カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製

その本来の脂質環境からのインテグラル膜タンパク質の抽出は、その構造と機能^{1、2、3、4}に劇的に影響を与える^{可能性があります}。生物学的膜⁵の複雑な脂質組成は、極めて重要なタンパク質と脂質相互作用が⁶に起こり得る。脂質は膜タンパク質の構造的完全性を維持し、膜コンパートメントの宛先^7,8で正しく機能することを可能^にする。したがって、膜タンパク質精製における重要な第一歩は、その構造および/または機能に影響を与えることなく、その天然環境からのタンパク質の抽出である。

膜タンパク質の構造を特徴付けるには多くの障害があり、そのほとんどが疎水性に関連しており、X線結晶学やクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)9、10、11、12に必要な量で適切に折り畳まれた機能性膜タンパク質を発現しにくい。膜タンパク質発現系には、相同9、異種^{13、14、15、}およびインビトロ発現系^16,17の3種類があります。多くの発現系の発現レベル、または非常に低いコストは、膜タンパク質を産生するための好ましい選択肢として少数の宿主しか残さない。それらは、細菌宿主、大腸菌、酵母S.セレビシエおよびピキアパストリス、およびSf9昆虫細胞または哺乳動物細胞株¹⁸のような高等の真核生物を含む。すべての膜タンパク質発現技術には長所と短所があります。しかし、S.セレビシエは、おそらく膜タンパク質産生に適した最も研究された真核生物である。遺伝子工学、創薬、合成生物学、真核細胞膜タンパク質14、19、20、21の発現の用途で非常^に汎用性が高い。

本研究では、特許取得済みのS.セレビシエ膜タンパク発現技術²¹を使用し、S.セレビシエ^ADΔ14および^ADΔ2を好ましい宿主として(図1A)、主要なC.アルビカンス多剤流出ポンプCdr1を過剰発現および研究した。S.セレビシエ株はいずれも、ウラ3(ADΔ)またはura3およびhis1(ADΔ)遺伝子の両方を有するAD1-8u-23の誘導体であり、URA3またはHIS1ゲノム座遺伝子で望ましくない統合を通じて生じる偽陽性ウラシルまたはヒスチジン原発性形質転換体を排除するために削除される。 図1Aに示されている7つの主要な多剤流出ポンプ²³の欠失は、ADΔΔを最も異種生物に絶妙に敏感にする。機能の得る変異型転写因子Pdr1-3は、2つの相同性の変異体を介して、異種-ORF含有変換カセット(図1A)の異種-ORF含有変換カセット(図1A)を統合した後、Cdr1(図1Aの赤い八角形)のような異種膜タンパク質の構成過剰発現を引き起こす。C末端mGFPの適切な原形質膜局在化タグ付きタンパク質は共焦点顕微鏡(図1A)によって確認することができ、Hisタグはタグ付きタンパク質のニッケル親和性精製に使用することができる。いくつかの真菌性ABCトランスポーター(例えば、カンジダ・クルセイABC1)をpABC3由来プラスミドにクローニングすることは、細胞毒性のために大腸菌に伝播することができなかったため不可能であった。これにより、膜タンパク質^14、24のワンステップクローニングの開発を促し^、様々な親和性、エピトープ、またはレポータータグをS.cerevisiae ADΔに直接タグ付けしたN末端またはC末端のいずれかでタグ付けされた(図1C)。S.セレビシエ種々のCDR1変異体を過剰発現するADΔ株も、25bpで重複する最大5個の個別PCR断片を用いることで効率的に作成することができる(図1C)。このプロトコルを採用することで、対象となる多くのORFを、非常に短い期間内で低コストで高効率でクローン化、表現、および特徴付けることができます。変換効率は、PCRフラグメントを追加するたびに〜2倍にしか減少しません。 

必要であれば、発現レベルは、通常高い構成式レベル²⁵の0.1%~50%の間の任意の場所まで予測可能に発現レベルを調整するために、プライマー設計によって容易に操作することもできる。最適化された多機能pABC3¹⁴誘導クローニングベクター、pABC3-XLmGFPHis²⁶⁽図1B)にはHRV-3Cプロテアーゼ切断部位(X;レフフ|GP)、頻繁に使用されるタバコエッチウイルス(TEV)プロテア^ーゼ27よりも4°Cで優れたパフォーマンスを発揮するプロテアーゼである。Lは5アミノ酸(GSGGS)リンカーであり、mGFPは、単量体変異体(A206K)28、29バージョンの酵母強化された緑色蛍光タンパク質変異体yEGFP3³⁰であり、Hisは3つのアミノ酸リンカー(GGS)であり、続いて6-ヒスチジン(HHHHHH)ニッケル親和性タンパク質精製タグである。

この発現技術は、創薬や膜タンパク質の研究に成功しています。真菌アゾール薬標的の最初の構造であるS.セレビシエErg11³¹は、この技術を用いて解決された。また、C.アルビカンスCdr1^32、33、34の詳細な特徴付けと、システイン架橋研究に適したシステイン欠損Cdr1分子³⁵の作成を可能にし^、将来の高解像度構造を検証した。主要なヒト真菌病原体からの他の多くのABC輸送者(すなわち、 C.アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・オーリス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ユティリス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガトゥス、ペニシリウム・マルネッフェイ、フザリウム・ソラニ族群)もこの発現プラットフォーム24、36、37、38^を用いて詳細に研究されている。これにより、ハイスループットスクリーンで使用されている流出ポンプを過剰発現するS.cerevisiae株のパネルを生成し、新しい蛍光流出ポンプ基板ナイルレッド⁴⁰と特定の41と広域スペクトル^{14、33、42、43、44}の流出ポンプ阻害剤を発見することができました。 このシステムの使用はまた、その種の広域スペクトル真菌多剤流出ポンプ阻害剤⁴²の最初としてclorgylineの発見を可能にした。

