本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。
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方法論記事
カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ABCトランスポーターの生化学的および生物物理学的特徴付けの成功は、異種発現系の選択に大きく依存する。過去20年間、私たちは多くの重要な真菌膜タンパク質を研究するために使用されてきた酵母膜タンパク質発現プラットフォームを開発しました。発現宿主 サッカロミセス・セレビシエ ADΔΔは、7つの主要な内因性ABC輸送体で削除され、ゲノム PDR5 遺伝子座の単一コピーとして安定的に統合された異種膜タンパク質遺伝子の構成過剰発現を可能にする機能獲得変異を有する転写因子Pdr1-3を含む。多目的なプラスミドベクターの作成とワンステップクローニング戦略の最適化により、迅速かつ正確なクローニング、突然変異誘発、および異種ABCトランスポーターの発現が可能になります。ここでは、新規プロテアーゼクレアブルmGFPHis二重タグ(すなわち、単量体酵母強化された緑色蛍光タンパク質yEGFP3を6ヒスチジンアフィニティー精製タグに融合)の開発と使用について説明し、目的のタンパク質とのタグの干渉を避け、ニッケル樹脂親和性への彼のタグの結合効率を高めるために設計された。mGFPHisを膜タンパク質ORF(オープンリーディングフレーム)に融合させることにより、ポリアクリルアミドゲルの検査や、mGFPHisタグを保持する分解物の検出により、タンパク質の定量が容易になります。この機能が膜タンパク質可溶化のための洗剤スクリーニングを促進する方法を示す。C末端にタグ付けされた カンジダ・アルビカンス 多剤流出トランスポーターCdr1の効率よく、迅速かつ信頼性の高い分離のためのプロトコルが 、S.cerevisiae ADΔで過剰発現して提示される。この小規模なプラズマ膜絶縁プロトコルは、1営業日以内に高品質の形質のプラズマ膜を生成します。血漿膜製剤は、Cdr1およびCdr1変異体変異体の酵素活性を決定するために使用することができる。
概要
その本来の脂質環境からのインテグラル膜タンパク質の抽出は、その構造と機能1、2、3、4に劇的に影響を与える可能性があります。生物学的膜5の複雑な脂質組成は、極めて重要なタンパク質と脂質相互作用が6に起こり得る。脂質は膜タンパク質の構造的完全性を維持し、膜コンパートメントの宛先7,8で正しく機能することを可能にする。したがって、膜タンパク質精製における重要な第一歩は、その構造および/または機能に影響を与えることなく、その天然環境からのタンパク質の抽出である。
膜タンパク質の構造を特徴付けるには多くの障害があり、そのほとんどが疎水性に関連しており、X線結晶学やクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)9、10、11、12に必要な量で適切に折り畳まれた機能性膜タンパク質
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プロトコル
1. 変換能力ADΔおよびADΔΔセルの新鮮または凍結されたストックの調製
- 2x YPCDの25 mLを接種する[すなわち、 2x YPD;2%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、4%(w/v)デキストロース、0.079%(w/v)CSM(完全なサプリメント混合物)を含む35 培地(o/n)を1回の酵母コロニーで16時間インキュベートし、1分間に200回転で16時間(rpm)で16時間インキュベートする。
- 25 mL o/n培養で2x YPCD培地の225 mLを接種し、600 nm(OD600)で細胞光学密度を確認する。OD600 は通常 0.5~1.0 です。
注: この段階で、次の変換実験に必要なすべての材料がすぐに利用できることを確認してください。 - 細胞密度が〜6-8のOD600に達するまで、200rpmで振盪してさらに〜6〜8時間30°C で培養を成長させます。
注: 特に明記されていない限り、以下の手順は室温(RT)で実行されます。 - 3,000 x g で遠心分離してこれらの対数相細胞を 3 分間収穫します。
- 細胞を再懸濁し、滅菌二重蒸留水(ddH2O;すなわち、200 mLと20 mL)でそれらを2回洗います。
- 3,000 x....
