ネズミ肺動脈弁の相関画像化のための手術とサンプル処理

Summary

ここでは、マウス肺動脈弁の切除、加圧、固定、画像化のための相関ワークフローを説明し、総立体構造および局所細胞外マトリックス構造を決定する。

Abstract

心臓弁関連疾患(HVD)の根本的な原因は、とらえどころがありません。マウス動物モデルはHVDを研究するための優れたツールを提供しますが、複数の長さのスケールにわたって構造と組織を正確に定量化するために必要な外科的および器械的専門知識は、その進歩を妨げている。この研究は、異なる長さのスケールで心臓弁を描写するためのマウス解剖、エンブロック染色、サンプル処理、および相関画像化手順の詳細な説明を提供する。静水圧経弁は、心臓弁の立体構造を化学的に固定することによって時間的不均一性を制御するために使用された。マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)を使用して、心臓弁の形状を確認し、シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)に必要な下流サンプル処理の基準を提供しました。細胞外マトリックス(ECM)の高解像度シリアルSEM画像を撮影し、再構成して組織のローカル3D表現を提供した。μCTおよびSBF-SEMイメージング法を相関させ、肺動脈弁全体の空間変動を克服した。提示された作業は肺動脈弁に関するものですが、この方法論は、生物学的システムにおける階層的組織を記述するために採用することができ、複数の長さのスケールにわたる構造的特徴付けにとって極めて重要です。

Introduction

肺弁(PV)は、右心室と肺動脈との間の単方向血流を確保するのに役立つ。肺動脈弁奇形は、先天性心疾患のいくつかの形態に関連付けられている。先天性心弁疾患(HVD)の現在の治療法は弁膜修復または弁置換であり、患者の生涯を通じて複数の侵襲的手術を必要とすることができる^1。心臓弁の機能はその構造に由来することが広く受け入れられており、構造機能相関と呼ばれることが多い。より具体的には、心臓の幾何学的および生体力学的特性がその機能を決定する。機械的特性は、ECMの構成および構成によって決定されます。マウス心臓弁の生体力学的特性を決定する方法を開発することにより、トランスジェニック動物モデルは、心臓弁機能および機能不全^{2、3、4、5}におけるECMの役割を問い込むために使用することができる。

マウス動物モデルは、トランスジェニックモデルが他の種と比較してマウスでより容易に入手可能であるため、長い間分子研究の標準と見なされてきました。マウストランスジェニックモデルは、心臓弁関連疾患⁶を研究するための汎用性の高いプラットフォームを提供します。しかし、幾何学とECM組織の両方を特徴付けるための外科的専門知識と計測要件は、HVD研究を進める上で大きなハードルとなっています。文献中のHstologicalデータは、マウス心臓弁細胞外マトリックス含有量に画像を提供するが、2D画像の形でのみ、その3Dアーキテクチャ^7、8を記述することができない。さらに、心臓弁は空間的にも時間的にも異種であり、サンプリングと立体構造が固定されていない場合、ECM組織に関する実験全体で結論を出すのは困難です。MRIや3D心エコー検査などの従来の3D特性解析法は、ECM成分^9,10の解決に必要な解像度を提供していない。

この研究は、心周期による時間的不均一性が、マウスPVの立体構造を静水圧横切り圧力で固定することによって対処された完全に相関的なワークフローを詳述する。空間的な異質性は、対象領域をサンプリングし、異なるイメージングモダリティ、特にμCTおよびシリアルブロック顔走査電子顕微鏡のデータセットを異なる長さのスケールにわたって登録することによって正確に制御されました。下流サンプリングを導くμCTによるスカウトのこの方法は以前に提案されてきたが、肺弁は時間的変動を示すため、外科レベル¹¹でさらなる制御が必要であった。

マウス心臓弁バイオメカニクスを記述するインビボ研究はまばらであり、代わりに変形挙動を記述する際に計算モデルに依存する。ナノメートルの長さのスケールの局所的な細胞外データが心臓弁の幾何学的形状および位置に関連していることは非常に重要である。これは、順番に、既存の生体機械心臓弁モデル^12、13、14を補強するために使用することができる機械的に寄与するECMタンパク質の定量化可能な^、空間的にマッピングされた分布^を提供する。

