哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離

サマリー

本論文は、ショ糖密度勾配超遠心化を用いて哺乳動物細胞からの子宮体をリサイクルする方法を提示することを目的とする。

要約

内皮の人身売買は、生物学的事象の広い範囲を調節する不可欠な細胞プロセスです。タンパク質は、原形質膜から内在化し、初期の子宮間体に輸送されます。インターロナイズされたタンパク質は、分解のためにリソソームに通過したり、細胞膜にリサイクルすることができます。エンドサイトーシスからの膜材料の除去のバランスをとるためには、堅牢なエンドサイト循環型の循環経路が必要です。ADP-リボシル化因子6(ARF6)を含む様々なタンパク質が経路を調節すると報告されている。密度勾配超遠心分離は、細胞分画の古典的な方法である。遠心分離後、オルガネラはイソピクセンの表面で沈み込む。分数は収集され、他のダウンストリーム・アプリケーションに使用されます。ここで説明するプロトコルは、密度勾配超遠心分離を用いて、トランスフェクションされた哺乳動物細胞からendosome含有分率をリサイクルして得るプロトコルである。単離された分画を、それらのタンパク質内容物を分析するための標準的なウエスタンブロッティングを行った。この方法を用いることで、Ras関連C3ボツリヌス毒素基質1(Rac1)グアニンヌクレオチド交換因子である巻込みおよび細胞運動性1(ELMO1)の細胞膜ターゲティングが、ARF6媒介性エンドサイトリサイクルを介してであることを同定した。

概要

内経性の人身売買は、様々な生物学的事象^1、例えば、シグナル伝達受容体、イオンチャネル、および接着分子の輸送を含む必須の生理学的プロセスである。血漿膜に局在するタンパク質は、エンドサイトーシス²によって内在化される。その後、内部化されたタンパク質は初期の内期³によってソートされる。タンパク質の一部は分解のためにリソソームを標的としている^。しかし、大量のタンパク質は、高速リサイクルと低速リサイクルプロセスによって細胞表面にリサイクルされます。高速リサイクルでは、タンパク質は初期の子宮体を離れ、原形質膜に直接戻ります。逆に、遅いリサイクルでは、タンパク質はまずエンドサイトリサイクルコンパートメントに分類され、次に形質膜に戻されます。種々のカーゴタンパク質は、例えば、クラトリン、レトロマー複合体、レトリバー複合体及びウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質、及びSCARホモローグ(WASH)複合体、4、5、6、7、8、9等の膜リサイクルプロセスに関与する。エンドサイトーシスとリサイクルイベントのバランスは、細胞の生存に不可欠であり、例えば、細胞接着、細胞移動、細胞極性、およびシグナル伝達などの様々な細胞事象¹⁰に寄与する。

ARF6は、小さなGTPaseで、内視鏡^7、11、12の報告されたレギュレータです。関心のある研究グループは、内視鏡リサイクルにおけるARF6の重要性を図示しています^{13,14,15,16, 17}.この研究は、ARF6媒介性神経突起成長とエンドサイトリサイクルとの関係を調査することを目的としている。前の報告は、ARF6の活性化がサイトカネシス1(DOCK180)複合体¹⁸のELMO1-ディディケーターに作用してRac1活性に上流であることを示唆している。しかし、ARF6がどのようにELMO1-DOCK180仲介Rac1シグナリングを引き起こすかは不明です。このような過程におけるARF6媒介型エントサイトリサイクルの役割を調査するために、密度勾配超遠心分離が採用された。それを用いることによって、細胞ライセ^ート19から循環性のendosome含有分率が得られた。分画を、タンパク質含量分析用のウェスタンブロッティングを行った。免疫ブロットの結果は、脳に富んだアダプタータンパク質であるFE65の存在下で、活性ARF6が、エンドーソーム含有分率のリサイクルにおけるELMO1のレベルを実質的に増加させたことを明らかにした。以下のプロトコルには、(1)哺乳類細胞をトランスフェクトするための手順が含まれています。(2) サンプルと密度勾配列の準備(3)循環性のendosome含有分率を得る。

プロトコル

哺乳類細胞培養とトランスフェクション

1. 100mm培養皿に2 x¹⁰⁶ 細胞をプレート。トランスフェクションごとに4つの料理を使用してください。
   注: 必要なセルの数は、セルの行によって異なる場合があります。分離の手順に進む前に最適化が必要な場合があります。
2. 翌日, メーカーの指示に従ってリポフェクタミンで細胞をトランスフェクト.