膜タンパク質の完全な可溶化と、内因性脂質を欠いた均質な膜タンパク質ミセル調製物の作成には、高い洗剤濃度⁴⁵が必要である。しかし、残念ながら、これはまた、多くの場合、膜タンパク質^{5、8、45、46を}不活性化します。溶液中の洗浄剤モノマーの特性およびそれらの凝集は、疎水性尾部の物理的性質、アルキル鎖の長さおよび分岐、芳香核またはフルオロアルキル側鎖の存在、またはポリオキシエチレン単位の数によって影響される。したがって、洗浄剤スクリーニングは、膜タンパク質の可溶化および精製に最も適した洗剤を決定するための重要な第一歩である。

C. アルビカンスは、深刻な、生命を脅かす侵襲性感染症⁴⁷を引き起こす可能性がある免疫不全個体の主要なヒト真菌病原体であり、そして、それは、アゾール抗真菌薬^48、49に耐性を持つことができる。C.アルビカンス多剤耐性の主なメカニズムの1つは、Cdr1⁵⁰の過剰発現であり、これは、原形質膜に位置するABCGサブファミリーのII型ATP結合カセット(ABC)トランスポーター⁵¹である。フルサイズの真菌性ABCGトランスポーター(2つのヌクレオチド結合ドメイン[NBD]および2つの膜貫通ドメイン[TMD]からなる)は、より一般的に多発性薬物耐性(PDR)トランスポーターとして知られており、そのユニークな逆ドメイントポロジ[NBD-TMD]2によって特徴付けられる。PDRトランスポーターは、植物^{52、53および}真菌⁵⁴にのみ見られる。その重要性にもかかわらず、PDRトランスポーターのための構造はありませんが、人間のハーフサイズのABCGトランスポーターの構造は最近解決され、Cdr1³³の最初の仮モデルを作成するのに役立ちました。しかし、我々の最近の実験的証拠は、真菌PDRトランスポーターが特徴的な非対称NBDを有し、おそらくユニークな輸送メカニズムをもたらすため、このモデルに欠陥があることを示唆している。したがって、Cdr1の高解像度構造は、流出媒介性を克服するのに役立つ可能性のある新規排出ポンプ阻害剤の合理的設計と、この重要なABCトランスポーターファミリーの作用機序に関する洞察を提供するために必要とされる。

本研究の目的は、Cdr1の高解像度構造を得ることを究極の目的とし、遺伝子組み換え S.セレビシエ 発現宿主におけるCdr1の発現、可溶化、精製のための信頼できるプロトコルを開発することであった。このプロセスの一環として、プロテアーゼ切開可能なmGFPHisダブルタグ(図1B)は、Cdr1のC末端からタグを分離する16残基リンカーで設計され、ニッケル親和性樹脂への6x Hisアフィニティタグの結合を改善し、生細胞および精製プロセス全体におけるCdr1発現レベルのモニタリングを可能にした。約 10%C.アルビカン Cdr1(SDS-PAGE後のクマシー染色によって推定される)を含む小規模酵母血漿膜タンパク質調製物の再現性プロトコルも開発され、Cdr1の生化学的特性解析に使用できる。

1. 変換能力ADΔおよびADΔΔセルの新鮮または凍結されたストックの調製

1. 2x YPCDの25 mLを接種する[すなわち、 2x YPD;2%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、4%(w/v)デキストロース、0.079%(w/v)CSM(完全なサプリメント混合物)を含む³⁵ 培地(o/n)を1回の酵母コロニーで16時間インキュベートし、1分間に200回転で16時間(rpm)で16時間インキュベートする。
2. 25 mL o/n培養で2x YPCD培地の225 mLを接種し、600 nm(OD₆₀₀₎で細胞光学密度を確認する。OD₆₀₀ は通常 0.5~1.0 です。
   注: この段階で、次の変換実験に必要なすべての材料がすぐに利用できることを確認してください。
3. 細胞密度が〜6-8のOD600に達するまで、200rpmで振盪してさらに〜6〜8時間_30°C で培養を成長させます。
   注: 特に明記されていない限り、以下の手順は室温(RT)で実行されます。
4. 3,000 x g で遠心分離してこれらの対数相細胞を 3 分間収穫します。
5. 細胞を再懸濁し、滅菌二重蒸留水(ddH₂O;すなわち、200 mLと20 mL)でそれらを2回洗います。
6. 3,000 x g で 3 分間収穫します。
7. ゆっくりと(すなわち、30分間に30分間凍結された有限細胞(FCC)溶液の30等分のアリコートを加える)FCC[5%(w/v)グリセロール』のXmL中の細胞ペレットを再懸濁し、 氷上の10%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO))(ここで、X= OD_600;例えば_、OD600= 6が6mLで再懸濁した場合、または_OD600=3 が3mLで再懸濁した場合)。
   注: 正しい FCC 構成は、変換の成功に不可欠です。
8. 細胞を2時間氷上に保ってから変換するか、必要になるまでアリコートを-80°Cに保存します。
   注: ADΔおよびADΔΔ細胞は凍結に非常に敏感です。したがって、細胞は-80°Cにゆっくりと冷却する必要があります:50-600 μL細胞アリコートを含む氷冷マイクロ遠心チューブをプラスチック貯蔵箱(RT)に入れます。箱を大きなポリスチレン容器(RT)に入れ、フィッティングポリスチレン蓋で容器を閉めます。その後、容器を-80°Cの冷凍庫に入れます。
   注意:ゆっくりとした凍結は細胞の生存にとって重要です。

2. CACDR1-XLmGFPHisによるADΔとADΔの変換と、コロニーPCRおよびDNAシーケンシングによる正しい形質転換体の確認

注: プラスミド pABC3-CDR1-mGFPHis は、Lamping ら、 2010⁵⁵で詳細に説明されている従来のクローニング戦略を使用して作成され、図 1Bに示されています。野生型C.アルビカンスCDR1は、プラスミドpABC3-CaCDR1A-GFP¹⁴からPABC3-CaCDR1A-GFP 14からフラグメント化し、pABC3-XLmGFPHis²⁶にクローン化したPacI/NotIフラグメントとして単離した。