Protocol

本研究における動物の使用は、全国小児病院の施設動物ケアおよび使用委員会に従って、プロトコルAR13-00030の下で行われた。

1. 肺動脈弁切除

1. マウスの解剖に必要なツールをオートクレーブします。これには、細かいはさみ、マイクロ鉗子、マイクロ血管クランプ、クランプ適用鉗子、マイクロニードルホルダー、スプリングハサミ、およびリトラクターが含まれます。
2. 手術前に最低2週間、すべてのマウスを順応させる。C57BL/6マウスをケージから約1歳で取り出し、体重を量り、ケタミン/キシラジンカクテル(3:1ケタミン:キシラジン、1gあたり0.01 mL)過剰摂取で安楽死させる。
3. マウスをトレイの後面リカンス位置に置き、手足をテープで固定します。一度確保したら、回術を行う。
   1. 余分な脂肪組織と筋膜を取り除くことによって心臓を露出させる。
   2. 右心房を取り除き、室温生理食水(0.9%NaCl)で左心室を通して浸透する。灌流は30秒にわたって約20mLを取る必要があります。これにより、マウスが消滅します。
4. 上の大静脈、下の大静脈、肺動脈、大動脈を切断することによって心臓全体を除去する。肺動脈には特別な注意が必要です。これは加圧のための導管として役立つため、心室動脈接合部の上に約2mmをカットします。
5. 左右の心室を取り外し、チャンバーを大気圧にさらします。肺幹の構造が心室の除去によって影響を受けないようにしてください。

2. 肺動脈弁の圧力固定

1. 肺動脈を有する吻合加圧チューブは、リーフレットおよび肺幹の大きな動きに対応するために、中管接合部と管の端部との間に約1mmの距離を残す。
2. 貯水池を類似の生理学的圧力に引き上げ、生理食塩水で満たします。フロースルーシステムをテストして、閉塞や気泡がないことを確認します。
3. 吸着した肺動脈弁にストップコックを取り付け、流出路を切り替えてチューブを通る十分な流れを確保します(すなわち、気泡なし)。流れが十分になったら、流出を吻合肺弁に切り替え、肺幹の加圧を確実にする。これは、肺幹の膨張によって識別される。
4. 肺幹の加圧が確認されると、生理食音溶液がパージされるまで、一次固定液(1.25%グルタルアルデヒド、0.15Mカコジレートで1.0%パラホルムアルデヒド)を徐々に組み込みます。これは、生理液の貯蔵容量の約25%の部分を取り除き、それを一次固定液に置き換えることによって行われます。
   注意:使用される固定剤(パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド)は非常に有毒であり、適切な個人用保護具(PPE)は安全を確保するために着用する必要があります。
5. 乾燥を防ぐために、組織サンプルの上に固定剤浸しガーゼを置きます。
6. 固定剤を3時間浸透し、必要に応じてリサーバを補充して一定の圧力を維持します。固定を通して、化学的な固定のために肺弁が縮小することは珍しくありません。この場合、生理的圧力を維持するために一次固定剤で常に貯蔵所を補充する。
7. 使用するまで4°Cの固定液に心臓弁を保管してください。サンプルは、識別可能な違いなしに最大1週間保存されました。

3. Enブロックサンプル染色と埋め込み^15,16

注意:このセクションで使用される染色試薬(フェロシア化カリウム、四酸化オスミウム、チオカルボヒドラジド、アスパラギン酸鉛、酢酸ウラニル)は非常に有毒であり、細心の注意を払って取り扱う必要があります。ヒュームフードと適切なPPEの使用をお勧めします。