2. 細胞の収穫

1. 培養後48時間の培養培地を廃棄する。
2. 氷冷PBS(10 mMリン酸ナトリウム、2.68mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム)で細胞を2回洗浄します。
3. 1 mLの氷冷PBS+(0.5xプロテアーゼ阻害剤カクテルと0.5xホスファターゼ阻害剤カクテルを加えたPBS)を各料理に加えます。
4. 細胞スクレーパーで細胞を収集し、細胞懸濁液を15 mL遠心分離管に移します。
5. 400xgで5分間スイングバケットローターを用いて遠心分離により細胞をペレット化した。
6. 上澄み液を捨て、細胞ペレットを5mLの均質化バッファー(HB;250 mMスクロース、pH 7.4で3mMイミダゾール、0.03 mMシクロヘキシミド、1xプロテアーゼ阻害剤、1xホスファターゼカクテル阻害剤を添加した1 mM EDTA)で穏やかに再懸濁します。
7. 10分間1,300xgで遠心分離して細胞を回収します。
8. HBの1 mLで細胞ペレットを再懸濁する。
9. 15-20ストロークのためのDounceホモジナイザーで細胞を均質化します。
   注: 他のホモジナイゼーション方法(例えば、サンプルを注射器を通す)を使用することができます。均質化効率は、相コントラスト顕微鏡下でホモゲン酸を観察することによって明らかにすることができる。
10. ホモゲン酸を2 mL遠心チューブに移します。
    注:5xサンプルバッファーの12.5 μLで50μLのホモゲン酸を収穫し、トータルリセートとしてラベル付けしてください。
11. 0.7 mLのHBをホモジネートに加えます。
12. 希釈したホモゲネートを2,000 x g で4°Cで10分間回転させます。
    注:ペレットには核と切れ目のない細胞が含まれています。
13. 上清の1.5mLを収集し、ステップ2.12を一度繰り返します。
14. 上清の1.4mLを収集し、ポスト核上清(PNS)としてラベル付けします。

3. 密度勾配カラムの準備

1. 1.2 mLのPNSを超遠心チューブに移します。
2. サンプルに62%スクロース溶液(2.351 Mショ糖、pH 7.4で3 mMイミダゾール)の1 mLを加え、穏やかなピペットでよく混ぜます。
   注:結果として得られたソリューションは40.6%のスクロース溶液です。
3. サンプルの上に3.3 mLの35%スクロース溶液(1.177 Mスクロース、pH 7.4で3 mMイミダゾール)を慎重に加えます。
4. 25%スクロース溶液(0.806 Mショ糖、pH 7.4で3 mMイミダゾール)の2.2 mLを慎重に加え、35%スクロース溶液の上に添加します。
   注:室温での62%、40.6%、35%、および25%のスクロース溶液の屈折率は、それぞれ1.44、1.40、1.39、1.37です。スクロース溶液の屈折率は、実験の精度と一貫性を確保するために、屈折計で確認することができます。
5. 超遠心チューブをHBで満たします。
   注:準備された密度勾配列を4°Cに一時的に保管してください。

4. 分画と循環性の分画の回収

1. 4°Cで3時間210,000 x g でカラムを遠心分離します。
2. 12 分の部分 (それぞれ 1 mL) を慎重に収集し、グラデーションの上から開始します。
   注:リサイクル内生は、35%から25%のスクロースソリューションの間のインターフェースで見つけられる必要があります。回収された分率は液体窒素でスナップ凍結し、-80°Cで保存することができる。
3. 希釈バッファーの 1 mL ですべての分画を希釈します (3 mM イミダゾール pH 7.4, 1 mM EDTA)。
4. 4°Cで1時間100,000xgで希釈したサンプルを遠心分離する。
5. 上清を吸引し、50 μLの1xサンプルバッファーを加え、分画を収穫します。
6. 分画中のタンパク質内容物をウェスタンブロッティングで分析します。