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結果
PYES2(図2B)でS.セレヴィシエADΔΔ(〜4 x104形質転換体/μg)の高周波変換が達成された。予想通り、無DNA(すなわち、ddH2 Oのみ)制御は形質転換体を与えず、かつ1μgの線形CDR1-mGFPHis変換カセット(図1A)は、最適化されたADΔΔ変換プロトコルで〜50個の変換剤(図2C)を与えた。CDR1-mGFPHis形質転換体はまた、欠陥のあるミトコンドリアを有する可能性のある小柄変異体を排除するために、非発酵性炭素源で成長する能力について試験された。3つ(黄色の円;図2D)試験した25のウラシル-プロトトロフ形質転換体のうち、YPG寒天プレート上では成長せず、さらなる調査から廃棄された。新たに作成された株ADΔΔ-CDR1-mGFPHisによっ.......
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ディスカッション
膜タンパク質の構造解析の最近の進歩にもかかわらず、Cdr1または他のPDRトランスポーターの3D構造は現在利用できません。したがって、Cdr1構造とその生化学的特徴に関する知識を得ることは重要であり、流出媒介性を克服するための新薬の合理的な設計に関する洞察を提供するだけでなく、ABCタンパク質の重要なサブファミリーの機能のメカニズムにも洞察を提供する。
膜タンパク質の構造特性評価の主な要件の1つは、X線結晶学またはクライオEMに必要な量の正しく折り畳まれた無傷の膜タンパク質の発現です。発現系を選択する際の重要な基準は、使いやすさ、成長速度およびコスト、およびタンパク質61,62の機能および/または安定性にとって重要な翻訳後修飾を有するタンパク質を発現する能力である。
過去20年間にわたり、S.セレビシエ膜タンパク質発現技術60は、様々な親和性、エ.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者らは、ニュージーランド・マースデン基金(グラントUOO1305)からの資金援助と、タイのバンコクにあるチュラロンコン大学医学部からのブロック補助金(M.Niimi)を感謝しています。彼らは、G.マダニに博士課程の奨学金を提供してくれたオタゴ大学に感謝したいと考えています。著者らはまた、ステファン・ラウンサー教授と同僚のアミール・アペルバウム博士とデイヴァナヤガバラシー・ヴィナヤガム博士が、ドイツのマックス・プランク分子生理学研究所(MPIMP)で6ヶ月間のG.マダニ訪問の支援と監督に感謝したいと考えている。著者らはまた、MpIMPを訪問するための研究助成金(57381332)をG.マダニに提供してくれたドイツ学術交流サービス(DAAD)に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-(N-モルホリノ)エタン-スルホン酸 (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| 2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール (トリス塩基;超高純度) | メルク | 77-86-1 | |
| 2,2-ジデシルプロパン-1,3-ビス-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | NG310S | LMNG |
| 2,2-ジヘキシルプロパン-1,3-ビス-&β;-D-グルコピラノシド | アナトレース | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
| 2,2-ジオクチルプロパン-1,3-ビス-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | NG322S | DMNG |
| 4-トランス-(4-トランス-プロピルシクロヘキシル)-シクロヘキシル &α;-D-マルトピラノシド | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-&α;-M |
| 40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド (37.5:1) | バイオ・ラッド | 1610148 | |
| 酢酸 (氷) | メルク | 64-19-7 | |
| 寒天 | 培地& | nbsp;009002-18-0 | |
| モリブデン酸アンモニウム | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
| 過硫酸アンモニウム (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| ATP 二ナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | A-6419 | |
| ブロモフェノールブルー | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | |
| CHAPSO | アナトレース | C317S | |
| CSM | フォーミディア | DCS0019 | |
| CSMマイナスウラシル | フォーミディア | ムDCS0161 | |
| シクロヘキシル-1-ブチル-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | C324S | CYMAL-4 |
| シクロヘキシル-1-ヘプチル-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | C327S | CYMAL-7 |
| シクロヘキシル-メチル-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | C321S | CYMAL-1 |
| ジジトニン | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
| ジチオスレイトール (DTT) | ロシュ・ダイアグノスティック | 10197785103 | |
| DMSO | メルク | 67-68-5 | |
| エタノール | メルク | 459836 | |
| エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 (EDTA;Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | Applied Biosystems | 78205 | エキソヌクレアーゼとホスファターゼのブレンド |
| Glucose | Formedium | 50-99-7 | |
| Glycerol | Merck | 56-81-5 | |
| Glycine | Merck G8898 | ||
| HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
| 塩酸 | メルク | 1003172510 | |
| KOD Fx ネオ | 東洋紡 | KFX-201 | 信頼性の高いコロニーPCRに使用 |
| 酢酸リチウム(LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