1. PCR は、1-10 ng の pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis を DNA テンプレートとして使用して、高忠実度 DNA ポリメラーゼとプライマー ペア PDR5 プロ/PDR5 ter³⁵を使用してCDR1変換カセット全体を増幅します。 あるいは、pABC3-CaCDR1-XLmGFPHisの2μgを37°Cで10 U制限酵素AscIで完了させる(図1A、B)。
   注:CDR1変換カセット(図1A)はPDR5プロモーター-CaCDR1-mGFPHis-PGK1ターミネーター -URA3選択マーカー -PDR5下流領域を含む。
2. アガロースゲル電気泳動を行い、約8kbの変換カセットをゲル抽出します。
   注:約8kbの CaCDR1 変換カセットのゲル精製は、ゲノム PDR5 遺伝子座に統合された線形変換カセットではなく、プラスミド全体を有する誤った形質転換体につながる可能性のある未消化のプラスミドDNAを除去する。
3. 必要量のサケ精子キャリアDNA(2mg/mL;10 mM Tris,1 mM EDTA;pH 7.5)を沸騰水浴中で10分間変性し、氷の上に置きます。蓋の開封を避けるために、サケの精子DNAを沸騰させるためにねじ込みチューブを使用してください。
4. 変性したサケの精子DNA50 μLと14 μLの変換カセット(500-2,000 ng)を混合し、さらに使用するまで64μLのDNA混合物を氷上に保持します。
   注:正の変換制御として大腸菌-酵母シャトルプラスミド(例えば、pYES2)の10 ngを使用してください(図2B)。
5. 新鮮なまたは凍結したコンピテントセルを30°Cの水浴で5分間素早く解凍し、1.5 mLマイクロ遠心分離管で50μLアリコートに分けます。
6. 最高速度(18,000 x g)でマイクロフュージで1分間遠心分離して細胞を収穫する。
7. 上清を取り除き、細胞ペレットをRTに保管します。
8. 変換ごとに、260 μL の組み合わせ 290 μL のポリエチレングリコール (PEG 3350) と 1 M 酢酸リチウム (LiAc) の 36 μL を混合し、ピペット処理を繰り返し、適切な 64 μLの氷冷DNA混合物と混合します。
9. 適切な混合物を50μLのコンピテントセルペレットアリコートにすぐに加えます。
10. PEG-LiAc-DNA混合物の360 μLの細胞ペレットを約30秒の十分にボルテックスで再懸濁させる。
11. 30°Cの水浴で細胞混合物を1時間インキュベートする。
    注: ADΔおよびADΔΔ細胞は、42^°C35よりも30°Cで変換が良い。
12. 18,000 x g で細胞を収穫します。上清を捨て、80 μLのddH₂Oで細胞ペレットを再懸濁します。
13. 細胞をCSM-URA寒天板³⁵ に広げる[すなわち、0.67%(w/v)酵母窒素塩基アミノ酸なし、0.077%(w/v)CSMマイナスウラシル、2%(w/v)グルコース、2%(w/v)寒天]。
14. ウラシル原発性形質転換体がはっきりと見えるまで、30°Cで2〜3日間プレートをインキュベートします。
    注: 線形~8 kb の CaCDR1 変換カセットおよび μg pYES2 あたり約 4 x 10^{4 変換} 剤の μg あたり約 100 個の変換剤を期待してください。
15. 5つの独立した形質転換体を選び、新鮮なCSM-URAプレートに広げて、ウラシル原始眼の形質転換体を非形質宿主細胞の残骸から分離する。
16. YPG寒天プレート上の形質転換体を成長させることで、可能な小柄変異体を除去する [1%(w/v)酵母エキス, 2%(w/v) ペプトン, 2%(v/v) グリセロール, 2% (w/v) 寒天] (図 2D).
    注:小柄変異体はミトコンドリアに欠陥があり、したがって、非発酵性炭素源で成長することはできません。彼らは S.セレビシエ⁵⁶で非常に一般的です。 S.セレビシエ ADΔおよびADΔΔは特に小柄表現型を獲得する傾向がある。
17. 酵母コロニーPCRを実行し、不純なDNAテンプレート源からPCR産物を増幅するために最適化された特定のDNAポリメラーゼで、約8kbのCaCDR1変換カセット全体を増幅することにより、少なくとも3つの独立した形質転換体をゲノムPDR5遺伝子座(図1C)に正しく統合することを確認します。DNAテンプレートとして、統合部位のすぐ外側に結合するプライマーのセットと、単一コロニーから得られた細胞懸濁液(ddH2 O)の1μLアリコートを使用します。
    注:この特定のDNAポリメラーゼは、無傷の酵母細胞から約8kbのPCR断片を確実に増幅します。しかし、確実な増幅のためには45のPCRサイクルが必要であり、酵母細胞は_ddH2OのOD₆₀₀ 1-10で再懸濁されなければならない。
18. PCR反応の1μL部分のDNAアガロースゲル電気泳動により、正確な〜8kbのPCR増幅産物を確認します。
19. 適切なプライマーを使用して処理されたDNAサンプルの部分を使用してORF全体をシーケンシングする前に、メーカーの指示に従って一本鎖DNAエキソヌクレアーゼとホスファターゼの酵素混合物を用いてPCR反応の10 μL部分から過剰な増幅プライマーを除去します。

