の各日を評価し、不動時間を測定する。
   注:この場合、毎日の間の不動時間のわずかな増加は回復力を表しますが、未治療または野生型の動物と比較してより強く、より早い増加は、ストレス誘発性の絶望に対する脆弱性の増強を表します。水泳イベントの前にマウスを治療することによって、予防的介入またはトランスジェニックマウス系統を、行動的絶望の発症に関して評価することができた。

CDMの誘導期の最初のスイムセッションでは、マウスは通常、190秒から230秒の間の平均不動時間を示し、これは追加のスイムセッションごとに絶えず上昇する(図1A)。この増加は最初の3日間でより顕著であり、最後の2〜3日間にプラトー様相に達する。5日目に測定された不動時間は、最大4週間にわたって安定しており、安定した行動的絶望を示している。介入の抗うつ薬効力は、誘導期の最終日から試験日までの間に動物を治療することによって評価することができる。水泳セッション中の絶対採点時間は非常に主観的であり、実験者、年齢、性別、および使用されるマウスラインに依存することに注意してください。ただし、セッション間の相対的な違いは、わずかなインターレーターの違いでかなり安定しています。

図1には、いくつかの代表的な処置が示されている。イミプラミン、睡眠不足、およびケタミンは不動時間を有意に減少させたが、睡眠不足は回復睡眠と組み合わせ、抑うつ様表現型の有意な変化を示さなかった。これらの結果は、適用された治療の抗うつ効力と一致し、ヒト患者で観察された効果に類似している。治療には、イミプラミン20mg/kg/日を飲料水で3週間摂取し、試験の24時間前に腹腔内注射で3mg/kgのケタミンを3mg/kg、試験前に6時間の睡眠不足をとっていた。

研究課題に応じて、様々な表現が表示される場合があります。絶対値の表現は、実際のデータの概要を示し、誘導相と単一の治療の良好な評価を可能にします(図1A、D)。しかし、さまざまな治療法の違いを直接比較することはできません。したがって、各治療群は、5日目の不動時間の平均値が異なる。したがって、この場合、正規化された平均値の表現を使用することをお勧めします(図1B)。スペースの制限により、縮小された表現が選択される場合があります(図1C)。少なくとも1日目、5日目、およびテスト日の結果を表示することが必須であることに注意してください。

図 1: 成功すると、絶対値と正規化された値が得られます。 (a)30匹のマウスにおいてうつ病様状態の誘導の成功が観察できる。各ドットは、特定の日の1匹の動物の不動時間を表し、バーは、試験動物の平均値を表す。不動時間は、誘導段階の各日(1日目〜5日目)および試験日(点線の後)について、処置の有無にかかわらず表される。このサンプルでは、1日目から2日目の間に有意な増加が観察されることに注意してください。場合によっては、有意水準は1日目から3日目の間に最初に達成されます。実験の継続では、1日目から5日目の間に統計的に有意な増加が必須です。典型的な天井効果に注意してください(4日目と5日目の差と比較して、1日目、2日目、3日目の間に増加します)。5日目から試験日の間に、動物を、さらなる処置(CDM)なしで、またはイミプラミン(Imip.)で処置するかのいずれかで、自宅のケージに4週間飼育した。睡眠不足(SD);睡眠不足および回復睡眠(RS)、およびケタミン(Ket)。(b)個々の動物のパフォーマンスの例示的な時間経過が毎日与えられる。(c)図1Aに既に示した同じ結果の正規化表現。各動物および1日の不動時間を、5日目の対応する不動時間に正規化し、パーセンテージで表した。異なる群の後処理値は、このアプローチを使用してよりよく表示および比較することができる。(D)1日目、5日目、および試験日(CDM)の正規化された値の表現。概念実証研究が成功した後、評価タイムポイントは1日目、5日目、およびテスト日に短縮することができます。これらの時点が必要なのは、誘導の成功を実証するためには1日目から5日目の間の有意な増加が必要であり、治療有効性に関する声明を出すために5日目を試験日と比較する必要があるためです。(e)3つの異なるマウス系統の不動時間の比較:Wildtype(WT)は誘導の成功を示す;例示的な回復力線(RL)は、最初の3日間および試験日に有意に減少したうつ病様行動を示す。ボンフェローニポストホックテストによる一元配置分散分析: ∗/#p < 0.05, ∗∗/##p < 0.01, ∗∗∗/###p < 0.001, ∗∗∗∗/####p < 0.0001.(#1日目の平均値との差を示し、∗図1A、Cの5日目の平均値との差を示し、図1EのWTマウスラインを示す)。データはSEM±手段として表されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5日間すべてにわたって不動時間が変化しなかった場合(図2)、加えられたストレスは関連する行動を変えることができず、治療効果を評価することはできませんでした。動物は犠牲にする必要があり、それ以上使用してはなりません。

図 2: 失敗した結果 効果のない誘導の表現を図に示します。1日目から5日目の間に不動時間の有意な増加は起こらないことに留意されたい。したがって、実験を継続するための基準は達成されず、それ以上の延長は合理的ではない(この場合、雄マウスのみが試験され、遡及的調査の後、彼らは同腹仔ではないことが判明した)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

動物の行動的絶望のより広い視野を記述するために、さらなる読み上げ方法を使用しなければならない。さまざまな行動テスト、電気生理学的測定、およびストレス誘発性変化の分子評価が利用可能です。CDM、イミプラミンおよびケタミン処理、ノーズポーク-スクロース嗜好試験(NPSPT)、およびパッチクランプ技術を用いた長期増強の評価によるテールサスペンション試験(TST)の例示的な結果を図3に示す。これらの結果は、CDM誘導相を行動的絶望の誘導のための一般的なツールとして使用することを奨励する。使用される技術(TST、NPSPT、LTP-評価)のさらなる詳細については、9、10、17、20を参照されたい。

図3:CDMマウスによる追加結果。 (A) 尾懸垂試験におけるCDMの効果の例示的な表現。マウスは尾部によって吊り下げられ、不動で過ごした時間が記録された(方法論的詳細は9参照)。各ドットは、単一の動物の不動時間を表し、バーは、試験動物の平均値を表す。ボンフェローニ ポストホック 検定による一元配置分散分析: ∗∗∗p < 0.001.(B)CDMマウスにおける最近確立された鼻ポークスクロース嗜好試験の代表的な結果。±このタスクにおいて、スクロース嗜好は、スクロースボトルに到達するまでの努力(鼻突の数)を徐々に増加させて測定した(方法論的詳細については、10を参照されたい)。なお、CDMではスクロース嗜好が低下しており、CDMと対照マウスとの差は、甘味液を飲むために適用しなければならなかった(Nspk1-7と示す各日の鼻突きの平均値)努力とともに徐々に増加する。ボンフェローニ ポストホック テストによる二元配置分散分析: ∗∗p < 0.01、 ∗∗∗p < 0.001。(C)長期シナプス可塑性±CDM依存性変化は、WTマウスの海馬脳スライスにおける連想LTP誘導プロトコルの適用後のEPSPの平均値の変化として提示される。データは、CA3−CA1シナプスの刺激によって得られた(詳細は17、20参照)。非対応 の t 検定 (∗∗p < 0.01) のデータは SEM ±平均として表されます 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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