| 塩化マグネシウム ヘキサハイドレート | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES | Formedium | 145224-94-8 | |
| n-デカノイル-N-ヒドロキシエチルグルカミド | アナトレース | H110S | HEGA-10 |
| n-デカノイル-N-メチル-グルカミド | アナトレース | M320S | MEGA-10 |
| n-デシル-ホスホコリン | アナトレース | F304S | フォスコリン-10 |
| n-デシル-&ベータ;-D-マルトピラノシド | アナトレース | D322S | DM |
| n-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸 | アナトレース | AZ312S | アンゼルジェント3-12 |
| n-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド | アナトレース | D360S | LDAO |
| n-ドデシル-&α;-D-マルトピラノシド | アナトレース | D310HA | および-DDM |
| n-ドデシル-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | D310S | &β;- |
| DDM n-ノニル-&β;-D-グルコピラノシド | アナトレース | N324S | NG |
| n-ノニル-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | N330S | NM |
| n-オクタデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸 | アナトレース | AZ318S | アンゼルジェント 3-18 |
| n-オクチル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸 | アナトレース | AZ308S | アンゼルジェント 3-8 |
| n-オクチル-ホスホコリン | アナトレース | F300Sフォ | ス-コリン-8 |
| n-オクチル-&β;-D-グルコピラノシド | アナトレース | O311S | OG |
| n-テトラデシル-ホスホコリン | アナトレース | F312S | フォス-コリン-14 |
| n-テトラデシル-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | T315S | TDM |
| n-トリデシル-ホスホコリン | アナトレース | F310S | フォス-コリン-13 |
| n-トリデシル-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | T323S-n | |
| -ウンデシル-&β;-D-マルトピラノシド | アナトレース | U300S | UM (UDM) |
| N,N,N',N'-テトラメチル-エチレンジアミン (TEMED) | シグマ-アルドリッチ | T9281 | |
| オクチルフェノキシポリエトキシエタノール | シグマ-アルドリッチ | 9002-93-1 | トリトン X-100 |
| オリゴマイシン | シグマ-アルドリッチ | 75351 | |
| ペプトン | フォーミディア | 3049-73-7 | |
| フェニルメチルスルホニル フッ化物 (PMSF) | ロシュ ダイアグノスティック | 329-98-6 | |
| Phusion ホットスタート Flex DNA ポリメラーゼ | New England Biolabs | M0535S | ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ |
| ポリエチレングリコール (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
| ポリオキシエチレンソルビタンモノオレア酸 | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
| 硝酸カリウム | Sigma-Aldrich | P8394 | |
| タンパク質アッセイキット | バイオ・ラッド | 5000122 | RC DC プロテインアッセイキット II |
| QC コロイド Coomassie Stain | Bio-Rad | 1610803 | |
| Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) | アブカム | AB116028 | |
| アジ化ナトリウム | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
| L-アスコルビン酸ナトリウム BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
| ショ糖モノドデカン酸 | アナトレース | S350S | DDS |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| 酵母抽出物 | Formedium | 008013-01-2 | |
| なし酵母窒素塩基 | Formedium | CYN0402 | |
| 装置(タイプ) | |||
| 遠心分離機 (エッペンドルフ5804) | Eppendorf | ||
| Centrifuge (Beckman Ultra) | Beckman | ||
| Centrifuge (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
| FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system with a fluorescence detector, an autosampler, a Pillarator) | Bio-Rad | ||
| Gel imaging (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
| マイクロプレートリーダー (Synergy 2 Multi-Detection) | BioTek Instruments | ||
| PCR サーマルサイクラー (C1000 Touch) | バイオ・ラッド | ||
| 電源 (PowerPac) | Bio-Rad | ||
| SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | バイオ・ラッド | ||
| シェーキングインキュベーター (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GEヘルスケアライフサイエンス | GE17-5172-01 | |
| UV/可視分光光度計(Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd |
参考文献
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or compl....
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