3. 小規模酵母プラズマ膜分離プロトコル

1. 酵母細胞の増殖
   1. 10mLのYPDで10mLのYPDで200rpmで振盪して〜7〜8時間培養する前培養を行った。
   2. 10 mL前培養で40mLのYPD培地を接種し、細胞密度が1-3の_OD600 に達するまで200rpmで振盪して30°C o/n(〜16時間)で細胞をインキュベートする。
2. 酵母細胞の収穫
   1. 40のOD単位(ODU;例えば、1 = 1 ODUのOD₆₀₀ で1 mL)の対数相細胞を4,200 x g で収穫し、5分4°Cで5分間収穫する。
   2. 氷冷無菌ddH₂O(すなわち、40mLおよび1 mL)で細胞を再懸濁し、洗浄する(すなわち、40mL、その後1mL;4.200 x g で遠心分離によってステップ間の細胞を4°Cで5分間収穫する)。
   3. 氷冷滅菌ddH₂Oの1mLにペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を予冷(氷上)1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
   4. 4°Cで3分間3,300xgで細胞を収穫する。
   5. 上清を吸引する。
   6. 細胞ペレットを0.5 mL均一化緩衝液中に再懸濁する [HB; 50 mM トリス, 0.5 mM EDTA, 20%(v/v) グリセロール; pH 7.5] フッ化物 1 mM フェニルメチルスルホニルを補充したばかりの (PMSF).
      注: PMSF は水に暴露されるとすぐに不活性化されるため、常に新鮮な PMSF を追加します。
      注意:PMSFはセリンプロテアーゼ阻害剤であり、非常に腐食性であり、組織に破壊的です。それは不可逆的な目の損傷を引き起こす可能性があります。
   7. 細胞懸濁液を-80°Cで保管するか、すぐに使用してください。
3. 血漿膜の分離
   1. 凍結した場合は、氷上の細胞を約1時間解凍する。
   2. 直径0.5mmのシリカビーズを0.5mLのセルサスペンションに加え、全容量1mLに達します。
   3. 氷上に3分の冷却期間が散在し、最大揺れ強度で6サイクルのボルテックスを持つ細胞を破ります。
   4. 加熱されたメスの刃でチューブの底に薄い穴を作ります。
   5. 壊れた細胞ホモテージをチューブの底を通して、10 sの低速(〜200rpm)のスピンで別の氷冷1.5 mLマイクロ遠心管に取り付けて集めます。
      注: これにより、シリカビーズが元のチューブに残ります。
   6. 遠心分離細胞は、細胞デブリ、切れ目のない細胞、および核を除去するために、4°Cで5分間5分間、5,156 x g でホモゲネートを形成します。
   7. 450 μL の上清を氷冷1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、新鮮なPMSF(1 mM)を加えた氷冷HBを1 mL追加します。
      注:この希釈ステップは、高品質の血漿膜タンパク質の回復に不可欠です。
   8. 17,968 x g で4°Cで1hの血漿膜を収穫し、1mM PMSFで補充されたHBの100 μLで、繰り返しピペット処理を繰り返して、血漿膜ペレットを再懸濁します。HBと上下ピペットの100 μLを放出する前に、100 μL ピペットチップで細胞ペレットを攪拌することにより、適切な形質膜均質化のために細胞ペレットをゆるめます。
   9. 還元剤および洗剤を含むバッファーと互換性のあるタンパク質アッセイキットを用いて、血漿膜調製物のタンパク質濃度を測定します。
   10. 80°Cでプラズマ膜を保管するか、すぐに使用するために氷の上に保管してください。

4. ドデシル硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)

1. ポリアクリルアミドゲルを調製するための装置を組み立てます。
2. 2つの分離ゲル(7%ポリアクリルアミド)に対して、2.1 mLのアクリルアミド/ビスアクリルアミドを40%混合し、 4x分離バッファーの 3 mL (1.5 M トリス, 0.4% ドデシル硫酸ナトリウム [SDS] (w/v); pH 8.8), ddH₂O. 6.9 mL テトラメチルエチレンアミンの 8 μL (TEMED) と 60 μL 10% アンモンアン硫酸 (APS) ポリマー化開始に開始します。
   注意:アクリルアミド/ビスアクリルアミドは非常に有毒です。それは皮膚刺激、末梢神経障害を引き起こし、発がん性物質である。TEMEDは、飲み込んだり吸入したりすると有害です。APSは飲み込むと有害です。それは深刻な目と皮膚の刺激を引き起こします。
3. この混合物の約4〜5mLを組み立てたゲル装置に注ぎ、上から〜2cmまで注ぎます。
4. 慎重に0.1%SDSの1〜2 mLを上に重ね、平面半月板を作成します。
5. ポリアクリルアミドをRTで〜60分間設定します。
6. 40%アクリルアミド/ビスアクリルアミドの0.5 mLを混合することにより、2つのゲルのための積層ゲル混合物を調製し、 4xスタッキングバッファーの1 mL(0.5 Mトリス、0.4%SDS(w/v)、pH 6.8)、およびdDH₂O. 6.9 mL に2 μLの TEMED と 30 μL の 10% APS を加えてアクリルアミドの重合を開始します。
7. 重合分離ゲルから0.1%のSDS層を取り出し、DDH₂OでリンスしてSDSの痕跡を取り除きます。
8. 積み重ねゲルミックスを分離ゲルに注ぎます。
9. 積み重ねゲルに櫛を入れ、櫛の周りから気泡を取り除きます。
10. 積み重ねゲルをRTで約60分間セットします。
11. くしを取り出し、水でゲルスロットをすすきます。ゲルタンクにゲルを入れ、ゲルタンクを1xランニングバッファ(24.8 mMトリス、190 mMグリシン、0.1%SDS)で上部に充填します。
    注: RT に格納されている 10x バッファ ストック (248 mM トリス、1.9 M グリシン、1% SDS (w/v) から 1x のバッファを準備します。
12. 5-10 μLの形質膜サンプル(すなわち、10-20 μgタンパク質)を2xタンパク質負荷染料の等量[120 mM Tris-HCl(pH 6.8)、20%グリセロール、0.02%ブロモフェノールブルー、4%SDS、200 mMジチオトライトール(DT)を混合し、すぐに液状に流れ込む)
    注意:DTTは飲み込むと有害です。それは深刻な目と皮膚の刺激を引き起こします。
    注:2倍のタンパク質ローディング染料、アリコート、-20°Cで保管して10mLのストックを作ってください。 混合サンプルを加熱せず、GFPタグが変性しないように、すぐに個々のゲルスロットにロードし、ゲル内蛍光シグナルを検出することができます。
13. タンパク質の分子量マーカー(10-245 kDa範囲)を別のスロットにロードして、個々のタンパク質フラグメントのサイズ推定を可能にします。
14. 青い負荷染料がゲルの底部(通常45〜55分)に達するまで、200Vでゲル電気泳動を行います。
15. ゲルイメージングシステムを用いてインゲルGFP-蛍光のゲルを調べます(励起波長と発光波長はそれぞれ475-485 nm、520 nm)。
16. インゲル蛍光イメージングに続き、RTで15分間、ゲルのゲルを穏やかに攪拌して約10〜20mLプロテインゲル固定液(40%エタノール、10%酢酸)でタンパク質を固定します。
17. 10 mLのddH₂Oで10分間2回ゲルをリンスし、RTで10mLコロイドクマシー染色液にゲルを入れ、RTで〜1時間穏やかに揺れ動かしてタンパク質バンドを可視化します。
18. タンパク質バンドの可視化を改善するために、ゲルイメージングシステムで画像を記録する前に、ddH 2 Oの_{〜20 mL〜20}mL〜1時間でゲルを1回または2回脱染色する。