1. 染色
   1. 固定心臓弁サンプルを0.15Mカコジレートバッファーで5分間洗浄します。さらに2回洗い流します。
   2. 1.5%のフェロシアン化カリウム、0.15 Mカコチル酸塩、2mM塩化カルシウム、2%オスミウム四酸化オスミウムを1時間氷上に完全に沈めます。
   3. サンプルがインキュベートしている間に、tCHの0.1 gをddH₂Oの10 mLに溶解してチオカルボヒドラジド(TCH)溶液を調製し、60°Cのオーブンに1時間置きます。TCHが完全に溶解していることを確認するために定期的に静かに攪拌します。使用直前に0.22 μmのシリンジフィルターで溶液をフィルターします。
   4. 試料をddH₂Oのチューブに5分間入れて室温ddH₂Oで洗浄し、容器を振って少し撹拌します。この処理を 3 回繰り返します。
   5. 濾過されたTCH溶液に室温で20分間入れる。洗浄工程を3回(各5分)、ステップ3.1.4に記載した室温_ddH2Oで行う。
   6. 一度完了したら、室温で30分間、2%オスミウム四酸化2%にサンプルを入れ。その後、室温ddH₂Oで5分間合計3回洗浄します。
   7. 試料を4°Cで一晩1%酢酸ウラニル中にインキュベートする。
   8. この間、アスパラギン酸ストック溶液の10 mLに0.066 gの硝酸鉛の溶液を作ります。pHを1 N KOHで5.5に調整します。60°Cのオーブンに溶液を入れ、硝酸鉛を溶解します。
   9. 一晩インキュベーションした後、ステップ3.1.4に記載されたように洗浄工程を行う。3 回繰り返します。次いで、ステップ3.1.8から第3.1.8から30分間の60°Cオーブンで心臓弁組織をインキュベートする。
2. 脱水
   1. ddH₂O.を3回繰り返して、室温で5分間組織を洗浄します。
   2. ddH₂Oで20%、50%、70%、90%、100%エタノールの新鮮な溶液を作ります。
   3. 心臓弁組織を脱水する。20%、50%、70%、および90%エタノールを氷上で5分間処理します。その後、氷上で100%エタノールを5分間処理します。
   4. 組織を氷冷アセトンに10分間移動します。その後、室温で新鮮なアセトンを10分間入れます。
3. 埋め込み
   1. メーカーの仕様に従って樹脂混合物( 材料表を参照)を製造する:A成分11.4g、成分Bの10g、成分Cの0.3g、および0.05-0.1 g成分Dの。最初は、各成分を60°Cに加熱してから、成分CとDを加えて、部品AとBを混合します。混合物は、コンポーネントCとDを追加すると、琥珀色に変わります。適切に混合すると均一になります。
   2. 25:75、50:50、75:25樹脂:アセトンの体積比で混合物を作ります。よく混ぜます。
   3. 25:75、50:50、および75:25樹脂の後続処理に組織を置く:アセトン混合物を室温で2時間ずつ混合します。
   4. 室温で一晩100%樹脂に組織を入れます。
   5. 翌日、室温で2時間、新鮮な100%樹脂に組織を入れる。
   6. 心臓弁組織を埋め込みカプセルに移し、新鮮な100%樹脂に置き換え、60°Cのオーブンに48時間置いて治します。
4. 以下に示すように、相関イメージングを行います。

4. マイクロコンピュータ断層撮影

1. 樹脂サンプルブロックを接着剤でμCTサンプルホルダーに取り付けます(接着剤または両面テープがうまく機能します)。
2. ホルダーをμCTチャンバーに入れ、ホルダーの動きが生じなるようにコレットをねじ込んでステージに固定します。スキャン中のサンプルの動きは、画質を低下させます。
3. アイコンをダブルクリックして、μCTユーザーインターフェースを開きます。プロジェクトを追加するには、[プロジェクト] の横にある [+] 記号を選択 し、必要なフィールドに入力します。
4. 作成したプロジェクトを見つけ、クリックして選択します。これにより、2 番目の列の取得が開きます。[取得]の横にある[+]を選択し、必要なフィールドに入力します。
5. チャンバーのドアを閉じて、フロントパネルまたはμCTのアームボタンを押してシステムをアーム します。
   メモ:システムは、正常なウォームアップ手順に従って自動的にX線をオフにします。ボタンを選択して、X 線をオンにします。
6. サンプルの回転の中心がモニターの中心からずれないようにステージの回転を調整します(つまり、サンプルはスキャン全体の視野内にあります)。この実験に使用するシステムでは、以下の説明に従って、ドロップダウンタブの下で関心領域(ROI)ステージを調整します。
   1. 回転角度を 0°に設定し、サンプルのエッジをマーキングすることで ROI ステージの調整を行います。サンプルは180°に回転し、サンプルのエッジが再びマークされます。
   2. ROI ステージの X 軸の位置を調整して、サンプルのエッジがこれら 2 つの極端な間になるようにします。90°、270°の回転角度で、このプロセスを繰り返します。
   3. サンプルの回転によってエッジが視野外に移動する場合、サンプルのエッジが上記の設定角度で見え、粗いROIステージ調整が可能になるまで、μCTの必要度の拡大を減らします。
   4. 一旦下の倍率で調整したら、サンプルまたは検出器を動かして倍率を上げ、ROI位置を微調整することができます。
      注: このプロセスは、整列を確実にするために繰り返す必要があります。適切な位置合わせにより、すべてのサンプル回転角度を通して水平方向の動きがほとんどまたはまったく表示されていないサンプルが作成されます。
7. メーカーのソフトウェアを使用して、μCTを必要なスキャンパラメータに調整します。これらのパラメータには、チューブ電位、チューブ電流、検出器距離、サンプル距離、露光時間、軌道、および投影数が含まれます(この研究で使用されるμCT取得パラメータについては 表S1 を参照)。
   注: 明確なフィールドスキャンや暗いフィールドスキャンなどの校正パラメータは、特に明記されていない限り、製造元の仕様に従って保持する必要があります。たとえば、サンプルが大きすぎて、システムがフィールドビューからサンプルを移動できない場合、クリアフィールドキャリブレーションスキャンを実行するためにサンプルを削除する必要があります。
8. パラメータを設定すると、[ 時間推定 ]ボタンを押すと、スキャンの継続時間の近似が表示されます。 [開始 ]ボタンを選択して、スキャンを開始します。
9. スキャン完了後、X線がオフになっていることを確認し、コレットを緩めて、サンプルをμCTチャンバから慎重に取り外します。