結果

非トランスフェクトされたHEK293細胞を密度勾配超遠心分離により分画した後、勾配の上から12個の画分を採取した。収穫された分率を希釈し、希釈バッファーを1:1比で希釈し、第2回遠心分離を行った。その後、サンプルを、タンパク質の内容物を分析するためのウェスタンブロットを行った。 図1に示すように、循環型の気になるマーカーRab11が分画⁷²⁰で検出される。β-COP、COX IV、GAPDH、EEA1、Rab7、およびLamp1を含む他の細胞下マーカーもプローブされた。正のEEA1信号も画分7でも検出されます。分画7およびPNSの両方のGAPDH、COX IV、およびRab11のバンド強度をImageLabソフトウェア(バイオ・ラッド)で測定した。分数7からPNSのマーカーの強度比を計算し、SD±棒グラフで表した。

これまでの研究では、ARF6とELMO1がFE65と相互作用して、Rac1媒介性神経突起の成長^を促進

ディスカッション

上記のプロトコルは、超遠心分離によって培養細胞から培養された細胞から循環性の内生体を単離するための手順を概説する。この方法の信頼性は最新の刊行²²によって実証されており、リサイクル用のエンドーソームがゴルジ装置やミトコンドリアなどの他のオルガネラ(図1)から正常に分離されていることを証明している。いくつかの重要なステップは、良好な分離結果を得るために注意する必要があります。スクロース溶液を調製する間、屈折計で溶液の屈折率を検証することが推奨されます。室温での62%、35%、および25%のスクロース溶液の屈折率は、それぞれ1.44、1.39、および1.37である。また、気泡は勾配から避けるべきです。列に気泡が存在すると、グラデーションの連続性が崩る可能性があります。洗剤はオルガネラの膜に損傷を与えるので、均質化プロセスでは避けるべきです。これは、膜結合型小器官からのタンパク質の放出につながり、重度の汚染をもたらす可能性があります。また、均質化中のタンパク質分解を避けるために、使用前にすべての均質化ツールを事前に冷却する必要があります...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL、オープントップ厚壁ポリプロピレンチューブ、11 x 34 mm	Beckman Coulter	347287
100 mm tissue culture dish	SPL	20100
13.2 mL、認定フリーオープントップ薄壁ウルトラクリアチューブ、14 x 89 mm	Beckman Coulter	C14277
5x Sample Buffer	GenScript	MB01015
cOmplete、EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	4850S	COX IVを検出するためのウサギモノクローナル抗体。
シクロヘキシミド	Sigma-Aldrich	C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL	DWK Life Sciences	357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose	HyClone	SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271519	ELMO1 を検出するためのマウスモノクローナル抗体。
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
FE65 抗体 (E-20)	Santa Cruz Biotechnology	SC-19751	FE65 を検出するためのヤギポリクローナル抗体。
Fetal Bovine Serum, Research Grade	HyClone	SV30160.03
GAPDH モノクローナル抗体 (6C5)	Ambion	AM4300	Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab ソフトウェア	Bio-Rad		バンド強度の測定
イミダゾール	Sigma-Aldrich	I2399
リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬	Invitrogen	11668019
モノクローナル抗体 アンチベータ--COP 抗体	Sigma	G6160	マウスモノクローナル抗体 β-COP.
Mycタグ (9B11) マウス mAb	細胞シグナル伝達技術	2276S	mycタグ付きタンパク質を検出するためのマウスモノクローナル抗体。
OmniPur EDTA、二ナトリウム塩、二水和物	Calbiochem	4010-OP
Optima L-100 XP	Beckman Coulter	392050
Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Gibco	31985070
PBS Tablets	Gibco	18912014
PhosSTOP	Roche
RAB11A特異的ポリクローナル抗体	Proteintech	20229-1-AP	Rab11を検出するためのウサギポリクローナル抗体。
スクロー	Affymetrix	AAJ21931A4
SW 41 Tiスイングバケットローター	ックマンコールター	331362
TLA-120.2固定角ローター	ックマンコールター	362046
トリプシンEDTA(0.05%)、フェノールレッド	Gibco	25300062