5. Cdr1 ATPase活動の決定⁵⁷

1. 希薄な原形質膜サンプル>HBで1〜2mg/mLに2.2mg/mL。
2. ATPaseアッセイカクテル(75 mM MES-Tris、 75 mM 硝酸カリウム、0.3 mMモリブデン酸アンモニウム、7.5 mMナトリウムアジド、pH 7.5)およびMg-ATP(28.8 mM ATP二ナトリウム塩、28.8 mMMgCl 2;pH 7.0)から30°Cの30°C
   注意:アジドナトリウムは非常に有毒です。
   注:すべてのバッファストックとボトルがリン酸フリーであることを確認してください。すなわち、1%(vol/vol)HClでガラス製品を洗浄し、ddH₂Oで数回洗い流します。また、ガラス製品の洗浄に使用される洗剤に一般的に存在するリン酸塩の痕跡を含む可能性が高い他のガラス製品とは別に保管してください。
3. Cdr1-ATPase阻害剤(オリゴマイシンの20 μM)の有無にかかわらず、90 μLのアッセイカクテルを96ウェルマイクロチタープレートの個々のウェルに加えます。
   注:アッセイは三重で行われます。
4. マイクロチタープレートの適切なウェルに、5 μLの単離された原形質膜(〜5〜10 μgタンパク質)またはリン酸標準(0-100 nmoles Pi)を加えます。
   注: リン酸塩標準の 2 つの別々のセットの最初と最後の列を保持します。
5. マルチチャンネルピペットを用いた25μLのプリウォーム28.8 mM Mg-ATP(最終濃度)を個々のウェルに加え、30°Cで30分間インキュベートします。
6. 130 μLの現像試薬(1.6%L-アスコルビン酸ナトリウム、1%SDS、6 M硫酸中のモリブデン酸12%)を添加して反応を停止します。
   注意:濃縮硫酸は水と激しく反応します。それは腐食性であり、皮膚および肺の損傷を引き起こす可能性があります。
7. RTで10分間インキュベートします。
8. マイクロティタープレートリーダーで750 nmのマイクロティタープレートウェルの吸光度をお読みください。
   注:青色染料の発達は時間とともに続くため、青色の色素の開発(すなわち、還元された蛍光モリブデン複合体)の10分のインキュベーション時間に固執することは、アッセイの精度にとって重要です。
9. オリゴマイシンの不在時の総ATPase活性からオリゴマイシン存在下でのATPase活性を差し引くことによってCdr1特異的ATPase活性(すなわち、オリゴマイシン感受性ATPase活性)を得る。

6. 小型洗剤スクリーン

1. 血漿膜製剤を組み合わせる(すなわち、 Cdr1-mGFPHisをGTED-20バッファーで過剰発現する細胞の2.5mgの血漿膜タンパク質)[10 mMトリス、0.5 mM EDTA、20%(w/v)グリセロール;pH 7.5;試験用洗剤5mgを含む1mM PMSFで補充し、合計0.5mL(w%)に達する
2. 4~8°Cで回転装置で2時間回転させます。
3. 4°Cで141,000xgで混合物を遠心分離する。
4. 可溶化した材料を含む上清を新鮮なマイクロ遠心チューブに移します。
5. 不溶性ペレット分画に2%(w/v)SDSを添加したGTED-20バッファーの0.5 mLを加え、30°Co/nで振るインキュベーターでインキュベートし、すべての界面活性剤不溶性膜タンパク質を抽出します。
6. SDS-PAGEによる上清および可溶化されたペレットの分率を分析し、比較します。
7. イメージングシステムでの発現レベルの定量化およびクーマシー染色前のインゲルGFP蛍光用GFPタグ付きタンパク質を含むゲルを撮影します。
8. 蛍光サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)58などの下流用途に可溶性膜タンパク質画分を使用して、適切な洗剤を同定する。