5. サンプル処理と画像相関

1. メーカーが提供するソフトウェアを使用して、フィルター処理されたバックプロジェクションアルゴリズムを使用してμCT投影を再構築します( 資料表を参照)。
   1. 画面の上部にある [偵察 ]タブを選択します。[ プロジェクト と取得] タブ を 選択します。
   2. フィルタ後方投影に関連付ける偵察テンプレートを選択します。 [偵察の開始 ]ボタンを押します。
2. 画像処理ソフトウェアを使用して肺弁を識別し、セグメント化します。これには、肺動脈弁¹⁷の解剖学に関する事前の知識が必要である。高い動脈圧では、リーフレットは肺動脈弁の内腔を凝らして遮断する。
3. スキャン方向とサンプルに対するスライスの向きを特定します。スライス方向が目的の軸に揃うようにサンプルの方向を変更します。
4. 高解像度イメージングの対象領域を特定します。今回の実験では、リーフレットの腹(中央)と動脈弁膜接合部を選んだ。
5. 材料の大きな部分のためのカミソリの刃またはサンディング、またはより細かい部分のためのミクロトームによって余分な樹脂およびサンプルを取り除く。
6. 目的の場所に位置したら、物理標本と仮想μCTスライスを比較して位置を確認します。これは、断面で解剖学的特徴を比較することによって行われました。

6. シリアルブロック顔走査電子顕微鏡¹⁸

1. 試料の断面を小さくして、SBF-SEM(約2.0 x 1.5 x 1.8 mm)を収容します。
2. エポキシを使用して、トリミングされたサンプルをSBF-SEMアルミニウムスタブに取り付ける。
3. 35 nmゴールドで試料ブロックをコーティングします。プラットフォーム上でサンプルを回転して、均一なコーティング層を適用します。
4. SBF-SEMチャンバーを通して、マイクロスコープのユーセント高さにナイフブレードの高さを調整します。
5. サンプルを挿入し、サンプルスタブをレベル付けします。
6. 充電を防止する低真空条件下の画像と後方散乱検出器(SBF-SEM取得パラメータについては 表S2 を参照)。
7. 自動ソフトウェアを使用して、異なる倍率で関心のある複数の領域を画像化およびステッチします( 資料表を参照)。

Results

加圧チューブに対する肺動脈の吻合は図1Aに示されている。静水圧の適用に続いて、肺幹は放射状に膨張する(図1B)肺弁リーフレットが閉じた構成であることを示す。μCTにより肺弁立体構造が確認された。この場合、リーフレットはcoapt(閉じた)、環状円状であった(図2A)。図2B,Cは、固定(図2B)または動脈崩壊のいずれかによる不十分な肺弁加圧の程度を様々に示す(図2C)。

サンプルブロックトリミングはμCTボリュームレンダリングによって導かれました。この場合、sino-管状接合部に平行な平面をスライス方向として選択した。解剖学的ランドマークを用いて、μCTボリュームレンダリング仮想断面は、光画像(...