PYES2(図2B)でS.セレヴィシエADΔΔ(〜4 x104形質転換体/μg)の高周波変換が達成された。予想通り、無DNA(すなわち、ddH2 Oのみ)制御は形質転換体を与えず、かつ1μgの線形CDR1-mGFPHis変換カセット(図1A)は、最適化されたADΔΔ変換プロトコルで〜50個の変換剤(図2C)を与えた。CDR1-mGFPHis形質転換体はまた、欠陥のあるミトコンドリアを有する可能性のある小柄変異体を排除するために、非発酵性炭素源で成長する能力について試験された。3つ(黄色の円;図2D)試験した25のウラシル-プロトトロフ形質転換体のうち、YPG寒天プレート上では成長せず、さらなる調査から廃棄された。新たに作成された株ADΔΔ-CDR1-mGFPHisによって発現されるCdr1-mGFPHisは、血漿膜に適切に局在し(図1A)、Cdr1の構造的および機能的特徴付けに十分なレベルで発現した(図3)。最適化された二重タグ(図1B)の設計により、Cdr1-mGFPHisのニッケル親和性精製後のmGFPHis二重タグの除去が可能になり、下流のアプリケーションにおけるタグからの干渉の可能性を防ぎます。しかし、予備的な結果は、Cdr1とHRV-3Cプロテアーゼ切断部位との間の3つのアミノ酸リンカーがより速く、より効果的な切断を達成するために拡張されなければならないことを示している。同様の観察は、最近、N末端タグ付きヌクレオシド輸送体エシェリヒア・コリNupCについて報告されたが、ニッケル親和性樹脂59に結合した洗浄剤(DDM)の効率的な切断のために当初設計された3アミノ酸リンカーではなく15を必要とした。HRV-3C切断部位の5アミノ酸リンカーC末端は、関心のあるタンパク質を付着したmGFPHis二重タグの立体干渉を防止し、以前にC.utilis ABCトランスポーターCdr139について観察した。yEGFP3-A206K突然変異は、高タンパク質濃度28での人工GFP二量体化を防ぐために作成され、mGFPとHisニッケル親和性タグの間の追加の3アミノ酸リンカーは、ニッケル親和性樹脂へのタグ付きタンパク質の結合効率を最大化するためにHisタグの適切な表面暴露を保証する(データは示さない)。

図1:真菌血漿膜輸送体の効率的なクローニングと発現のための酵母膜タンパク質発現プラットフォームである(A)PDR5プロモーター(青)を含む変換カセット、CDR1(赤)C末端にXLmGFPHis(緑色)、PGK1ターミネーター(オレンジ)、URA3選択マーカー(水色)、およびPDR5下流領域(青色)の一部がS発現.cerを変換するために使用されるゲノミックPDR5遺伝子座での集積によるエビシアエADΔΔ。機能の得る変異型転写因子Pdr1-3は、原形質膜におけるCdr1(赤い八角形)の構成過剰発現を引き起こす(下の共焦点顕微鏡画像を参照)。(B) プラスミド pABC3-XLmGFPHis, 従来のクローニング戦略で使用できるまたは変換カセットを生成する PCR テンプレートとして使用できます。.プラスミド pABC3-XLmGFPHis の pABC3-GFP14 に対する改良点は、プラスミド マップの下にリストされています。(C) ADΔのゲノムPDR5遺伝子座で変換カセットを統合するための、より効率的なワンステップクローニング戦略。ORF(赤)は、左腕(青)とのオーバーラップを作成するプライマー(矢印)を使用してPCRを増幅することができます。PDR5プロモーター)および右腕(緑;XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5下流)フラグメント。変異(黒線)は、必要に応じてプライマー設計によってORFに導入することができる。PDR5軌跡で正しい統合を指示する相同の組換えイベントは、交差した破線で示されます。(D) 真菌多剤流出ポンプの機能特性評価に使用できる全細胞アッセイ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2: CDR1を有するADΔΔの変換-mGFP彼の 変換カセットと小柄なADΔ-CDR1-mGFPHis変換剤の除去 ウラシル原始眼形質転換体は、30°Cで30°Cのプレート上で形質転換ADΔ細胞を3日間インキュベートして選択した。(A) 陰性コントロール (DNA なし)。(B) 陽性コントロール (pYES2 の 10 ng)。(C) CDR1-mGFPHis 形質転換体(1 μgのDNA)。(D) AdΔΔ-CDR1-mGFPの試験 YPG寒天板上の小柄表現型に対する形質転換体。欠損したミトコンドリアのためにYPG寒天板上で成長できなかった小柄な形質転換体は黄色で囲まれている。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

GFP蛍光は、Cdr1-mGFPHisの量(ステップ3.3.9)とインゲル蛍光シグナルとの間に直線的な関係があったため、Cdr1発現レベルに対する信頼できる尺度である(図3A)。本プロジェクトでは、化学化学特性解析のための高品質な小形質プラズマ膜製剤の迅速な生成を目的として、再現性の最適化されたワークフローを開発しました。Cdr1 ATPase活性が最も高い(400 nmol/min/mg)を示すほぼ0.5mgの血漿膜タンパク質(図3C;左グラフ)を生成することが可能であった。図 3C;右グラフ)対数相の40 ODU(1-3のOD600nm)セル(0.5mLで再懸濁)をシリカビーズの体積(すなわち、0.5 mL)、最大揺れ強度で1分間の渦の6サイクルを破ると、氷上で3分の冷却期間が続く。破損サイクルの数のさらなる増加(ステップ3.3.3)は、単離された血漿膜調製物の品質を低下させた(Cdr1 ATPase活性は170 nmol/min/mgから〜60 nmol/min/mgに低下した;より多くの破断周期で分裂した細胞から分離された細胞膜サンプルのSDS-PAGEタンパク質パターンにはわずかな違いしかありませんでしたが(データは示されていません)、10回以上の破損サイクル後にCdr1 ATPase活動がほぼ3倍に減少した場合、Cdr1の部分的な変性が上昇した温度への暴露によって引き起こされた可能性があります。ii) リン酸化や脱リン酸化などの翻訳後修飾;またはiii)他の小器官の膜分画を有する単離された形質膜小胞の交差汚染を増加させた。HBの0.5 mLで細胞の40 ODUを破ることは、血漿膜の最高品質をもたらした(すなわち、血漿膜タンパク質の10 μgあたり最もCdr1;図 3B)最高のCdr1 ATPase活性を有する(図3C;右グラフ)。より高い >(hbの40 ODU/0.5 mL)または低い(HBの20 ODU/0.5 mL)細胞密度は、単離された形質膜のATPase活性を低下させた(図3C;右グラフ)が、その収率は増加する細胞密度に比例して増加した(図3C;左グラフ)。このように、40 ODU/0.5 mLのHBは、最高品質のプラズマ膜を単離するための最適な細胞密度でした。したがって、血漿膜製剤の小規模な分離のために最適化されたプロトコルを使用すると、Cdr1特異的なATPase活動の2〜3倍(〜300 nmol/min/mg;図 3C;右グラフ)は、最初に得られたCdr1特異的なATPase活動と比較した(〜100 nmol/分/mg;データは示されていない)。これらのATPaseの活動はまた、より労働集約的で時間のかかる大規模な血漿膜調製プロトコル14、41、60で得られた、以前に報告されたCdr1 ATPase活動(100-200 nmol/min/mg)よりも有意に高い35であった。

生体膜から膜タンパク質を抽出する最も一般的な方法は、洗浄剤による可溶化です。しかし、タンパク質の安定性や折りたたみ特性に対して、最も有害な効果を持つ適切な洗剤を見つけることが課題です。mGFPHisでタンパク質を標識すると、タンパク質抽出に最適な洗剤を選択するためのスクリーニングが容易になります。合計で、材料表に記載されている31の洗剤は、S.セレビシエADΔ-CDR1-mGFPHis細胞の粗形質膜からCdr1を可溶化する能力について様々な特性を有する試験を行った。16 個のテスト用洗剤 (A-Q) の代表的なセットの結果を図 3Dに示します。レーンT、P、およびSは、洗浄剤可溶化後すぐに(T)血漿膜タンパク質の10μLアリコートを含み(ステップ6.2)、洗浄剤不溶性ペレット(P; 可溶化o/nをGTED-20の0.5mL、2%SDS;ステップ6.5)及び洗剤可溶性上清(S;ステップ6.4)は、141,000xgで超遠心分離により分離した後の分数である。所望の洗剤は、その構造および/または機能を変更することなく、可能な限り多くのCdr1-mGFPHisを可溶化する必要があります。粗形質膜タンパク質(5mg/mL)を、1%(w/v)洗剤(T)および可溶性(S)および不溶性(P)分率のアリコートを2時間可溶化し、SDS-PAGE(図3D)で分析し、後で蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)58(図4)を用いた。Cdr1の効率的な可溶化には、最小の洗浄剤対タンパク質比2:1(w/w)が必要であると判断しました。実際、Cdr1-mGFPHisの可溶化に必要な最適な洗浄剤(DDM)濃度を決定するために、界面活性剤の臨界ミセル濃度(x CMC)および洗剤/膜タンパク質比(w/w)を調べた。DDMの10xまたは80x CMCの固定濃度を使用する場合、Cdr1-mGFPHisの可溶化効率の大きな違いが認められた。可溶化効率は、様々な可溶化実験で使用された粗形質膜の量に応じて40%から80%または60%と90%の間で変化した。しかし、≥2(w/w)のタンパク質比に対する洗浄剤を選択すると、使用される血漿膜タンパク質の量に関係なく、Cdr1-mGFPHisの>85%が可溶化され、再現的に良好な結果が得られました。したがって、単にCdr1-mGFpHisなどの膜タンパク質の可溶化に1%または2%(w/v)洗剤を選択するというより一般的なアプローチを使用する場合、洗剤とタンパク質比を2(w/w)以上に保つことが重要である[すなわち、1%(すなわち、10mg/mL)を使用する場合は、血漿膜タンパク質濃度を5mg/mL以下に抑える。.

図3:Cdr1-mGFPの定量化Cdr1-mGFPHisの小スケール血漿膜分離プロトコルおよび洗剤スクリーンの最適化(A)インゲル蛍光を有するCdr1-mGFPHisの定量化。同じ0.7%ポリアクリルアミドゲルの蛍光SDS-PAGE画像が左に示されています。レーン1~6は、ADΔΔ-CDR1-mGFPの0.75、1.5、3、6、12、および24μgの形質膜タンパク質を装填した。Cdr1-mGFPHisは赤い矢印で示されています。M = 精密プラスプロテインマーカーmGFP蛍光強度(右に示す)は、試験された全濃度範囲にわたって線形であり、最小限のバックグラウンド蛍光があった。(B) 単離された形質膜の質に及ぼす破断時の細胞密度の影響クマシー染色ポリアクリルアミドゲル(7%)の血漿膜タンパク質サンプル(10μg)と、クーマシー染色前の同じゲルのCdr1-mGFhisの緑色蛍光シグナル。M = 精密プラスプロテインマーカーレーン1、3、5、および7は、ADΔΔおよびレーン2、4、6、および8の血漿膜タンパク質であり、それぞれ20、40、60、および80ODUの細胞から単離されたADΔ-CDR1-mGFPHisの血漿膜タンパク質である。Cdr1-mGFPHisは赤い矢印で示されています。緑色蛍光シグナルの相対パーセンテージが下にリストされています。(C) 切れ損時の細胞密度が、単離された血漿膜の収量およびCdr1-mGFPHisのATPase活性に及ぼす影響左は、ADΔΔおよびADΔ-CDR1-mGFPHis(Cdr1)細胞から単離された細胞膜タンパク質の量に対する細胞密度(ODU/0.5 mL HB)の効果である。右側には、ADΔ-CDR1-mGFPHis細胞から単離された血漿膜のCdr1 ATPase活性に対する細胞密度の影響。(D) 可溶化混合物の 10 μL アリコートの例示的な SDS-PAGE (T; 0.5 mL)、可溶化後のペレット(P;0.5 mL)、およびADΔΔ-CDR1-mGFPHisの洗浄剤可溶化粗形質膜タンパク質の可溶化(上清)画分(S;0.5 mL)とCdr1-mGFPの下端染色前の蛍光(上)を含む。M =広いMW事前染色タンパク質ラダー(245、180、135、100、75、63、および48 kDaバンド;180 kDaおよび75 kDaバンドはそれぞれ赤と緑の矢印で示されています)。レーンA~LおよびN~QはTであり、 DM(A)、β-DDM(B)、α-DDM(C)、TDM(D)、LMNG(E)、OGNG(F)、OG(G)、LDAO(H)、ヘガ(I)、メガ(J)、トリトンX100(K)、チャップス(L)、NM(N)、トゥイーン80(O)、フォスコリン-13(PD)、PD(PD)、PF(PD)、PF(PD)、PD(PD)、およびPF(PD)、およびPP(P)PF(PD)、およびPD(D)、LMNG(E)、OGNG(F)、OG(G)、LDAO(H)、ヘガ(I)、メガ(J)、トリトンX100(K)、チャプソ(L)、NM(N)、トゥイーン80(O)、フォスコリン-13(PD)、PD(PD)、LMNG(E)、OGNG(F)、OG(G)、LDAO(H)、ヘガ(I)、メガ(J)、トリトン-X100(K)、チャップス(L)、NM(N)、トゥイーン80(O)、フォスコリン省略形は、 [ 材料表] で定義されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