Discussion

心室の除去は2つの目的を果たす。まず、心室側を大気圧に曝し、それにより肺弁の動脈側から経弁圧を閉じるだけで、第2に、肺幹のねじれを防止する安定した塩基を提供する。加圧中、肺幹は放射状に劣って膨張し、ねじれやすく、肺幹の崩壊を引き起こす。肺弁に生理液をプリロードすると、加圧が適切であり、システムに漏れがあるかどうかの確認が追加で確認できます。一次固定剤の作用は、数秒の順序で迅速であり、生理液での静水性プリロードなしで、肺弁はランダムな立体構造に固定される。プリローディングがなければ、閉じた肺動脈弁の成功率は約10%〜20%であった。プリロードステップでは、成功率は90%を超えました。

μCTおよびSBF-SEMイメージングの条件は、このアプリケーションのために調整されました。肺弁は、完全に伸ばされると、厚さ10μm未満であることができる。経験則として、機能を解決するには 3 ボクセルのしきい値が必要です。そのため、μCTボリュームレンダリングは、8.4 x 8.4 x 6.3 mmの視野を持つ2.9 μmのボクセルサイズでスキャンされました。より小さなボクセルサイズはμCTで達成でき...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% グルタルアルデヒド (水溶液)	EMS	16210	一次固定成分
0.9% 塩化ナトリウム注射	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL シリンジ	BD	309659
10 mL シリンジ	BD	309604
200 プルーフ エタノール	EMS	15055
22G ニードル		BD 305156
3 mL シリンジ	BD	309657
3 ウェイ ストップコック	ミス メディカル ASD, Inc.
4% 四酸化オスミウム	EMS	19150	染色成分
4% パラホルムアルデヒド (aq)	EMS	157-4-100	一次固定成分
吸収性止血	エチコン	1961
アセトン	EMS	10012
ブラックポリアミドモノフィラメント縫合糸 10-0	AROSurgical instruments Corporation
ブラックポリアミドモノフィラメント縫合糸、6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	約 1 yo
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	10043-52-4
鉗子を適用するクランプ	FST	00072-14
コットンチップアプリケーター	フィッシャーサイエンティフィック	23-400-118
DPBS	ギブコ	14190-144
デュモン #5 鉗子	FST	11251-20
デュモン #5/45 鉗子	FST	11251-35
デュモン #7 細かい鉗子	FST	11274-20
デュルクパン ACM 樹脂	EMS	14040	埋め込み用
ファインシザー	FST	14028-10
ヘリスキャンマイクロCT	サーモフィッシャーサイエンティフィック		マイクロCT
ケタミン塩酸塩注射	ホスピーラ	NDC 0409-2053
L-アスパラギン酸	Sigma-Aldrich	56-84-8	染色成分
硝酸鉛	EMS	17900	染色成分
低真空後方散乱検出器	サーモフィッシャーサイエンティフィック	VSDBS	SEM 後方散乱検出器
マイクロアドソン鉗子	FST	11018-12
Millex-GP フィルター、0.22 um、PES 33mm、非滅菌EMD	ミリポア	SLGP033NS
不織布の歌	McKesson Corp.	94442000
ヘキサシアノフェレートカリウム(II) 三水和物	Sigma-Aldrich	14459-95-1	染色成分
水酸化カリウム	Sigma-Aldrich	1310-58-3
圧力モニターライン	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
生理食塩水(滅菌0.9%塩化ナトリウム)	株式会社ホスピーラ	NDC 0409-0138-22
サイズ3 BEEMカプセル	EMS	69910-01	埋込容器
カコジル酸ナトリウム三水和物	Sigma-Aldrich	6131-99-3	バッファー
ソリブリリトラクター	FST	17000-04
スパッタ・カーボン・電子ビームコーター	ライカ	EM ACE600	ゴールドコーター
手術顕微鏡	ライカ	M80
チオカルボヒドラジド (TCH)	EMS	21900	染色成分
ティッシュニードルホルダー/鉗子	Micrins	MI1540
トリマー	Wahl	9854-500
酢酸ウラニル	EMS	22400	染色成分
ボリュームスコープ 走査型電子顕微鏡	サーモフィッシャーサイエンティフィック	VOLUMESCOPESEM	シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡
キシラジン滅菌溶液	Akorn Inc.	NADA#139-236