洗浄剤スクリーニング結果(図3D)、DDM(BおよびC)およびFos-コリン-13(P)に基づいて、Cdr1-mGFPHisの可溶化に最適な洗剤として見えた。しかし、Fos-コリン-13を使用すると、Cdr1-mGFPHisの部分タンパク質分解を引き起こすようである(図3DのP)。LMNG(E)、PCC-α-M(図示せず)、そしておそらくDM(A)が次善の洗剤であった。また、この界面活性剤スクリーンは、グルコシドOGNG(F)およびOG(G)、CHAPS(L)、NM(N)、およびアンツァーゲンツ(図示せず)が、不溶性ペレット画分にかなりの量のタンパク質が見つかったため、Cdr1-mGFPHisの可溶化に対して悪い選択であることを示した(図3D)。SDS は Cdr1-XLmGFPHis を変性させるため、Q レーンに緑色の蛍光信号が見えない (図 3D)。

適切に折り畳まれた天然Cdr1-mGFPの可溶化に対する洗浄剤の適合性を、洗浄剤可溶化された形質膜タンパク質のFSECによっても評価した(ステップ6.4上清)。ADΔ-CDR1-mGFPHisから100μLの粗形質膜タンパク質に対して得られたクロマトグラムの例を1%の洗剤で可溶化した(2mg/mL)を図4に示す。9 mL溶出体積のピークは、ほぼ凝集したCdr1-mGFPHisを表し、適切に可溶化し、正しく折り畳まれたCdr1-mGFP一であり、粒子は15.5mL溶出体積でガウス状のピークによって表される。12 mL と 14 mL 溶出量の間の広い肩には、あまり明確に定義されていない Cdr1-mGFP ミセル粒子が含まれている可能性があり、部分的なミスフォールディングまたはタンパク質凝集体を示します。マルトサイドおよびLMNG抽出タンパク質のクロマトグラムは、Cdr1-mGFPHisのほとんどが15.5mLで良い形のガウスピークとして溶出し、小さな肩が14mLでわずかに早く溶けている(図4A)。これらのサンプルは、空隙体積中にCdr1-mGFPHis溶出はなかった。ブランク・サンプルは、mGFP 信号を与えなかったバッファーと DDM 制御です。図4Bのクロマトグラムは、洗浄剤の可溶化されたCdr1-mGFPHis粒子の品質に対する糖ヘッドグループの種類の重要性を強調しています。洗浄剤を含むグルコース(OG、NG、OGNG)は、洗浄剤を含むスクロース(DDS)よりも悪い結果を示し、これは洗浄剤を含むマルトース(NM、DMNG、DDM)よりも悪い結果を示した。Cdr1-mGFP凝集体(OG)または広い凝集ピーク(NG、OGNG)として溶出したグルコースで可溶化したのは、図3Dで観察されたOGNG(F)およびOG(G)のペレット画分中のCdr1-mGFPの大部分の沈殿物から期待される。DMNGクロマトグラム(緑;図 4B)DDMクロマトグラム(青;)と質的に類似していた。図4B)において、DDMのピークが高いほど、DMNGの大部分がCdr1-mGFPHisを可溶化する可能性があることを示している。図4Cは、ジウテリオニック・フォスコリンのFSECクロマトグラムを示しています(Fos-コリン-8、 Fos-コリン-10、フォスコリン-13)および2つの非イオン性洗剤(ジギトニン、トリトン-X100)および図4Dは、2倍の(200 μL)の洗剤可溶化タンパク質の負荷がフォスコリン-8、-10、およびDDのクロマトグラムの品質に顕著な影響を及ぼさなかったことを示している。唯一のデジソニン(オレンジ;図 4C)DDMに同様のクロマトグラムを与えた(青;図 4C)そして、Fos-コリン-13は対称的な鋭い形のピークを与えたが、DDM(15.5 mL)のそれよりも著しく低い溶出容積(14mL)で再び溶出した。全体として、12または13の炭素残基の長い脂肪族側鎖を有する洗剤によるより良い可溶化の明確な傾向があった。例えば、DDM>DM>NM(12、10、または9炭素)、フォスコリン-13>10>8(13、10、または8炭素)、およびLMNG>DMNG>OGNG(12、10、または8炭素)がそれぞれである。したがって、疎水性の尾部が12未満の洗浄剤は、12または13炭素の長い疎水性尾を有する洗剤よりもCdr1-mGFPHisの可溶化に適した洗剤がはるかに少なかった。 非イオン性洗剤(DDM、LMNG)は、一般的に、ツウィッテリオニック洗剤よりもCdr1-mGFPHisの可溶化に適していると思われた(図3D、図4)。

図4:FSECを用いたCdr1-mGFPの洗浄剤スクリーニング 100 μLの可溶化された ADΔ-CDR1-mGFPのクロマトグラム粗形質膜(2 mg/mL)を含む粗形質膜(2 mg/mL)を示し、スーパーオース6-増量10/300GLサイズ除外カラムを使用して分離した。クロマトグラムは、収集した溶出バッファーの 1 カラム容積 (CV; 25 mL) の mGFP 蛍光単位 (FU) を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。